乳腺癌微環(huán)境中浸潤(rùn)中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的比值對(duì)預(yù)后的意義

程嵐卿，汪樹(shù)靜，盛有璟，江冬瑞，吳 強(qiáng),

乳腺癌是女性癌癥死亡的主要原因之一[1]。盡管其治療水平不斷改善，但仍有約20%的患者出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[2]，至今無(wú)可靠預(yù)后指標(biāo)。因此，尋求特異性、可靠性、易獲得性的乳腺癌預(yù)后指標(biāo)尤為重要。外周血中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值(peripheral neutrophil-to-lymphocyte ratio, pNLR)與多種惡性腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)[3]。但其數(shù)值極易受炎癥、神經(jīng)內(nèi)分泌壓力等非腫瘤因素的影響[4]，因此，將pNLR作為預(yù)測(cè)乳腺癌患者預(yù)后的指標(biāo)尚存在缺陷和爭(zhēng)議。

宿主抗腫瘤免疫反應(yīng)主要是由局部免疫細(xì)胞驅(qū)動(dòng)，腫瘤原位浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞含量相對(duì)穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)對(duì)乳腺癌組織中CD66b+腫瘤浸潤(rùn)中性粒細(xì)胞(tumor infiltrating neutrophils, TINs)和CD8+腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes, TILs)進(jìn)行觀察，分析兩者及其比值(tumor infiltrating neutrophil-to-lymphocyte ratio, iNLR)在乳腺癌中的預(yù)后價(jià)值及臨床病理意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2016～2018年安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院存檔的改良根治術(shù)切除并經(jīng)病理檢查確診為非特殊型浸潤(rùn)性乳腺癌組織112例，患者均為女性，年齡29～69歲，中位年齡50歲。所有患者術(shù)前均未行新輔助化療且診斷標(biāo)準(zhǔn)依照WHO(2019)乳腺腫瘤指南及第八版AJCC TNM分期。通過(guò)電話及查閱診療記錄進(jìn)行隨訪，將手術(shù)時(shí)間作為隨訪起始時(shí)間，隨訪截至2021年1月。無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival, PFS)定義為手術(shù)至患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或隨訪截止時(shí)間。

1.2 試劑鼠抗人CD66b單克隆抗體(G10F5，BD Pharmingen公司，濃度0.5 mg/mL，稀釋比1 ∶75)；即用型兔抗人CD8單克隆抗體(SP16，福州邁新公司)；雙染檢測(cè)試劑盒(DS-003，抗小鼠IgG/HRP+抗兔IgG/AP)及GVA封片劑均購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.3 雙重免疫組化所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，行免疫組化染色。免疫組化采用EnVison兩步法雙重染色，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。簡(jiǎn)要步驟為切片脫蠟至水，抗原修復(fù)后滴加過(guò)氧化物酶阻斷劑，混合一抗4 ℃孵育過(guò)夜，混合二抗室溫孵育30 min，DAB及Fast-Red分別進(jìn)行顯色，蘇木精復(fù)染，快速脫水、透明、封固，鏡下觀察。

1.4 結(jié)果判讀CD66b陽(yáng)性染色為細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜呈棕黃色[5]。CD8陽(yáng)性染色為細(xì)胞膜呈玫紅色。分別計(jì)數(shù)10個(gè)高倍鏡視野乳腺癌癌巢中浸潤(rùn)的CD66b+TINs和CD8+TILs，排除壞死組織、血管中染色陽(yáng)性細(xì)胞及非特異性染色。以112例CD66b+TINs和CD8+TILs密度的中位數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)，將浸潤(rùn)免疫細(xì)胞分為高密度組和低密度組。所有結(jié)果均由兩位病理科醫(yī)師獨(dú)立判讀。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Graphpad(Prism 8.0)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行樣本率之間的比較，Kaplan-Meier檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析，ROC曲線分析預(yù)測(cè)價(jià)值，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行單因素和多因素生存分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌中CD66b+TINs和CD8+TILs浸潤(rùn)情況在乳腺癌癌巢中可見(jiàn)CD66b+TINs和CD8+TILs浸潤(rùn)，CD66b+TINs的浸潤(rùn)密度為0～286個(gè)/10 HPF，中位密度為6個(gè)/10 HPF；CD8+TILs的浸潤(rùn)密度為2～456個(gè)/10 HPF，中位密度為56個(gè)/10 HPF。計(jì)算得出，iNLR的數(shù)值為0～48.50，中位數(shù)為0.12(圖1)。

