基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究丹參-紅花治療冠心病的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制

曹新福 王鑫淼 劉紅旭 張赫怡 李 享

(1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京，100010； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029)

冠心病(Coronary Heart Disease，CHD)是指由于冠狀動脈發(fā)生粥樣硬化引起冠脈管腔狹窄或閉塞，導(dǎo)致心肌缺血缺氧甚至壞死而引發(fā)的心臟病，心血管疾病每年造成1 730多萬人死亡，到2030年估計死亡人數(shù)將增加到2 360萬，而CHD是最常見的心血管死亡原因[1-5]。CHD屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”范疇，血瘀是CHD的關(guān)鍵病機，丹參-紅花是常見的活血化瘀藥對，以其為主要組分的丹紅注射液廣泛用于CHD的治療，且具有確切的療效[6-9]。然而丹參-紅花治療CHD的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制仍不夠明確。目前大多數(shù)關(guān)于丹參、紅花的研究局限在“單一成分”“單一靶點”或“單一途徑”，中醫(yī)理論是建立在系統(tǒng)醫(yī)學(xué)方法論基礎(chǔ)上的，單一的成分或作用靶點研究，難以充分揭示中藥復(fù)方的作用機制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可通過構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)闡述中藥復(fù)方多成分、多靶點、多作用機制的特點，超越了單靶點思維的束縛，能較全面揭示中藥復(fù)方的作用機制[10]。本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度探討丹參-紅花治療CHD的物質(zhì)基礎(chǔ)和可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1 藥物成分及靶點的篩選 使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmspw.com/)，分別以丹參、紅花為關(guān)鍵詞檢索出所有化學(xué)成分，以口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%和類藥性(Drug Likeness，DL)≥18%為篩選條件，篩選相應(yīng)藥物的化學(xué)成分[11]。通過PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)查找篩選出的化學(xué)成分的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，將三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)輸入PharmMapper平臺(http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/index.php)預(yù)測化學(xué)成分的潛在靶點[12-13]。最后，使用String 10.5數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/)將檢索得到的所有靶點校正為其官方名稱[14]。

1.2 疾病相關(guān)靶點的收集及藥物-疾病共同靶點篩選 以“coronary heart disease”為關(guān)鍵詞，通過檢索DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/)，獲取與CHD相關(guān)的靶點[15]。將藥物化學(xué)成分的潛在靶點以及CHD相關(guān)的靶點輸入Venny 2.1在線軟件(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)進行交集，求得藥物和疾病之間的共同靶點，并繪制韋恩圖[16]。

1.3 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)[17]。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點代表藥物、成分、靶點、疾病，邊代表藥物-成分-靶點-疾病之間的相互作用。通過Cytoscape的附加功能CytoNCA計算網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的度中心性(Degree Centrality，DC)、中介中心性(Betweenness Centrality，BC)、接近中心性(Closeness Centrality，CC)和特征向量中心性(Eigenvector Centrality，EC)，用以篩選丹參-紅花治療CHD的關(guān)鍵成分，參數(shù)值越大，說明節(jié)點越接近網(wǎng)絡(luò)的中心。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在String 10.5數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)入藥物-疾病的共同靶點，設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為(>0.40)，其他的參數(shù)保持默認設(shè)置，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點表示靶點，節(jié)點之間的直線代表靶點間有相互作用關(guān)系，每種顏色的線條分別代表不同關(guān)系，線條越多代表度值越大，作用關(guān)系越強。

1.5 基因本體(Gene Ontology，GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析 將80個藥物-疾病的共同靶點，依據(jù)P<0.05篩選條件導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)，進行GO富集分析和KEGG富集分析，并采用Omicshare軟件繪制KEGG富集分析氣泡圖[18]。

2 結(jié)果

2.1 丹參-紅花化學(xué)成分及靶點篩選 共納入化學(xué)成分84個，丹參65個，紅花22個，Baicalin、Luteoli、Poriferast-5-en-3beta-ol為丹參-紅花所共有。借助PubChem查找化學(xué)成分的三維結(jié)構(gòu)，并通過在線數(shù)據(jù)庫PharmMapper預(yù)測得到211個藥物靶點。

2.2 疾病相關(guān)靶點的收集及藥物-疾病共同靶點篩選 共得到與CHD相關(guān)的有治療作用的靶點912個。得到藥物-疾病之間的共80個共同靶點。見圖1。

圖1 藥物-疾病靶點韋恩圖

2.3 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 多個化學(xué)成分可作用于同一個靶點，一個化學(xué)成分可作用于多個靶點，體現(xiàn)了丹參-紅花治療CHD多成分、多靶點的作用特點。見圖2。結(jié)果顯示化學(xué)成分的DC中位數(shù)為10.00，BC中位數(shù)為6.49、CC中位數(shù)為0.41、EC中位數(shù)為0.08，篩選得到丹參-紅花治療CHD的13個關(guān)鍵成分，丹參中有8個，紅花中有6個，Luteolin(木犀草素)為丹參-紅花所共有。見表1。

