基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究黃芩湯對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎及相關(guān)癌癥的保護(hù)作用

張旖晴 魏 瑋 程 遙 蘇曉蘭 王 晨 劉 濤 許愛麗

(中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院脾胃病科，北京，100102)

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)強(qiáng)調(diào)對(duì)信號(hào)通路的多通路調(diào)節(jié)，提高藥物的治療效果，降低毒性和不良反應(yīng)，從而提高新藥臨床試驗(yàn)的成功率，并降低藥物研發(fā)的成本[1]。中藥及其處方具有多成分、多途徑、多目標(biāo)的特點(diǎn)，在疾病的預(yù)防和控制上具有優(yōu)勢(shì)。但是，由于中藥的作用機(jī)制難以量化，其科學(xué)性受到質(zhì)疑[2]。近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已被認(rèn)為是理解化合物配方的一種有效方法[3]。有研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析了血府逐瘀湯和復(fù)方丹參配方，并闡明了該配方中的主要活性成分和治療機(jī)制[4]。因此，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)有望破譯黃芩湯的活性化合物和可能的機(jī)制[5]。

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis，UC)是一種慢性進(jìn)行性免疫學(xué)介導(dǎo)的疾病，可引起結(jié)腸的連續(xù)黏膜炎癥[6]。UC的發(fā)病最常見于成年期，其特征是均勻且連續(xù)的病變[7]。UC多發(fā)于西歐和北美地區(qū)發(fā)達(dá)國家，在亞洲發(fā)病率正逐年上升[8]。UC治療旨在降低復(fù)發(fā)率，改善生命質(zhì)量并最大程度減少與藥物相關(guān)的不良事件[9]。UC的基本療法是根據(jù)癥狀的嚴(yán)重程度決定的，通常為加強(qiáng)療法[10]。面向中藥的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為我們提供了一種通過藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)估、網(wǎng)絡(luò)/通路分析和靶標(biāo)預(yù)測(cè)揭示中藥分子機(jī)制的新穎方法[11]。本研究試圖基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)揭示黃芩湯對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎及相關(guān)癌癥保護(hù)作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)中使用成年雄性C57BL/6小鼠(6～8周齡，18～22 g)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。將動(dòng)物飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境條件下，溫度20～25 ℃，在12 h的明暗循環(huán)中，小鼠可自由獲取標(biāo)準(zhǔn)食物和水。本研究遵循《美國國家衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理和使用指南》，通過北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(倫理審批號(hào)：P2018027)。

1.1.2 藥物 黃芩湯由黃芩9 g、白芍6 g、黃芪18 g、苦參9 g、地榆12 g、三七粉6 g、白及6 g、炙甘草6 g、大棗6 g組成，是清熱止痢、和中止痛的經(jīng)典方劑。所有中藥均購自中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院中藥房，由中藥房統(tǒng)一煎煮而成。按處方比例取藥材，按1∶10加入清水煎煮2次，煮沸30 min后過濾出上清液，濃縮成1 g/mL的煎煮液備用。

