RACK1通過調(diào)控脂質(zhì)合成促進子宮頸癌ME180細胞侵襲、遷移及增殖

徐麗秀，李金秋，哈提拉·吐爾遜，阿仙姑·哈斯木

子宮頸癌作為新疆地區(qū)高發(fā)腫瘤，嚴重影響該地區(qū)女性的生活質(zhì)量。晚期子宮頸癌細胞侵襲能力增強及淋巴結轉(zhuǎn)移的發(fā)生，給子宮頸癌的治療帶來巨大挑戰(zhàn)[1]。因此，尋找子宮頸癌早期診斷的特異性指標或有效的治療靶點，形成子宮頸癌早期診斷及治療的有效策略是亟待解決的問題。有研究報道，不同階段的腫瘤細胞需要改變它們的代謝嗜好來適應自身所處環(huán)境的能量短缺[2]。其中，腫瘤細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積現(xiàn)象常常存在于惡性程度較高的腫瘤類型[3]。本組前期實驗發(fā)現(xiàn)，子宮頸癌細胞中脂滴的蓄積明顯提高子宮頸癌細胞C33a和SiHa的侵襲、遷移能力[4]。

活化C激酶受體1(receptor for activated C kinase, RACK1)在包括子宮頸癌在內(nèi)的實體腫瘤的增殖和生長中起重要作用。RACK1已被作為多種腫瘤的生物標志物[5]，RACK1與OXER1結合增強PI3K/Akt信號活化，促進乳腺癌的惡性進展[6]。然而，RACK1在子宮頸癌脂質(zhì)代謝中的作用機制仍未明確，RACK1是否通過參與脂質(zhì)代謝來影響子宮頸癌細胞的侵襲、遷移等生物學行為尚未見文獻報道。本實驗以子宮頸癌ME180細胞為研究對象，明確RACK1對脂質(zhì)代謝的調(diào)控作用以及對子宮頸癌細胞的惡性生物學行為的影響，為提高對子宮頸癌惡性進展過程中脂質(zhì)代謝改變的認識水平提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院存檔的25例子宮頸癌手術切除標本及25例癌旁正常子宮頸上皮組織(距癌組織>3 cm)，將組織置于-80 ℃冰箱保存用于qRT-PCR實驗。本實驗經(jīng)新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均知情同意。

1.2 試劑BODIPY試劑購自美國羅氏公司；慢病毒由上海吉凱公司負責構建；FASN兔抗人一抗購自美國Abcam公司；ACC1和β-actin兔抗人一抗購自武漢三鷹公司；油酸(OA)購自美國MCE公司；Coy’5A培養(yǎng)基購自武漢普諾賽公司。ME180細胞購自武漢普諾賽公司，SiHa和H8細胞由新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院臨床研究院提供并保存。

1.3 方法

1.3.1細胞培養(yǎng) 培養(yǎng)ME180細胞的Coy’5A培養(yǎng)基及培養(yǎng)H8與SiHa細胞的DMEM培養(yǎng)基中均添加10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素。

1.3.2qRT-PCR 使用Trizol法從組織和細胞樣本中提取總RNA，隨后利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg總RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR Green PCR Kit對cDNA進行qRT-PCR擴增分析。以β-actin為內(nèi)參基因進行歸一化處理后得到對應基因的相對表達量。本實驗中使用的PCR引物序列詳見表1。

1.3.3慢病毒轉(zhuǎn)染及分組 sh-RACK1慢病毒及其對照慢病毒(sh-NON)由上海吉凱基因負責構建。

按照吉凱公司提供的慢病毒轉(zhuǎn)染手冊進行轉(zhuǎn)染實驗，轉(zhuǎn)染72 h后，用5 μg/mL嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染成功的子宮頸癌ME180細胞，作用時長為1周。將篩選存活下來的ME180細胞使用2.5 μg/mL嘌呤霉素繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.4Western blot法 細胞于細胞裂解和蛋白酶抑制劑混合物中裂解30 min，將得到的蛋白上清進行定量后樣品使用8%SDS-PAGE凝膠進行電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。PVDF膜經(jīng)5%脫脂牛奶封閉后進行一抗孵育，所用抗體有FASN(稀釋比1 ∶5 000)、ACC1(稀釋比1 ∶10 000)、β-actin(稀釋比1 ∶8 000)。隨后與辣根過氧化物標記山羊抗兔二抗(稀釋比1 ∶10 000)避光孵育，并通過化學發(fā)光儀顯影。

