基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黃芪治療缺血性中風(fēng)的作用機(jī)制

唐秀松 陳 靜 張青槐 龐宇舟，2

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，南寧，530200； 2 中央民族大學(xué)民族醫(yī)藥教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100081)

缺血性中風(fēng)(Ischemic Stroke，IS)是一種因腦血管閉塞或狹窄,導(dǎo)致局部腦組織缺血缺氧，引起腦組織軟化甚至壞死的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]。臨床表現(xiàn)為偏身麻木、半身不遂、口舌歪斜、吞咽困難等[2]。IS在臨床上是常見病、多發(fā)病,有“三高”的特點(diǎn)，即發(fā)病率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高,嚴(yán)重影響患者的生命質(zhì)量，給患者和社會帶來了極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療IS主要以溶栓、抗凝、抗血小板、調(diào)脂穩(wěn)斑、控制血糖和血壓為主[4]。研究表明，中醫(yī)藥治療IS有一定的優(yōu)勢。

國醫(yī)大師劉祖貽治療IS使用黃芪的次數(shù)較其他單藥多，常用藥量為30～60 g，并且丹參-黃芪、黃芪-山楂、葛根-黃芪是高頻藥對[5]。應(yīng)用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，發(fā)現(xiàn)王新志治療IS的883首復(fù)方中，黃芪出現(xiàn)311次[6]。黃芪為豆科植物蒙古黃芪[Astragalusmemeranaceus(Fisch.)Bge.Var.mongholicus(Bge.)Hsiao]的根，其性微溫，味甘，歸脾、肺經(jīng)。具有補(bǔ)氣固表、托毒排膿生肌、利尿作用。臨床常用于治療氣虛、脫肛、子宮脫垂、汗證、水腫等病癥[7]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪含有皂苷類、氨基酸類、黃酮類、生物堿類、等化合物等，具有抗衰老、抗疲勞、抗心力衰竭、抗癌、提高免疫力等作用[8]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過借助計算機(jī)語言和數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)挖掘來構(gòu)建藥物與疾病之間相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，以進(jìn)一步闡明藥物治療疾病機(jī)制的一門科學(xué)。該學(xué)科為研究中藥治療疾病的動物實(shí)驗(yàn)研究提供了理論依據(jù)，為中藥現(xiàn)代化研究拓展了方向[9-10]。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黃芪治療IS的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 黃芪有效成分及相關(guān)靶點(diǎn)的收集 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)以“黃芪”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索。其藥物有效成分是按照口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18進(jìn)行過濾篩選，藥物相關(guān)靶點(diǎn)則不篩選，保存黃芪所有的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2 黃芪相關(guān)靶點(diǎn)的基因注釋 UniProt(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫又稱蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，除蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)外，其中還包含了大量的注釋信息。Perl作為一種功能豐富的計算機(jī)程序語言，能快速將黃芪的相關(guān)靶點(diǎn)在UniProt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白匹配后獲得該蛋白對應(yīng)的基因，即黃芪的靶點(diǎn)基因。

1.3 IS疾病基因的收集 以“Cerebral Ischemic Stroke”作為關(guān)鍵詞，檢索人類基因的綜合數(shù)據(jù)庫(GeneCards)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)中IS相關(guān)疾病，整理后去除重復(fù)的疾病基因，最終得到IS的疾病基因。

1.4 繪制韋恩圖 運(yùn)用R軟件(https://www.r-project.org/)中的VennDiagram程序包對1.2獲得的黃芪藥物基因和1.3獲得的IS疾病基因進(jìn)行分析處理，最終得到藥物與疾病二者的共同基因，即交集基因。