1.1.3 試劑與儀器 右旋糖酐硫酸鈉36～50 G(Dextran Sulfate Sodium，DSS)(MP Biomedicals公司，美國，貨號(hào)：BS09890)；Azoxymethane(Sigma公司，美國，貨號(hào)A5486-25MG)；96孔酶標(biāo)板(Corning公司，美國，貨號(hào)：ANN6708)；聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride，PVDF)膜(Millipore公司，德國，貨號(hào)：K5CA1690G)；離心管(Axgen愛思進(jìn)公司，美國，貨號(hào)：CGH918-002)；無水乙醇(北京化學(xué)試劑廠，貨號(hào)：A2015-0115B)；氯化鈉(北京化學(xué)試劑廠，貨號(hào)：A2017-1589X)；蛋白上樣槍頭(瑞舒生物科技有限公司，貨號(hào)：BNM-09871)；抗體孵育盒(瑞舒生物科技有限公司，貨號(hào)：BBG-121582)；蛋白上樣緩沖液(碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào)：S2018-0530)；相關(guān)抗體(Abcam公司，英國，貨號(hào)：CV90-DF1235)；純水機(jī)(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司，型號(hào)：Smart-N)；電熱恒溫水箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：CU-420)；離心機(jī)(Sigma公司，美國，型號(hào)：D-37520 1-14K)；分析天平(Sartorius公司，德國，型號(hào)：BS124S)；超微量紫外分光光度計(jì)(賽默飛世爾公司，美國，型號(hào)：NanoDrop)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 分組：根據(jù)小鼠體質(zhì)量采用2016版Excel中的Rand函數(shù)將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組15只，誘導(dǎo)組15只，黃芩湯組15只；腫瘤誘導(dǎo)組15只，黃芩湯+腫瘤組15只，第11天處死小鼠，檢查其免疫組化及腫瘤個(gè)數(shù)和腫瘤大小。模型制備：通過在飲用水中添加3%硫酸葡聚糖(Dextran Sulfate Sodium Salt，DSS)(w/v)，在C57BL/6小鼠中誘導(dǎo)UC7 d。在研究期間，模型動(dòng)物每天給予黃芩湯灌胃，而未治療的動(dòng)物作為對(duì)照組，每隔1 d更換新鮮制備的DSS溶液，每天監(jiān)測(cè)體質(zhì)量，并觀察糞便和身體活動(dòng)。7 d后，將小鼠用CO2安樂死，并收集脾臟和結(jié)腸進(jìn)行測(cè)量。對(duì)于腫瘤的誘導(dǎo)，如前所述誘導(dǎo)結(jié)腸炎相關(guān)的癌癥(Colitis-associated Carcinoma,CAC)，按體質(zhì)量對(duì)小鼠腹膜內(nèi)注射偶氮甲烷(Azoxymethane，AOM)，10 mg/kg，并用常規(guī)水和飲食維持7 d。對(duì)小鼠進(jìn)行2個(gè)DSS處理周期，每個(gè)周期由3% DSS組成，持續(xù)7 d，用普通水恢復(fù)14 d。

1.2.2 給藥方式 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中黃芩湯+腫瘤組每天給小鼠黃芩湯灌胃。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，使用解剖顯微鏡對(duì)小鼠結(jié)腸腫瘤進(jìn)行計(jì)數(shù)和測(cè)量。黃芩湯組以20 g/kg給藥量灌胃給藥，1次/d。其余各組小鼠均予以等量生理鹽水灌胃干預(yù)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.3.1 樣品采集 取出小鼠胃腸道進(jìn)行測(cè)量，清空內(nèi)容物并稱重。將腸段(2 cm)浸入10%甲醛緩沖液中進(jìn)行組織學(xué)分析。收集與相應(yīng)組織學(xué)樣品相鄰的腸段(2 cm)，在液氮中速凍并儲(chǔ)存于80 ℃冰箱中用于生化分析。切除結(jié)腸段，除去黏附的脂肪組織，用生理鹽水沖洗，以除去糞便殘留物，吸干并測(cè)量。收集結(jié)腸用于蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin，HE)染色，并收集血清用于測(cè)量髓過氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)。

1.2.3.2 組織分析及評(píng)分 DSS誘發(fā)的結(jié)腸炎結(jié)腸鏡損傷評(píng)分如下：0正常結(jié)腸組織；1僅限于黏膜的炎癥或局灶性潰瘍；2局限性或廣泛性潰瘍和炎癥僅限于黏膜和黏膜下層；3局灶性或廣泛性潰瘍和炎癥受固有肌層的限制；4局限性或廣泛性潰瘍和炎癥伴漿膜受累；5廣泛的潰瘍和透壁炎癥與漿膜相關(guān)。宏觀觀察后，將結(jié)腸組織固定在4%多聚甲醛中，脫水、包埋在石蠟中，最后切成4 μm厚的切片，用于組織學(xué)評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)程序。

