子宮頸癌患者血清中miR-101的表達(dá)及其通過(guò)Rac1調(diào)控子宮頸癌細(xì)胞絲狀偽足的形成

木葉斯?fàn)枴べI(mǎi)買(mǎi)提，聶 磊，徐夢(mèng)偉，呂單單，王偉旭，吳姝言，林 晨

子宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是其預(yù)后不良的主要原因[1]。miRNAs屬于短鏈非編碼RNA，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖、存活、代謝及腫瘤轉(zhuǎn)移等生理病理過(guò)程[2]。細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的異常在腫瘤轉(zhuǎn)移中扮演不可或缺的角色[3]。有研究表明，miR-124-5p[4]、miR-551b-5p[5]等通過(guò)抑制mRNA翻譯或促進(jìn)其降解來(lái)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平[6]，進(jìn)而使細(xì)胞骨架重排[7]，最終引起癌癥的轉(zhuǎn)移[8]。本組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-101在子宮頸癌細(xì)胞和組織中表達(dá)下調(diào)，其促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞的侵襲及遷移，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)Rac1是miR-101的可能靶基因。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)子宮頸癌患者血清中miR-101的表達(dá)，分析其與臨床病理特征的關(guān)系，明確血清中miR-101表達(dá)的臨床意義，進(jìn)一步探究miR-101通過(guò)調(diào)控靶基因Rac1在子宮頸癌細(xì)胞絲狀偽足形成中的作用機(jī)制，為miRNAs在腫瘤治療及預(yù)后評(píng)估中的作用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本收集2020年4～12月新疆醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院存檔的18例子宮頸癌患者和20例健康體檢者血清。所有患者術(shù)前均未行放、化療和靶向治療等，術(shù)后病理確診為子宮頸鱗狀細(xì)胞癌。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 子宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染用含10%胎牛血清的中糖培養(yǎng)基培養(yǎng)人子宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞SiHa(武漢普諾賽公司)，置于37 ℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按常規(guī)方法進(jìn)行傳代及凍存。細(xì)胞懸浮液接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合度時(shí)，按質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑Lipo8000(上海碧云天公司)及基因片段(美國(guó)Proteintech)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為三組，即NC mimic組、miR-101 mimic組、miR-101 mimic+Rac1組。

1.3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)Rac1是miR-101的可能靶基因。構(gòu)建h-Rac1-WT、h-Rac1-MUT 3′UTR雙報(bào)告基因載體及has-miR-101-3p mimic和Non-target Control。培養(yǎng)SiHa細(xì)胞，分別加入兩種靶基因3′UTR雙報(bào)告基因載體和0.1 μL Lipo8000試劑，用5 μL完全培養(yǎng)基稀釋0.225 μL Lipo8000試劑的混合溶劑，再用hsa-miR-101-3p mimic和Non-target Control分別轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后采用Dual-Luciferase Reporter Assay System檢測(cè)Firefly Luciferase報(bào)告基因的表達(dá)水平。

1.4 qRT-PCR按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將cDNA樣本置于-80 ℃冰箱，以備后續(xù)擴(kuò)增使用。分別以cel-miR39、U6和GAPDH作為內(nèi)參，引物的設(shè)計(jì)與合成均由上海生工生物公司完成。采用2-ΔΔCt法分析miR-101、Rac1基因表達(dá)情況，引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR檢測(cè)基因的引物序列

1.5 Western blot法細(xì)胞生長(zhǎng)至90%后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取蛋白及定量。煮沸所需蛋白，并通過(guò)SDS-PAGE分離。電泳(80 V 30 min，110 V 50 min)，電轉(zhuǎn)(110 V 1 h)后，室溫封閉1.5 h。4 ℃孵育一抗過(guò)夜(Rac1稀釋比1 ∶1 000～1 ∶1 500；GAPDH稀釋比1 ∶5 000，美國(guó)Abcam公司)。二抗孵育1 h(Rac1稀釋比1 ∶5 000；GAPDH稀釋比1 ∶8 000，美國(guó)Abcam公司)，使用成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶灰度值。

1.6 免疫熒光采用玻璃底四孔皿培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁，并生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，PBS浸泡3次，每次5 min。使用4%多聚甲醛固定20 min。山羊血清封閉30 min，PBS浸泡3次。滴加一抗(Rac1稀釋比1 ∶200)，每孔200 μL，4 ℃孵育過(guò)夜。PBS浸泡，添加熒光二抗(Alexaflour549稀釋比1 ∶500)，室溫封閉2 h。PBS浸泡，用DAPI原液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，隨后PBS浸泡。使用免疫熒光共焦激光掃描顯微鏡(日本Nikon公司)觀察和記錄。鬼筆環(huán)肽定量F-actin實(shí)驗(yàn)中配置好的TRITC Phalloidin羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽工作液在山羊血清封閉后便可添加，后進(jìn)行核染色。