圖2 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

表1 關(guān)鍵化學(xué)成分信息

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 度值排名前10的靶點為IL6、AKT1、VEGFA、CXCL8、PTGS2、IL1B、NOS3、MAPK8、CCL2、MMP9，這些靶點可能為丹參-紅花治療CHD的核心靶點。見圖3～4。

圖3 藥物-疾病共同靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名前20靶點

2.5 GO功能富集分析 共收集到292個生物過程，25個細胞組分，62個分子功能。見表2～4。

表2 GO富集-生物過程

表3 GO富集-細胞組分

表4 GO富集-分子功能

2.6 KEGG通路富集分析 共收集到115條信號通路，以校正P值從小到大進行排序，取排名前20的信號通路，并繪制氣泡圖。見表5，圖5。

表5 KEGG通路富集分析

圖5 KEGG通路富集分析

3 討論

CHD屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹心痛”范疇，其發(fā)生多與年老體衰、寒邪內(nèi)襲、飲食不節(jié)、情志失調(diào)等因素相關(guān)。普遍認為該病病機為本虛標實，本虛以氣虛、陰虛、陽虛為主，標實多與寒凝、痰濁、瘀血有關(guān)，其中又以心脈瘀阻為關(guān)鍵[19]。穩(wěn)定期多表現(xiàn)為虛實夾雜，發(fā)作期則以寒凝血瘀或兼痰濁為主。治法上則強調(diào)急則治其標，發(fā)作期以活血化瘀、溫化寒痰為主；緩則標本兼治，穩(wěn)定期則以益氣養(yǎng)陰、溫陽散寒配合活血化瘀、化痰降濁等治法為關(guān)鍵。血瘀證貫穿CHD發(fā)展的始終，為最主要的證候要素，活血化瘀是治療CHD的核心治法[20-21]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對活血化瘀藥對丹參-紅花治療CHD的物質(zhì)成分、潛在靶點及可能信號通路進行了初步探討。

藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，丹參-紅花治療CHD的關(guān)鍵成分有13個，丹參中有8個，紅花中有6個，木犀草素為丹參-紅花所共有。本研究發(fā)現(xiàn)與CHD相關(guān)程度較高的成分有5個，分別為槲皮素、木犀草素、山柰酚、丹參酮ⅡA、黃芩苷元。槲皮素具有抑制乳酸脫氫酶氧化、舒張血管，保護血管內(nèi)皮功能、預(yù)防炎癥損傷以及抗血小板聚集等作用[22]。木犀草素通過PI3K/AKT信號通路抑制缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的肌質(zhì)網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶2a活性的降低，從而產(chǎn)生心肌保護作用，同時減少乳酸脫氫酶的釋放和細胞凋亡[23]。山柰酚抗缺血再灌注損傷可能與抗氧化、抑制巰基蛋白酶-3有關(guān)[24]。丹參酮ⅡA通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路來預(yù)防心肌缺血再灌注損傷[25]。黃芩苷元可以增強心肌抗氧化能力，減輕中性粒細胞介導(dǎo)的炎癥損傷，降低心肌缺血/再灌注損傷誘導(dǎo)的肌酸激酶和乳酸脫氫酶的釋放，降低心肌梗死和心肌細胞凋亡的發(fā)生率[26]。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示，IL6、AKT1、VEGFA、CXCL8、PTGS2、IL1B、NOS3、MAPK8、CCL2、MMP9等可能為丹參-紅花治療CHD的核心靶點。本研究提示與CHD相關(guān)的靶點有9個，分別為IL6、AKT1、VEGFA、CXCL8、PTGS2、IL1B、NOS3、CCL2、MMP9。白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)是一種上游炎癥介質(zhì)，在引起動脈粥樣硬化的下游炎癥反應(yīng)中起著核心作用，具有IL-6受體變異的個體CHD患病風險降低[27]。蛋白激酶B1在心肌細胞、內(nèi)皮細胞和血栓細胞等心血管系統(tǒng)細胞的功能行為中具有明確的調(diào)節(jié)作用，蛋白激酶B1基因敲除小鼠表現(xiàn)出嚴重的動脈粥樣硬化、閉塞性冠狀動脈疾病[28]。血管內(nèi)皮生長因子A是促血管生成神經(jīng)保護因子，在血管生成、修復(fù)和重塑過程中發(fā)揮著重要作用，影響動脈粥樣硬化的形成[29]。IL-8是一種趨化因子CXC，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的遷移和增殖，在冠狀動脈粥樣硬化中，IL-8能通過其血管生成特性促進斑塊形成[30]。環(huán)氧合酶-2衍生的前列環(huán)素通過抑制沉默信息調(diào)節(jié)因子-1依賴的組織因子來調(diào)節(jié)動脈血栓形成,同時前列環(huán)素具有血管舒張和抗血小板作用[31-32]。CHD患者的高冠狀動脈鈣負荷與血清IL-1β水平顯著升高有關(guān)，其通過促進成骨轉(zhuǎn)錄程序而成為血管平滑肌細胞鈣沉積的關(guān)鍵驅(qū)動，IL-1βmAb可抑制低密度脂蛋白受體缺陷小鼠的主動脈鈣化[33-34]。一氧化氮合酶3受剪切力和血管舒緩激肽及乙酰膽堿等刺激后釋放一氧化氮以促進血管舒張，抑制血小板聚集和黏附，參與內(nèi)皮祖細胞的活化、平滑肌細胞增殖等過程[35]。CC基序趨化因子配體2主要由炎癥細胞和內(nèi)皮細胞表達，其在促炎刺激和組織損傷后表達水平上調(diào)，在動脈粥樣硬化的發(fā)病機制中起著重要作用[36]?；|(zhì)金屬蛋白酶9參與動脈粥樣硬化的各個階段,通過破壞內(nèi)皮細胞周圍的基底膜促進單核細胞向內(nèi)皮細胞上遷移,促進平滑肌細胞遷移到動脈粥樣硬化病變部位，并在那里增殖和分泌膠原以及形成纖維帽所需的其他細胞外基質(zhì)蛋白[37]。