1.2.3.3 結(jié)腸組織的免疫組織化學(xué)分析 5 μm厚的石蠟切片用于免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。為回收抗原，將樣品置于檸檬酸溶液(pH=9.0)中，并在微波爐中加熱10 min。隨后，將切片與無動(dòng)物的封閉溶液一起孵育1 h，與F4/80單克隆抗體在4 ℃溫度下孵育過夜。之后，將切片用二抗標(biāo)記2 h。3′-二氨基聯(lián)苯胺用于產(chǎn)生褐色信號(hào)，蘇木精用作復(fù)染。通過顯微鏡使免疫組織化學(xué)圖像可視化，并通過Image-Pro Plus軟件進(jìn)行分析。

1.2.3.4 MPO測(cè)定 MPO活性是通過檢測(cè)嗜中性粒細(xì)胞浸潤來指示急性炎癥的指標(biāo)。將中結(jié)腸(2 cm)的樣品在10 mL磷酸鉀緩沖液(750 mL)中勻漿并離心(13 000×g，離心半徑13 cm，持續(xù)12 min)，棄去上清液，并將剩余的組織重懸于200 mL 0.5%十六烷基三甲基溴化銨緩沖液。將反應(yīng)溶液(4.2 mg的O-二苯胺二鹽酸鹽試劑，12.5 mL的過氧化氫，2.5 mL pH 6.0的磷酸鉀緩沖液和22.5 mL的蒸餾水)加入板中(200 mL/孔)并改變吸光度(450 nm)，用分光光度計(jì)每隔1 min進(jìn)行測(cè)量，共15 min，數(shù)據(jù)表示為每克組織MPO的單位。

1.2.3.5 數(shù)據(jù)和疾病活動(dòng)指數(shù) 每天監(jiān)測(cè)和記錄小鼠體質(zhì)量和液體攝入量。每天使用疾病活動(dòng)指數(shù)的4個(gè)參數(shù)(體質(zhì)量減輕、直腸出血、糞便稠度和總體狀況)對(duì)UC的嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分。每個(gè)參數(shù)的評(píng)分為0-3(嚴(yán)重程度越高，分值越高)。

1.2.3.6 白細(xì)胞培養(yǎng)計(jì)數(shù) 在補(bǔ)充了10%胎牛血清、100 U/mL氨芐青霉素和100 mg/mL鏈霉素的培養(yǎng)基中，將THP-1細(xì)胞維持在5% CO2、37 ℃的潮濕環(huán)境中。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%濃度時(shí)，以1×106個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并用各種濃度的奧羅西汀(12.5 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L)處理2 h。加入1 μg/mL細(xì)菌脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，并將細(xì)胞再孵育24 h。

1.2.3.7 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的生物活性化預(yù)測(cè) 加權(quán)集成相似度算法通過大規(guī)模的藥物靶標(biāo)關(guān)系被用于預(yù)測(cè)生物活性化合物的直接靶標(biāo)。本研究中將可能性得分≥7的目標(biāo)作為直接目標(biāo)，將目標(biāo)映射到UniProt數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行注釋和標(biāo)準(zhǔn)化。通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP,http://tcmspw.com/)檢索黃芩湯配方中所有草藥的類藥性(Drug Likeness，DL)，篩選出生物活性化合物。通過集成模型預(yù)測(cè)和篩選黃芩湯中潛在的生物活性化合物。通過OBioavail 1.1獲得口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)值，并選擇OB≥30%的化合物進(jìn)行進(jìn)一步分析。