1.3.5Transwell實驗 Transwell遷移測定：將5×104細胞接種于不含Matrigel的上室內(nèi)；Transwell侵襲測定：上室加入60 μL的200 mg/mL Matrigel，孵育箱中凝固2 h，隨后向室中加入5×104個細胞，24 h后取出24孔板，使用4%多聚甲醛溶液固定細胞10 min，PBS沖洗細胞3次，于1%結晶紫工作液中室溫孵育10 min后用PBS清洗，倒置顯微鏡下觀察下室底面細胞數(shù)。

1.3.6平板克隆 使用6孔板進行克隆形成實驗。將ME180細胞以每孔5×103個細胞進行培養(yǎng)，培養(yǎng)7～10天觀察集落大小及數(shù)量。

1.3.7CCK-8 OA使用文獻[7]報道的方法進行溶解儲存。ME180細胞以每孔1×103個細胞的密度接種于96孔板中，并暴露于OA中24 h后，使用CCK-8試驗盒檢測OA作用24 h的細胞增殖情況。

1.3.8檸檬酸和脂肪酸含量檢測 ME180細胞以每毫升1×106個細胞的密度，合計1 mL接種于6 cm培養(yǎng)皿，待細胞貼壁后更換為不含10%胎牛血清的Coy’5A培養(yǎng)基于孵育箱中培養(yǎng)24 h。收集ME180細胞的上清液，利用對應檢測試劑盒指導說明檢測上清液中檸檬酸和脂肪酸含量。

1.3.9BODIPY染色 去除細胞培養(yǎng)基，使用PBS清洗ME180細胞，用4%多聚甲醛溶液固定細胞10 min后PBS沖洗細胞3次。于BODIPY試劑中避光孵育30 min，用PBS清洗后DAPI避光孵育10 min，PBS清洗10 min后于激光共聚焦顯微鏡下拍照。

1.3.10電鏡觀察脂滴含量 取1×106個細胞給予沉淀，加入2.5%戊二醛4 ℃過夜，用PBS漂洗10 min×3次；1%四氧化鋨固定1.5 h，PBS漂洗后經(jīng)不同梯度乙醇(50%、70%、80%、90%、100%)進行脫水處理；分別浸泡于50%丙酮1 h，75%丙酮3 h，100%丙酮24 h后進行切片，于電鏡下觀察脂滴含量。

2 結果

2.1 子宮頸癌組織中RACK1的表達qRT-PCR檢測結果顯示，子宮頸癌組織中RACK1 mRNA的表達(2.38±1.78)顯著高于癌旁正常子宮頸組織(0.43±0.47)(P<0.001，圖1A)。利用qRT-PCR和Western blot法分別從轉(zhuǎn)錄及蛋白水平驗證RACK1在子宮頸癌細胞(ME180、SiHa細胞)和正常子宮頸上皮細胞(H8細胞)中的表達情況。結果顯示RACK1 mRNA在子宮頸癌細胞中高表達，且在ME180細胞中表達最高(ME180vsSiHavsH8為1.67±0.05vs1.39±0.08vs1.00±0.03,P<0.001，圖1B)。蛋白表達結果與轉(zhuǎn)錄水平結果一致(ME180vsSiHavsH8為1.58±0.08vs1.32±0.08vs0.41±0.08，P<0.001，圖1C)。

圖1 A.qRT-PCR檢測子宮頸癌組織和癌旁正常子宮頸組織中RACK1 mRNA表達水平；B.qRT-PCR檢測子宮頸癌細胞和正常子宮頸上皮細胞中RACK1 mRNA表達水平；C.Western blot法檢測子宮頸癌細胞和正常子宮頸上皮細胞中RACK1蛋白表達水平