GO富集分析結(jié)果顯示，生物過程主要涉及一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)、缺氧反應(yīng)、凋亡過程的負調(diào)控、血管生成、細胞對缺氧的反應(yīng)等。細胞組分主要涉及細胞外間隙、受體復(fù)合體、細胞表面、細胞質(zhì)核周區(qū)、細胞器膜、質(zhì)膜、血小板α顆粒腔、細胞外基質(zhì)等。分子功能主要涉及酶結(jié)合、類固醇激素受體、蛋白質(zhì)結(jié)合、細胞因子活性、類固醇結(jié)合、腎上腺素結(jié)合、蛋白質(zhì)均聚活性等。

KEGG通路富集分析結(jié)果中與CHD相關(guān)度較高的通路有5條，分別為流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路、松弛素信號通路。剪應(yīng)力代表了血流施加在血管壁內(nèi)皮表面的摩擦力，與動脈粥樣硬化的發(fā)展相關(guān)，紊亂血流相關(guān)的“啟動”狀態(tài)使內(nèi)皮細胞更容易受到高低密度脂蛋白膽固醇和高血糖等危險因素的影響，并激活多種炎癥事件，包括通透性增加、活性氧生成、核因子κB的激活等[38-39]。另外，作用于血管內(nèi)皮細胞表面的流體剪切應(yīng)力的增加可以導(dǎo)致細胞內(nèi)一氧化氮合酶活性顯著升高，從而增加血管內(nèi)皮細胞一氧化氮的生成[40]。IL-17調(diào)節(jié)多種炎癥介質(zhì)的表達，包括腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)、IL-1β和γ干擾素,此外還誘導(dǎo)核因子κB的激活,IL-17介導(dǎo)的促炎癥介質(zhì)到達一個共同的下游信號通路，導(dǎo)致動脈粥樣硬化[39-40]。缺氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia-inducible Factor-1，HIF-1)通過細胞特異性反應(yīng)，作用于內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞和巨噬細胞，上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)、一氧化氮、活性氧和血小板生長因子，引起內(nèi)皮細胞功能障礙、血管生成和炎癥,在動脈粥樣硬化的發(fā)展中起關(guān)鍵作用[43]；同時HIF-1信號通路對組織缺血后的恢復(fù)也十分必要，HIF-1可上調(diào)促血管生成的VEGF及促血管舒張的相關(guān)蛋白基因的表達，從而減輕組織缺血損傷[44]。巨噬細胞清道夫受體和泡沫細胞的形成在動脈粥樣硬化的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用，TNF-α通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后過程下調(diào)巨噬細胞清道夫受體基因表達，而TNF-α誘導(dǎo)的MAPK通路在巨噬細胞清道夫受體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和受體表達增加中起重要作用[45]。松弛素保護心臟的能力很可能是通過其抗纖維化、抗心肌細胞肥大、抗炎和血管舒張作用介導(dǎo)的，同時也可直接刺激心肌的再生和修復(fù)[46-47]。

綜上所述，可以發(fā)現(xiàn)丹參-紅花治療CHD具有多成分、多靶點、多通路協(xié)同作用的特點。丹參-紅花通過調(diào)節(jié)冠狀動脈粥樣硬化進程、減輕血管炎癥反應(yīng)、擴張冠狀動脈、抗血栓形成、減輕心肌缺血缺氧損傷，從而發(fā)揮治療CHD的作用。本研究初步揭示了丹參-紅花治療CHD的可能成分、潛在靶點以及信號通路，為進一步開展丹參-紅花治療CHD的相關(guān)研究提供了新的思路。