1.7 掃描電鏡細(xì)胞接種于30 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后用PBS緩沖液沖洗，加入多聚甲醛固定20 min，PBS緩沖液沖洗，梯度乙醇脫水，干燥，將處理好的樣品放于真空鍍膜機(jī)內(nèi)，將金噴鍍到樣品表面后，取出樣品在掃描電鏡下觀察絲狀偽足(細(xì)胞表面生出無(wú)定形的絲狀突起)形成情況，選取9個(gè)高倍鏡視野，手動(dòng)記數(shù)每高倍鏡下1個(gè)完整細(xì)胞的絲狀偽足數(shù)并取平均數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 子宮頸癌患者血清中miR-101的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系與健康體檢者(1.00±0.13)相比，子宮頸癌患者血清中miR-101的表達(dá)水平明顯降低(0.40±0.05)(P<0.01，圖1)，且與子宮頸癌分化程度呈負(fù)相關(guān)(Z=2.974，P=0.003)，與患者年齡、腫瘤直徑、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤(rùn)和神經(jīng)浸潤(rùn)均無(wú)關(guān)(P>0.05，表2)。

表2 miR-101表達(dá)與子宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系[中值(p25，p75)]

圖1 子宮頸癌患者和健康體檢者血清中miR-101的表達(dá)

2.2 子宮頸癌細(xì)胞中miR-101的表達(dá)NC mimic組與對(duì)照組子宮頸癌SiHa細(xì)胞相比，miR-101表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組(0.93±0.03)和NC mimic組(1.01±0.04)SiHa細(xì)胞相比，miR-101 mimic組(7.13±0.22)miR-101表達(dá)量明顯升高(P<0.01，圖2)。

圖2 三組子宮頸癌SiHa細(xì)胞中miR-101的表達(dá)

2.3 miR-101對(duì)Rac1的靶向作用驗(yàn)證

2.3.1雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) miR-101與Rac1-3′UTR有結(jié)合作用，與NC mimic組相比，轉(zhuǎn)染hsa-miR-101-3p后，h-Rac1-MUT的報(bào)告熒光表達(dá)(0.65±0.05)較h-Rac1-WT的報(bào)告熒光表達(dá)(0.49±0.05)明顯升高(P<0.05，圖3)，即Rac1是miR-101的靶基因。

圖3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-101與Rac1的靶向關(guān)系

2.3.2miR-101對(duì)Rac1的調(diào)控作用 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：miR-101 mimic組子宮頸癌細(xì)胞中Rac1蛋白表達(dá)量(0.22±0.03)與NC mimic組(1.00±0.17)相比明顯降低(P<0.05，圖4A、B)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：與NC mimic組(1.00±0.02)相比，miR-101 mimic組(0.40±0.01)子宮頸癌細(xì)胞miR-101表達(dá)明顯降低(P<0.01，圖4C)。免疫熒光法檢測(cè)顯示：子宮頸癌細(xì)胞中Rac1蛋白呈紅色熒光，且定位于細(xì)胞膜，與NC mimic組相比，miR-101 mimic組子宮頸癌細(xì)胞Rac1蛋白表達(dá)降低(圖4D)。

圖4 miR-101對(duì)Rac1的調(diào)控作用：A.上調(diào)miR-101表達(dá)后Rac1蛋白表達(dá)量降低；B.Western blot法檢測(cè)結(jié)果；C.上調(diào)miR-101表達(dá)后Rac1 mRNA表達(dá)量降低；D.上調(diào)miR-101表達(dá)后Rac1在細(xì)胞膜上的表達(dá)減弱

2.4 高表達(dá)Rac1對(duì)miR-101調(diào)控的子宮頸癌細(xì)胞絲狀偽足形成的影響掃描電鏡結(jié)果顯示，子宮頸癌細(xì)胞中NC mimic組、miR-101 mimic組、miR-101 mimic+Rac1組的絲狀偽足數(shù)分別為(70±3)、(39±10)、(57±9)個(gè)，與NC mimic組相比，miR-101 mimic組和miR-101 mimic+Rac1組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與miR-101 mimic組相比，miR-101 mimic+Rac1組子宮頸癌細(xì)胞絲狀偽足數(shù)增多(P<0.01，圖5A)。免疫熒光顯示，相同激發(fā)光強(qiáng)度下，與NC mimic組相比，miR-101 mimic組子宮頸癌細(xì)胞F-actin表達(dá)含量較低，而miR-101 mimic+Rac1組子宮頸癌細(xì)胞F-actin表達(dá)含量明顯升高(圖5B)。