2.2 RACK1表達與子宮頸癌脂質(zhì)合成的相關性BODIPY染色結果表明，ME180細胞(1.10±0.15)中脂質(zhì)含量最高，與ME180細胞和SiHa細胞(0.36±0.21)相比，H8細胞(0.15±0.01)內(nèi)脂質(zhì)含量最低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2A)；qRT-PCR結果顯示子宮頸癌組織中的脂肪酸合成關鍵因子FASN和ACC1的mRNA表達水平(2.98±1.53、2.41±1.25)顯著高于癌旁正常子宮頸組織(0.85±0.37、0.69±0.28)(P<0.001，圖2B)，進一步分析發(fā)現(xiàn)RACK1 mRNA表達分別與FASN和ACC1 mRNA表達呈正相關(r=0.693，P<0.001；r=0.752，P<0.001，圖2C)。結果提示RACK1表達與子宮頸癌脂質(zhì)合成呈正相關。

圖2 RACK1表達與子宮頸癌脂質(zhì)合成的相關性：A.BODIPY染色檢測子宮頸癌細胞中脂質(zhì)含量；B.qRT-PCR檢測子宮頸癌組織和癌旁正常子宮頸組織中FASN和ACC1 mRNA表達水平；C.RACK1 mRNA和FASN、ACC1 mRNA表達的相關性分析

2.3 RACK1對子宮頸癌脂質(zhì)合成能力的影響qRT-PCR結果顯示，shRACK1-ME180組細胞中FASN(0.27±0.02)和ACC1(0.24±0.03)的mRNA表達顯著低于shNON-ME180組(1.00±0.01、1.00±0.01)(P均<0.001，圖3A)。Western blot結果顯示shRACK1-ME180組細胞中FASN(0.32±0.03)和ACC1(0.17±0.03)的蛋白表達低于shNON-ME180組(1.77±0.09、1.80±0.08)(P均<0.001，圖3A)。BODIPY染色結果表明，與shNON-ME180組(1.09±0.16)相比，shRACK1-ME180組(0.62±0.09)細胞內(nèi)FITC-綠色熒光信號顯著減弱，表明細胞內(nèi)脂滴含量減少(P<0.05，圖3B)；電鏡下觀察結果與BODIPY染色結果一致(圖3C)。shRACK1-ME180組細胞內(nèi)檸檬酸(3.46±0.77)、脂肪酸(0.94±0.07)含量較shNON-ME180組的檸檬酸(5.89±0.47)、脂肪酸(2.13±0.27)含量顯著下降(P<0.001，圖3D)。結果提示下調(diào)RACK1表達可降低子宮頸癌細胞中脂質(zhì)合成原料的含量，抑制脂肪酸合成關鍵酶表達進而抑制細胞內(nèi)脂質(zhì)的蓄積。

圖3 shRACK1對ME180細胞脂質(zhì)合成能力的影響：A.qRT-PCR和Western blot法檢測下調(diào)RACK1表達后FASN、ACC1 mRNA和蛋白水平的改變；B.BODIPY染色檢測下調(diào)RACK1表達后細胞內(nèi)脂質(zhì)含量的變化；C.電鏡下觀察下調(diào)RACK1表達后細胞內(nèi)脂滴含量的改變；D.下調(diào)RACK1表達后細胞內(nèi)檸檬酸、脂肪酸含量的改變

2.4 下調(diào)RACK1表達對ME180細胞侵襲、遷移、增殖能力的影響Transwell實驗結果顯示，shRACK1-ME180組細胞侵襲和遷移能力顯著低于shNON-ME180組細胞(圖4A)。平板克隆實驗結果表明，相較于shNON-ME180組，shRACK1-ME180組細胞克隆數(shù)量形成明顯減少(圖4B)。結果表明，下調(diào)RACK1表達能夠減弱ME180細胞的侵襲、遷移、增殖能力。

圖4 shRACK1對ME180細胞惡性生物學行為的影響：A.Transwell侵襲實驗和遷移實驗檢測下調(diào)RACK1表達后細胞侵襲和遷移能力的改變；B.細胞平板克隆實驗檢測下調(diào)RACK1表達后細胞增殖能力的改變