1.5 藥物-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 對1.2獲得的黃芪相關(guān)基因和1.4獲得的黃芪-IS疾病交集基因利用Perl語言進(jìn)行一一映射，獲得相應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系文本文件后運(yùn)用Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖可視化構(gòu)建，最終得到中藥-有效成分-疾病-基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.6 藥物-疾病蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)導(dǎo)入藥物-疾病交集基因，檢測條件為種屬選擇Homo Sapiens，保存PPI網(wǎng)絡(luò)圖。下載并保存PPI網(wǎng)絡(luò)中的string_interactions.tsv文件。然后運(yùn)用R軟件中的count.R對string_interactions.tsv文件進(jìn)行分析處理，最終獲得PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因的條形圖。

1.7 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析 將1.4所得的中藥-疾病交集基因利用計算機(jī)R軟件中的RSQLite程序包、BiocManager程序包、org.Hs.eg.db程序包進(jìn)行處理，獲得交集基因的ID，獲得的基因ID后再次運(yùn)用R軟件中的Colorspace程序包、Stringi程序包、DOSE程序包、ClusterProfiler程序包、Pathview程序包進(jìn)行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 黃芪藥物有效成分篩選和靶點(diǎn)收集結(jié)果 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲得黃芪藥物有效成分20個，主要包括丁子香萜、熊竹素、常春藤苷皂元、β-谷甾醇、異鼠李素、美迪紫檀素、5′-羥基異氟尿嘧啶-2′，5′-二-O-葡萄糖苷、7-O-甲基異丁香酚、9,10-二甲氧基翼果聚糖-3-O-尾-D-葡萄糖苷、(6aR，11aR)-9,10-二甲氧基-6a，11a-二氫-6H-苯并呋喃[3,2-c]鉻-3-醇、聯(lián)苯雙酯、芒柄花黃素、異黃烷酮、毛蕊同黃酮、山柰酚、富馬酸、(3R)-3-(2-羥基-3，4-二甲氧基化合物)苯并二氫吡喃-7-ol、異核糖醛-7,2′-二-O-葡萄糖苷、槲皮素等。黃芪相關(guān)靶點(diǎn)953個。

2.2 韋恩圖繪制結(jié)果 通過R軟件將180個黃芪藥物基因與2 606個IS疾病基因進(jìn)行計算分析后，提取藥物-疾病的共同基因即交集基因，并準(zhǔn)確繪制出韋恩圖，結(jié)果得到137個藥物-疾病共同基因。見圖1。

圖1 藥物-疾病韋恩圖

2.3 中藥-有效成分-疾病-基因網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 運(yùn)用Cytoscape軟件進(jìn)行藥物-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,拓?fù)浞治鼋Y(jié)果顯示黃芪主要通過16個有效成分作用于137個靶點(diǎn)基因，這137個靶點(diǎn)基因可能影響IS的發(fā)生。見圖2。

圖2 中藥-有效成分-疾病-基因網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 在String數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)入藥物-疾病的交集基因，結(jié)果顯示藥物與疾病之間相互作用蛋白包括AKT1、IL6、VEGFA、CASP3、JUN、MAPK8、PTGS2、CXCL8、EGF、MAPK1、EGFR、MMP9、MYC、FOS、IL1B、ESR1、CCND1、CCL2、MMP2、IL10、RELA、ICAM1、NOS3、PPARG、MAPK14、ERBB2、IL4、HMOX1、SERPINE1、AR等。其中AKT1、IL6、VEGFA、CASP3、JUN最有可能成為核心蛋白。見圖3～4。

2.5 GO富集分析結(jié)果 共得到144條GO生物學(xué)過程，主要涉及核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接配體調(diào)節(jié)的序列特異性DNA、細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、類固醇激素受體磷酸酶結(jié)合等。見表1，圖5。

圖3 藥物-疾病PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 藥物-疾病核心蛋白條形圖

表1 GO生物學(xué)過程(Count≥5)

續(xù)表1 GO生物學(xué)過程(Count≥5)