ABCD

2.2 CD66b+TINs密度、CD8+TILs密度和iNLR對(duì)乳腺癌患者PFS的預(yù)測(cè)價(jià)值分析Kaplan-Meier生存分析顯示，高密度CD66b+TINs和iNLR與患者PFS均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05，圖2)，高密度CD8+TILs與患者PFS呈正相關(guān)(P<0.05，圖2)。ROC曲線分析結(jié)果顯示，CD66b+TINs、CD8+TILs及iNLR對(duì)乳腺癌患者PFS預(yù)測(cè)的ROC曲線下面積值分別為0.717、0.730和0.786(P<0.05，圖3)。

圖2 乳腺癌中CD66b+TINs密度、CD8+TILs密度及iNLR與患者預(yù)后的關(guān)系：A．CD66b+TINs密度與患者PFS的關(guān)系；B．CD8+TILs密度與患者PFS的關(guān)系；C．iNLR與患者PFS的關(guān)系

圖3 預(yù)測(cè)乳腺癌PFS的ROC曲線：A.CD66b+TINs密度的ROC曲線；B.CD8+TILs密度的ROC曲線；C.iNLR的ROC曲線

2.3 iNLR、CD66b+TINs密度、CD8+TILs密度與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性iNLR與組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ki-67增殖指數(shù)呈正相關(guān)(P<0.05)，與ER、PR表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05，表1)。CD66b+TINs密度與組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)(P<0.05，表1)。CD8+TILs密度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05，表1)。

表1 乳腺癌中iNLR、CD66b+TINs密度及CD8+TILs密度與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 生存分析Cox單因素分析發(fā)現(xiàn)，高iNLR和低密度CD8+TILs與乳腺癌患者PFS相關(guān)(P<0.05，表2)。將單因素分析有關(guān)指標(biāo)納入多因素分析，結(jié)果顯示，iNLR是影響乳腺癌患者PFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(HR=2.446，P<0.05，表2)。

表2 乳腺癌患者PFS的Cox單因素和多因素分析

2.5 CD66b+TINs密度和iNLR與乳腺癌分子分型的相關(guān)性乳腺癌的四種分子分型中，iNLR占比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，三陰型乳腺癌(78.3%)中高iNLR病例明顯多于非三陰型乳腺癌(42.7%)(P<0.05，表3)。CD66b+TINs密度與乳腺癌分子分型無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05，表3)。

表3 iNLR和CD66b+TINs密度與乳腺癌分子分型之間的相關(guān)性

3 討論

腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)由腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞組成，近年來(lái)在癌癥進(jìn)展中的作用逐漸受到重視。乳腺癌TME中存在豐富的免疫細(xì)胞，它們是腫瘤進(jìn)展和免疫治療反應(yīng)的關(guān)鍵參與者[6-7]。中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞是血液循環(huán)白細(xì)胞的主要成分和TME中免疫細(xì)胞的主要來(lái)源，在機(jī)體全身免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，影響腫瘤的進(jìn)展[8-9]。研究報(bào)道兩者的比值可以預(yù)測(cè)患者的預(yù)后，但多集中于外周血中的免疫細(xì)胞比值，即pNLR。pNLR是代表腫瘤炎癥反應(yīng)的指標(biāo)，在一定程度上可代表腫瘤負(fù)荷[10]，Guo等[11]分析了pNLR對(duì)乳腺癌患者的預(yù)后意義，發(fā)現(xiàn)pNLR是乳腺癌總生存率的預(yù)測(cè)指標(biāo)。而另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)老年乳腺癌患者中的pNLR與總生存期和PFS無(wú)相關(guān)性[12]。這些研究提示pNLR對(duì)乳腺癌的預(yù)后價(jià)值尚存在爭(zhēng)議。