2.5 外源性脂肪酸對shRACK1-ME180細胞侵襲、遷移、增殖能力的影響CCK-8結果顯示，不同濃度(0、50、100、200、400 μmol/L)OA作用于shRACK1-ME180細胞24 h，從100 μmol/L OA起能夠逆轉(zhuǎn)shRACK1-ME180細胞增殖能力的抑制(圖5)。Transwell實驗結果顯示，添加100 μmol/L OA后，shRACK1-ME180組細胞侵襲與遷移水平恢復至與shNON-ME180組相近(圖6A)。平板克隆實驗結果表明，相較于shRACK1-ME180組，添加OA促進shRACK1-ME180組細胞克隆形成數(shù)量明顯增加(圖6B)。結果表明，外源性脂肪酸的補充能夠恢復因RACK1下調(diào)所抑制的ME180細胞侵襲、遷移、增殖能力。

圖5 CCK-8實驗檢測OA對ME180細胞增殖能力的影響

圖6 OA對shRACK1-ME180細胞惡性生物學行為的影響：A.侵襲實驗和侵襲實驗檢測OA對下調(diào)RACK1表達后細胞侵襲、遷移能力的改變；B.細胞平板克隆檢測OA對下調(diào)RACK1表達后細胞增殖能力的改變

3 討論

腫瘤細胞中脂質(zhì)代謝異常是腫瘤惡性生物學特征之一[8]，腫瘤惡性演進過程中常伴有脂質(zhì)合成增加，以中晚期階段尤為突出[9]。BODIPY染色發(fā)現(xiàn)具有轉(zhuǎn)移特性子宮頸癌ME180細胞內(nèi)脂滴含量顯著高于SiHa細胞，以上結果提示ME180細胞中脂質(zhì)蓄積增加可能與ME180細胞的轉(zhuǎn)移特性有關，由此推測子宮頸癌細胞的惡性進展過程伴隨著代謝形式的改變。為探討RACK1表達是否通過改變細胞內(nèi)脂質(zhì)含量進而影響子宮頸癌惡性進展，加入正常子宮頸上皮H8細胞驗證以上3株細胞中RACK1表達水平，進一步探討RACK1與細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積是否相關。結果顯示具有轉(zhuǎn)移特性子宮頸癌ME180細胞中RACK1表達最高，其次為SiHa細胞，H8細胞表達最低，BODIPY染色結果與細胞內(nèi)RACK1表達顯著相關，提示ME180細胞中脂質(zhì)蓄積增加可能與ME180細胞的轉(zhuǎn)移特性有關，由此推測子宮頸癌細胞的惡性進展過程伴隨著代謝形式的改變，且RACK1可能是調(diào)控這種現(xiàn)象的關鍵致癌因子。因此，本實驗以ME180細胞為研究對象，探索RACK1是否參與子宮頸癌細胞的脂質(zhì)代謝調(diào)控進而影響子宮頸癌細胞的惡性生物學行為。

RACK1作為一種經(jīng)典支架蛋白，通過介導蛋白間相互作用參與細胞中多種活動[5]；研究發(fā)現(xiàn)RACK1在結腸癌和胃癌中作為抑癌基因發(fā)揮作用[10-11]，而在結腸癌、乳腺癌、口腔鱗狀細胞癌等腫瘤中扮演著癌基因的角色[5,12-13]。Wu等[10]發(fā)現(xiàn)RACK1與Galectin-1結合活化下游信號通路促進子宮頸癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的發(fā)生，且提高細胞侵襲能力以及淋巴管生成，導致癌細胞的淋巴結轉(zhuǎn)移。而周小慶等[11]研究發(fā)現(xiàn)子宮頸癌中RACK1表達顯著低于正常子宮頸上皮組織。以上文獻提示RACK1在子宮頸癌中的作用有待進一步探究考證。本實驗發(fā)現(xiàn)RACK1在子宮頸癌組織中顯著過表達；細胞水平進一步驗證發(fā)現(xiàn)與正常子宮頸上皮細胞相比，兩種子宮頸癌細胞中RACK1高表達，特別是在ME180細胞中RACK1表達最高，提示RACK1可能與子宮頸癌細胞惡性進展相關。近期研究發(fā)現(xiàn)RACK1與AMPK上T172磷酸化位點結合，活化AMPK阻止膽固醇通量的細胞外溢，降低泡沫細胞內(nèi)的膽固醇蓄積，減少動脈粥樣硬化的發(fā)生[14]；RACK1可以干擾肝細胞和巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)累積，阻礙疾病的進展[15]。然而RACK1在腫瘤中脂質(zhì)調(diào)節(jié)的研究較少，特別是在子宮頸癌中RACK1與脂質(zhì)代謝的關系尚未可知。本實驗利用臨床樣本發(fā)現(xiàn)，RACK1表達與FASN和ACC1表達呈正相關性，下調(diào)RACK1表達可以顯著抑制子宮頸癌ME180細胞的脂質(zhì)合成關鍵酶FASN和ACC1的轉(zhuǎn)錄水平以及蛋白表達；BODIPY實驗表明抑制RACK1表達使細胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積明顯降低；電鏡結果進一步證實BODIPY實驗結果。