圖5 GO生物學(xué)過程條形圖

2.6 KEGG通路富集分析 通過R軟件計算分析后，共得164條KEGG信號通路，主要包括了AGE-RAGE信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路、IL-17信號通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通路、乙型肝炎病毒通路、前列腺癌通路、TNF信號通路、人巨細(xì)胞病毒感染通路、膀胱癌通路、胰腺癌通路、丙型肝炎通路、內(nèi)分泌抵抗通路等。其中，按照校正P值，排名前三的是AGE-RAGE信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路與IL-17信號通路。見圖6。

圖6A KEGG條形圖

圖6B AGE-RAGE信號通路

圖6C 流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化

圖6D IL-17信號通路

3 討論

IS屬于中醫(yī)“中風(fēng)”的范疇，其基本病機(jī)是陰陽失調(diào)，氣血逆亂。病位在腦，與心、肝、脾、腎密切相關(guān)。肝腎陰虛、氣衰血少為本，肝陽上亢、風(fēng)火相煽，瘀血阻滯和痰濕壅滯為標(biāo)。臨床上根據(jù)患者的神志是否清醒，將中風(fēng)分為中經(jīng)絡(luò)和中臟腑。其中，補(bǔ)陽還五湯是治療中經(jīng)絡(luò)-氣虛血瘀證的經(jīng)典方，以黃芪四兩為該方的主藥。

通過KEGG通路富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，富集P值最顯著的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是AGE-RAGE信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路與IL-17信號通路。AGE-RAGE信號通路是指晚期糖基化終末產(chǎn)物(Advanced Glycosylation End Products，AGEs)-糖基化終末產(chǎn)物受體(Receptor of AGEs，RAGE)信號通路，AGE-RAGE信號通路具有多種生物學(xué)功能，能夠激活核因子κB(NF-κB)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1)的產(chǎn)生、激活還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶引起氧化應(yīng)激活性氧等[11]。而據(jù)現(xiàn)有資料表明，在中風(fēng)后活性氧數(shù)量顯著增加[12]。流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路與動脈血管的粥樣硬化的進(jìn)展密切相關(guān)[13]。IL-17信號通路中，白細(xì)胞介素(Interleukin，IL-17)是一個重要的炎癥介質(zhì)，由輔助性T細(xì)胞(Th17)及先天性免疫細(xì)胞等分泌，在多種炎癥反應(yīng)及自身免疫性疾病病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，IL-17受體(IL-17R)通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體IL-17R-Act1-TRAF6激活下游核因子κB、JNK等信號通路[14]。研究表明，IL-17/NF-κB p65信號通路在老年急性腦出血發(fā)病及組織損傷中具有重要的作用，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激各種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)老年急性腦出血后炎癥反應(yīng)，緩解急性腦出血后腦組織損傷[15]。

通過中藥-有效成分-疾病-基因網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芪抗IS的有效成分有16個，包括山柰酚、槲皮素、異鼠李亭、丁子香萜、熊竹素、常春藤苷皂元、聯(lián)苯雙酯、芒柄花黃素、毛蕊同黃酮等。山柰酚是一種黃酮類化合物，有抗氧化、抗炎、抗癌等多種作用[16-19]。山柰酚可改善腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能癥狀，減少腦梗死的病理形態(tài)學(xué)和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu),下調(diào)Toll樣受體4、核因子κB p65、腫瘤壞死因子-α和IL-1β的水平，起到保護(hù)神經(jīng)的作用[20]。山柰酚糖苷可減少核因子κB和STAT3信號表達(dá)，抑制缺血再灌注大鼠的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，減小腦梗死面積和神經(jīng)元、部分細(xì)胞(小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞)損傷[21]。槲皮素是黃酮類家族成員之一，具有清除氧自由基、控制血糖、抗動脈粥樣硬化、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、減少炎癥介質(zhì)基因表達(dá)等作用[22-25]。槲皮素可降低糖尿病合并腦缺血再灌注損傷大鼠的血糖，提高血漿超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活力、降低丙二醛(Malondialdehyde，MDA)水平，改善神經(jīng)功能評分[26]。槲皮素上調(diào)糖尿病腦梗死大鼠的組織型纖溶酶原激活物mRNA表達(dá)、減少纖溶酶原激活物抑制物-1 mRNA表達(dá)[27-28]。芒柄花黃素屬于異黃酮類化合物，有抗炎、抗腫瘤、抗阿爾茨海默病等功效[29-31]。山柰酚與芒柄花黃素能顯著改善心肌細(xì)胞缺氧狀況，緩解心肌受損程度[32]。芒柄花黃素可提高SOD水平、減少M(fèi)DA水平，改善大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)功能缺損程度，并能抑制局灶性腦缺血再灌注大鼠Sph K1/S1P信號通路表達(dá)[33-34]。