免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤進(jìn)展的影響主要在腫瘤微環(huán)境中實(shí)現(xiàn)，即浸潤(rùn)腫瘤組織內(nèi)的免疫細(xì)胞。TME中的各種免疫細(xì)胞發(fā)揮的作用不同，且相互作用過(guò)程復(fù)雜，因此，探索腫瘤組織中的iNLR可以更直接的反應(yīng)局部腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞的相互作用。Ilie等[13]評(píng)估了非小細(xì)胞肺癌的iNLR對(duì)預(yù)后影響，發(fā)現(xiàn)其是高復(fù)發(fā)率和低生存率的獨(dú)立預(yù)后因素。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，iNLR升高與肝細(xì)胞癌切除術(shù)后無(wú)瘤生存期和總生存期降低顯著相關(guān)[14]。但乳腺癌iNLR對(duì)預(yù)后的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用雙重免疫組化法檢測(cè)乳腺癌組織中浸潤(rùn)的CD66b+TINs、CD8+TILs，分析了iNLR的預(yù)后價(jià)值。結(jié)果顯示，iNLR與乳腺癌患者的PFS呈負(fù)相關(guān)，ROC曲線顯示iNLR預(yù)測(cè)預(yù)后的準(zhǔn)確性為0.786，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，iNLR與組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ki-67增殖指數(shù)呈正相關(guān)，Cox分析發(fā)現(xiàn)iNLR是乳腺癌PFS的獨(dú)立預(yù)后因子。

本實(shí)驗(yàn)分析了CD66b+TINs和CD8+TILs與乳腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性。越來(lái)越多的證據(jù)表明，中性粒細(xì)胞在癌癥的反應(yīng)中起著重要的作用。在胃癌中，中性粒細(xì)胞激活并表達(dá)PD-L1，與胃癌預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[15]。在小鼠乳腺癌模型中，CD66b+TINs及M2型巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶9高表達(dá)[16]，可加速腫瘤的惡性進(jìn)程[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高密度CD66b+TINs與乳腺癌PFS呈負(fù)相關(guān)，與組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)。CD8+TILs是抗腫瘤免疫效應(yīng)機(jī)制之一，具有殺傷腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)病原體等細(xì)胞毒性能力，在誘導(dǎo)機(jī)體抗腫瘤反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[18]。Mahmoud等[19]分析1 334例乳腺癌中CD8+TILs的臨床意義，發(fā)現(xiàn)CD8+TILs與總生存期呈正相關(guān)。與之前研究結(jié)果一致，我們發(fā)現(xiàn)CD8+TILs密度較低的患者，預(yù)后較差。隨后，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，iNLR的曲線下面積值為0.786，而CD66b+TINs和CD8+TILs的曲線下面積值分別為0.717和0.730，表明iNLR預(yù)測(cè)乳腺癌預(yù)后的準(zhǔn)確性更高，能夠更好的預(yù)測(cè)乳腺癌患者預(yù)后并指導(dǎo)臨床治療。

國(guó)際免疫腫瘤生物標(biāo)志物工作組的研究發(fā)現(xiàn)，浸潤(rùn)到腫瘤實(shí)質(zhì)的免疫細(xì)胞在HE染色觀察中易被忽略[20]。與免疫組化單染相比，免疫組化雙染對(duì)觀察兩種類型蛋白質(zhì)的表達(dá)更具有優(yōu)勢(shì)并且可廣泛應(yīng)用于臨床研究，表明使用免疫組化雙重染色評(píng)估iNLR預(yù)測(cè)乳腺癌進(jìn)展可以更容易地應(yīng)用于臨床實(shí)踐。

綜上所述，iNLR是影響乳腺癌患者PFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其預(yù)測(cè)乳腺癌預(yù)后的準(zhǔn)確性優(yōu)于單獨(dú)計(jì)數(shù)CD66b+TINs或CD8+TILs。iNLR是一種新穎的、可靠的臨床應(yīng)用指標(biāo)，可作為臨床評(píng)估乳腺癌患者預(yù)后的潛在預(yù)測(cè)指標(biāo)。