正常細胞內(nèi)脂質(zhì)含量較少且優(yōu)先利用外源性脂肪酸合成脂質(zhì)滿足自身所需，但腫瘤細胞除了利用外源性脂肪酸合成脂類外，還會提高自身脂肪酸合成來滿足細胞快速增殖所需的能量[16-17]。文獻報道胰腺癌細胞依賴于利用脂肪酸從頭合成來維持自身惡性表型，而前列腺癌細胞則更傾向于對外源性脂質(zhì)的攝取[18]。Grunt等[19]發(fā)現(xiàn)，卵巢癌細胞短期內(nèi)受到G28UCM的處理，能夠抑制內(nèi)源性脂肪酸合成，但未影響外源性脂肪酸的攝取能力，然而隨著藥物作用時間的延長，脂肪酸自身合成及攝取能力均顯著降低，腫瘤細胞生長受阻。為進一步明確RACK1對ME180細胞內(nèi)源性和外源性脂質(zhì)的調(diào)控作用，分別對脂肪酸從頭合成能力以及外源性脂肪酸攝取能力進行檢測。文獻報道外源性補充檸檬酸、脂肪酸可以逆轉(zhuǎn)小檗堿對子宮頸癌細胞脂質(zhì)合成的抑制作用，進而恢復子宮頸癌細胞的增殖水平[20]。根據(jù)以上文獻提示，檸檬酸、脂肪酸作為脂質(zhì)合成的重要原料，檢測其含量變化有利于了解RACK1對內(nèi)源性脂質(zhì)合成的影響。本實驗結果顯示，shRACK1-ME180組細胞內(nèi)檸檬酸、脂肪酸含量均不同程度的降低，與shNON-ME180組比較，檸檬酸含量下降約1.7倍、脂肪酸含量下降約2.7倍，以上結果提示RACK1能夠有效抑制脂質(zhì)合成原料的生成，從而抑制脂質(zhì)的從頭合成。隨后實驗進一步探討RACK1下調(diào)后對ME180細胞外源性脂肪酸攝取能力的影響。通過向shRACK1-ME180組細胞培養(yǎng)基中補充100 μmol/L OA(外源性脂肪酸)，觀察ME180細胞侵襲、遷移、增殖能力是否改變。Transwell侵襲及遷移結果顯示，添加OA 24 h時shRACK1-ME180組細胞穿至下室底面的細胞數(shù)均恢復至與shNON-ME180組細胞數(shù)量接近的水平，CCK-8實驗與平板克隆結果表明添加OA的shRACK1-ME180組細胞的增殖能力顯著提高，且與shNON-ME180組細胞克隆數(shù)量相當。提示外源性脂肪酸的添加可以逆轉(zhuǎn)RACK1下調(diào)而抑制的ME180細胞侵襲、遷移、增殖能力，以上結果表明下調(diào)RACK1表達并未抑制ME180細胞攝取外源性脂肪酸的能力。

綜上所述，下調(diào)RACK1表達抑制子宮頸癌細胞的脂質(zhì)合成，進而遏制子宮頸癌細胞的侵襲、遷移、增殖等生物學行為。其中，RACK1下調(diào)主要調(diào)控脂質(zhì)合成原料的生成減少，降低脂質(zhì)從頭合成，但未減弱ME180細胞對外源性脂肪酸的攝取能力。本實驗為子宮頸癌進展與代謝之間的復雜機制提供一定的理論基礎。