據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果可知，AKT1、IL6、VEGFA、CASP3、JUN很有可能成為黃芪抗IS核心基因。蛋白激酶B是一種磷脂酰肌醇-3-激酶下游重要信號分子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵的絲氨酸(Ser473)/蘇氨酸(Thr308)蛋白激酶[35]，分為蛋白激酶B1、蛋白激酶B2和蛋白激酶B3 3個亞型，其中蛋白激酶B1在大腦分布較多，可加速細(xì)胞的增殖[36-37]。羥基紅花黃色素A與芍藥苷聯(lián)合用藥可上調(diào)腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死區(qū)磷酸化蛋白激酶B1的表達(dá),能協(xié)同保護(hù)腦缺血再灌注大鼠的腦損傷[38]。IL6是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)(機(jī)體防御、急相反應(yīng)、免疫反應(yīng)和造血反應(yīng)等)的細(xì)胞因子，同時也是腦缺血時的一種主要的神經(jīng)元死亡抑制因子[39]。缺血半暗帶中神經(jīng)元損傷程度與IL-6表達(dá)水平正相關(guān)[40]。IL-6含量與腦梗死發(fā)病后2～3個月MRI測定的腦梗死體積明顯相關(guān)[41]。血管內(nèi)皮生長因子A主要參與血管生成[42]。急性腦梗死患者血清中血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)水平的上升，與腦梗死疾病嚴(yán)重程度有關(guān)[43]。胱天蛋白酶-3是一種蛋白酶，在細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵的作用。敗醬總黃酮可減少腦梗死面積，下調(diào)腦組織中IL-6、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)、胱天蛋白酶-3水平，改善腦缺血再灌注損傷[44]。JUN是1號染色體基因等。抑制c-Jun氨基末端激酶激活能降低大鼠腦缺血再灌注損傷,可能和裂解-胱天蛋白酶-3等表達(dá)有關(guān)[45]。因此可知，AKT1、IL6、VEGFA、CASP3、JUN和IS的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，癌癥代謝調(diào)節(jié)、病毒應(yīng)答反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等參與了黃芪治療IS的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。其中AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路是主要信號通路之一。晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(Receptor Advanced Glycation End-Products，RAGE)能與AGEs配體特異性結(jié)合,下游的核轉(zhuǎn)錄因子被激活，提高炎癥介質(zhì)表達(dá),加劇動脈粥樣硬化的形成與發(fā)展[46]。而動脈粥樣硬化正是健康人患IS的高風(fēng)險因素之一。IL-17屬于白細(xì)胞介素家族成員之一,是一種前炎癥介質(zhì)及炎癥反應(yīng)調(diào)控因子，可誘導(dǎo)多種細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)(IL-6、IL-8等),加大炎癥反應(yīng),加重腦神經(jīng)細(xì)胞的炎癥損傷[47]。TNF-α是單核-巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的級聯(lián)激活[48]。TNF信號通路與IS的發(fā)病息息相關(guān)[49-50]。

綜上所述，黃芪是通過16種有效成分作用于137個IS靶點(diǎn)發(fā)揮治療作用，黃芪治療IS的核心基因的KEGG信號通路主要涉及AGE-RAGE信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路、IL-17信號通路等164條生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，表明了多個生物學(xué)過程的介導(dǎo)和參與是中藥發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵。本研究為黃芪治療IS提供了理論依據(jù)。