2 結(jié)果

2.1 黃芩湯主要藥用成分篩查 對(duì)以黃芩湯為基礎(chǔ)的加味黃芩湯主要藥用成分進(jìn)行活性檢測(cè)，分析得到黃芩、芍藥、黃芪、苦參、地榆、三七、甘草、大棗等成分和多種活性化合物。通過數(shù)據(jù)庫并根據(jù)OB、DL閾值，共檢索到加味黃芩湯主要活性化合物282個(gè)：黃芩36個(gè)、芍藥13個(gè)、黃芪19個(gè)、苦參45個(gè)、地榆35個(gè)、三七9個(gè)、白及4個(gè)、甘草92個(gè)、大棗29個(gè)。將結(jié)果進(jìn)行OB值排序，黃芩中的黃芩新素、欖核蓮黃酮、5,7,4′-三羥基-8-甲氧基黃烷酮、黃芩黃酮，芍藥中的芍藥吉酮、芍藥苷，黃芪中的異黃酮、7-O-甲基異丙醇胺、刺芒柄花素、葉酸，苦參中的苦參醇、葉立酮、苦參酚，地榆中的沒食子酸、兒茶素、鞣花酸等鞣質(zhì)類成分以及地榆皂苷，三七中的槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、人參皂苷rh2，白及中的2,3,4,7-四甲氧基菲、甘草中的甘草酚、甘草吡喃香豆酮、甘草查爾酮B，大棗中的穆坪馬兜鈴酰胺等成分的OB值較高，表明這些成分在加味黃芩湯中的活性較高，也體現(xiàn)了加味黃芩湯多成分、多靶點(diǎn)的藥物特征。

2.2 黃芩湯改善了DSS誘導(dǎo)的UC 誘導(dǎo)組較對(duì)照組小鼠體質(zhì)量和結(jié)腸長度降低(P<0.05)，黃芩湯組較誘導(dǎo)組中小鼠體質(zhì)量和結(jié)腸長度升高(P<0.05)，黃芩湯可改善DSS誘導(dǎo)的小鼠UC，對(duì)小鼠結(jié)腸具有一定的保護(hù)作用。見圖1，表1。

圖1 小鼠結(jié)腸長度比較

表1 2周后小鼠體質(zhì)量及結(jié)腸長度測(cè)量

2.3 黃芩湯降低小鼠UC的炎癥反應(yīng) 誘導(dǎo)組較對(duì)照組白細(xì)胞含量、脾臟指數(shù)升高(均P<0.05)，黃芩湯組較誘導(dǎo)組白細(xì)胞含量、脾臟指數(shù)降低(均P<0.05)，黃芩湯可降低小鼠的炎癥反應(yīng)。見表2。

表2 小鼠炎癥水平檢測(cè)

2.4 黃芩湯降低結(jié)腸炎組織損傷評(píng)分 誘導(dǎo)組較對(duì)照組結(jié)腸損傷評(píng)分、組織學(xué)評(píng)分升高(均P<0.05)，黃芩湯組較誘導(dǎo)組腸損傷評(píng)分、組織學(xué)評(píng)分降低(均P<0.05)，說明黃芩湯可保護(hù)結(jié)腸的組織損傷。對(duì)照組結(jié)腸組織未出現(xiàn)病理變化和巨噬細(xì)胞浸潤；誘導(dǎo)組結(jié)腸組織出現(xiàn)水腫等損傷性反應(yīng)，并且可見大量巨噬細(xì)胞浸潤；黃芩湯組結(jié)腸組織水腫減輕，巨噬細(xì)胞浸潤減少。發(fā)現(xiàn)黃芩湯能夠抑制結(jié)腸組織的病理變化和巨噬細(xì)胞浸潤，及黃芩湯對(duì)UC的保護(hù)作用。見圖2，表3。

圖2 結(jié)腸組織的免疫組織化學(xué)分析(HE染色，×200)

表3 結(jié)腸組織評(píng)分

2.5 小鼠結(jié)腸髓過氧化物酶活性 誘導(dǎo)組較對(duì)照組MPO活性升高(P<0.05)，黃芩湯組較誘導(dǎo)組MPO活性降低(P<0.05)。見表4。

表4 MPO活性檢測(cè)