圖5 高表達(dá)Rac1對(duì)miR-101調(diào)控的子宮頸癌細(xì)胞絲狀偽足形成的影響：A.上調(diào)Rac1表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)miR-101對(duì)子宮頸癌細(xì)胞絲狀偽足形成的抑制；B.上調(diào)Rac1的表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)miR-101對(duì)F-actin蛋白的抑制

3 討論

大部分子宮頸癌患者可通過(guò)篩查獲得有效預(yù)防[9]。轉(zhuǎn)移是子宮頸癌患者死亡的主要原因，然而目前尚無(wú)更好的手段來(lái)預(yù)防或控制轉(zhuǎn)移[10]。腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移與細(xì)胞骨架蛋白重排密切相關(guān)。有研究表明miRNAs可通過(guò)靶向調(diào)控細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步影響下游信號(hào)通路蛋白的表達(dá)，從而造成癌細(xì)胞遷移、侵襲等[11]。有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-92a通過(guò)直接靶向PIK3R1促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[12]。miR-106b-5p通過(guò)靶向CNN1和調(diào)控Rho/ROCK1通路促進(jìn)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移[13]。因此，深入探索miRNAs調(diào)控細(xì)胞骨架影響腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，對(duì)于尋找早期子宮頸癌分子靶標(biāo)從而阻止其轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。

循環(huán)miRNAs在血液中可穩(wěn)定檢測(cè)，被認(rèn)為是癌癥篩查的理想生物學(xué)標(biāo)志物，其中miR-101具有腫瘤抑制特性，在結(jié)直腸癌[14]、胃癌[15]和肺癌[16]患者血清中表達(dá)下調(diào)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，子宮頸癌患者血清中miR-101表達(dá)下調(diào)，其與子宮頸癌分化程度密切相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。提示檢測(cè)血清miR-101含量可以進(jìn)一步評(píng)估子宮頸癌惡性程度，協(xié)助判斷子宮頸癌患者預(yù)后。

miRNA可通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因的蛋白表達(dá)水平參與腫瘤的發(fā)展過(guò)程[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-139通過(guò)下調(diào)Rho激酶的表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。Wang等[19]報(bào)道，在甲狀腺癌細(xì)胞中高表達(dá)miR-101可抑制Rac1蛋白的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，子宮頸癌細(xì)胞中miR-101表達(dá)降低，上調(diào)miR-101表達(dá)后Rac1在轉(zhuǎn)錄后水平通過(guò)3′UTR內(nèi)的特定靶點(diǎn)受到miR-101的負(fù)調(diào)控，且高表達(dá)miR-101抑制Rac1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。

Rac1是小GTPase的一份子，參與多種動(dòng)態(tài)細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、侵襲、細(xì)胞間接觸等，是肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重塑的調(diào)控復(fù)合體[20]。細(xì)胞骨架在維持細(xì)胞形態(tài)有序性方面起重要作用，主要包括微管、微絲和中間纖維，由F-actin構(gòu)成的微絲能控制細(xì)胞遷移能力[21]。Rac1及其下游效應(yīng)物的激活與乳腺癌、卵巢癌、肺癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌和食管癌等腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)NPs介導(dǎo)的miR-34a上調(diào)后Rac1表達(dá)降低，隨后肌動(dòng)蛋白解聚，破壞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，導(dǎo)致細(xì)胞表面的板狀偽足和絲狀偽足形成顯著減少，延緩細(xì)胞遷移[22]。本組掃描電鏡結(jié)果顯示，miR-101過(guò)表達(dá)后子宮頸癌細(xì)胞絲狀偽足數(shù)明顯減少，上調(diào)Rac1表達(dá)則絲狀偽足數(shù)增多。羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，上調(diào)Rac1表達(dá)時(shí)子宮頸癌細(xì)胞F-actin蛋白的表達(dá)明顯升高，提示miR-101通過(guò)Rac1抑制子宮頸癌細(xì)胞絲狀偽足形成，從而抑制子宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-101在子宮頸癌患者血清中低表達(dá)，并與子宮頸癌分化程度有關(guān)，提示miR-101可能成為判斷子宮頸癌分化程度的分子指標(biāo)。miR-101通過(guò)靶向下調(diào)Rac1表達(dá)抑制子宮頸癌細(xì)胞絲狀偽足形成，從而抑制子宮頸癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移，為子宮頸癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究提供了新思路。