2.6 黃芩湯有效抑制腫瘤事件的發(fā)生和發(fā)展 黃芩湯+腫瘤組較腫瘤誘導(dǎo)組腫瘤負(fù)荷、腫瘤大小都減小(P<0.05)。見圖3，表5。

圖3 小鼠結(jié)腸腫瘤

表5 小鼠腫瘤發(fā)生比較

3 討論

UC的發(fā)生涉及遺傳、生化、心理、社會(huì)和環(huán)境因素[12]。鑒于UC的復(fù)雜發(fā)病機(jī)制，單一靶標(biāo)藥物難以獲得更好的治療效果，而多靶點(diǎn)聯(lián)合藥物治療已成為未來UC治療的趨勢(shì)。中醫(yī)藥由于多靶點(diǎn)作用，已成為UC治療藥物的重要來源。通過從整體的角度探討藥物與疾病之間的關(guān)系為中藥研究提供了新的策略[13]。黃芩湯是重要的傳統(tǒng)中藥處方，已廣泛用于抗炎、止痛和免疫調(diào)節(jié)[14]。ADME是藥物“吸收(Absorption)、分布(Distribution)、代謝(Metabolism)和外排(Excretion)”的簡(jiǎn)稱，代表藥物進(jìn)入機(jī)體后機(jī)體對(duì)藥物的處置過程。本研究根據(jù)ADME特性進(jìn)行初步篩選后，篩選出126種潛在的黃芩湯生物活性化合物。研究表明，黃芩湯對(duì)UC的治療作用可以通過多種途徑的協(xié)同或者累加作用發(fā)揮抗炎作用。

黃芩湯處方在中國已經(jīng)用于治療胃腸道疾病，包括惡心、嘔吐、腹瀉和腹部絞痛已有一千多年的歷史[15]。該配方草藥中的主要活性成分是黃芩、芍藥、甘草、大棗等三萜類皂苷衍生物和多糖[16]。研究表明，黃芩湯中某些化合物(如配方中的黃苷)對(duì)UC有影響。本研究證實(shí)，黃芩湯可用于預(yù)防和治療UC。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)小鼠進(jìn)行DSS給藥導(dǎo)致體質(zhì)量減輕，并引起結(jié)腸組織的黏膜炎癥，上皮缺失和巨噬細(xì)胞浸潤。口服黃芩湯可減輕小鼠的體質(zhì)量，并改善了結(jié)腸組織的病理變化和巨噬細(xì)胞浸潤，從而證實(shí)了黃芩湯對(duì)UC的保護(hù)作用。但是，目前尚不明確黃芩湯中對(duì)UC發(fā)揮保護(hù)作用的特定生物活性單體。液質(zhì)色譜-質(zhì)譜法測(cè)定的藥物組織分布是藥理效力研究中的重要指標(biāo)[17]。作為先天免疫細(xì)胞，巨噬細(xì)胞在保護(hù)人體免受UC期間腔內(nèi)細(xì)菌的侵害中至關(guān)重要[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)黃芩湯可以緩解DSS引起的結(jié)腸炎癥癥狀，減少血液和結(jié)腸中巨噬細(xì)胞的數(shù)量，而且還證明黃芩湯可以改善體內(nèi)炎癥細(xì)胞的浸潤。

包括UC和克羅恩病在內(nèi)的炎性腸病是一種慢性的特發(fā)性腸道的炎癥性疾病，目前的治療在很大程度上受到嚴(yán)重全身性不良反應(yīng)的限制。在過去的十年中，炎性腸病的治療選擇是抗炎藥(5-氨基水楊酸、類固醇激素)或免疫抑制劑[20]。盡管這些藥物有效，但進(jìn)一步應(yīng)用受到其對(duì)免疫系統(tǒng)非特異性作用的限制，這些非特異性作用會(huì)導(dǎo)致短期和長期的免疫力下降，并發(fā)生過敏反應(yīng)、惡心、肝酶升高、胰腺炎和其他威脅生命的不良反應(yīng)。此外，局部活性最低且全身吸收最小的抗炎藥(5-氨基水楊酸酯)需要頻繁大劑量給藥才能發(fā)揮可評(píng)估的臨床功效。此外，盡管已經(jīng)開發(fā)出了可將藥物專門遞送至結(jié)腸較長時(shí)間的持續(xù)藥物釋放裝置，例如藥丸、膠囊或片劑，但這些藥物的治療功效有限，僅對(duì)一部分炎性腸病患者有效。

綜上所述，中醫(yī)治療UC等疾病具有較高療效、低治療成本和不良反應(yīng)少的優(yōu)勢(shì)。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)黃芩湯對(duì)UC具有保護(hù)作用，可抑制炎癥及腫瘤的發(fā)展。