熵權(quán)法聯(lián)合Box-Behnken響應曲面法優(yōu)選復方龍血竭雙層膜中黃連提取工藝*

陳 坤，彭 霜，李 江，陳凌云，余曉玲，張韶湘△

(1.達州中醫(yī)藥職業(yè)學院，四川 達州 635000；2.普洱市民族傳統(tǒng)醫(yī)藥研究所，云南 普洱 665000；3.云南中醫(yī)藥大學，云南省高校外用給藥系統(tǒng)與制劑技術(shù)研究重點實驗室，云南 昆明 650500；4.昆明市中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650500)

“復方龍血竭”為云南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院(昆明市中醫(yī)醫(yī)院)經(jīng)驗方，由龍血竭、黃連、冰片組成，具有活血、生肌、鎮(zhèn)痛之效，臨床療效顯著[1]，現(xiàn)代藥理實驗表明“復方龍血竭”對小鼠創(chuàng)面組織的具有良好的修復作用，可促進大鼠口腔潰瘍傷口的愈合[2]，對于大鼠口腔黏膜潰瘍具有良好的治療效果[3]。方中龍血竭本就為提取物，無需再次提取，冰片為易揮發(fā)藥物，故龍血竭、冰片直接加入黃連提取物當中混勻，課題組前期已完成復方龍血竭口腔潰瘍雙層膜的制備[3]。本文旨在闡述方中黃連提取優(yōu)選的方法，為復方龍血竭雙層膜的大生產(chǎn)工藝提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 CP124C-電子天平(上海精密儀器儀表有限公司)；高效液相色譜儀(包括四元梯度泵，自動進樣器，二極管陣列檢測器，柱溫箱，型號：UltiMate 3000)(DIONEX Limited，U.S)；色譜柱C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，)(Kromat Corporation)；分析天平(型號：AB265-S METTLER TOLEDO，0.00001 g)(Mettler-tolido international trade(Shanghai)Co.LTD)；分析天平(型號：AL104METTLER TOLEDO，0.0001 g)(Mettler-tolido international trade(Shanghai)Co.LTD)。

1.1.2 試藥 鹽酸小檗堿對照品(購自中國食品藥品檢定研究院，批號：110713-201613)；黃連藥材由昆明市中醫(yī)醫(yī)院提供；水為純凈水；其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 固定相：Eclipse XDB色譜柱C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.05 moL·L-1磷酸二氫鈉溶液(30∶70)(用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：345 nm；進樣量：10 μL，理論板數(shù)按鹽酸小檗堿計算分別不低于3000。

1.2.2 溶液的配置 對照品溶液的制備：精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇制成0.357 mg·mL-1的對照品溶液。

提取物/黃連藥材供試品溶液的制備：取黃連提取物0.01 g/黃連藥材0.1 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密吸取甲醇-鹽酸(100∶1)溶液10 mL溶解，稱重，超聲30 min，放冷，在稱定重量，用甲醇補足重量，再精密吸取溶液1 mL，加甲醇-鹽酸(100∶1)溶液定容至25 mL容量瓶，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.3 方法學考察

1.2.3.1 專屬性考察 精密吸取對照品溶液、藥材供試品溶液和提取物供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，對照品溶液和供試品溶液中鹽酸小檗堿色譜峰保留時間一致。結(jié)果表明：系統(tǒng)專屬性良好。結(jié)果見圖1。

1.2.3.2 線性與范圍 取鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，制成每mL含有鹽酸小檗堿257 μg，分別精密吸取鹽酸小檗堿對照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，分別定容于25 mL容量瓶，精密吸取各濃度對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件測定峰面積，以峰面積值為縱坐標(y)，以鹽酸小檗堿濃度為橫坐標(x)進行線性回歸，得線性回歸方程為y=46.21x-259.5(r=0.9998)，結(jié)果表明，鹽酸小檗堿10.28～102.8 μg·mL-1范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系。

1.2.3.3 儀器精密度試驗 精密吸取鹽酸小檗堿對照品溶液10 μL，按上述色譜條件重復進樣6次，分別測定峰面積，計算RSD值為1.29%，表明該儀器精密度良好。

1.2.3.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一鹽酸小檗堿對照品溶液，黃連提取物供試品溶液10 μL，分別于1、2、4、8、12、24 h進樣測定峰面積，并計算其RSD值分別為0.75%、1.25%，表明對照品及供試品溶液在24小時內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.3.5 重復性試驗 稱取同一黃連提取物6份，各0.01 g，精密稱定，按“2.2”項下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定峰面積，并采用外標法計算各供試品含量，結(jié)果顯示，黃連提取物平均含量為37.92 mg·g-1，RSD值為1.64%，表明該方法重復性良好。

A.鹽酸小檗堿對照品溶液；B.藥材供試品溶液；C.提取物供試品溶液；1.鹽酸小檗堿

1.2.3.6 準確度試驗 稱取已知含量(37.92 mg·g-1)的黃連提取物6份，每份0.01 g，精密稱定，精密吸取已知濃度(0.357 mg·mL-1)的鹽酸小檗堿對照品溶液1.5 mL，按上述色譜條件進樣分析，計算含量，鹽酸小檗堿平均回收率為96.959%，RSD值為2.66%，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，該方法回收率良好。

表1 準確度試驗結(jié)果

1.2.4 評價指標

1.2.4.1 鹽酸小檗堿的轉(zhuǎn)移率的計算 黃連藥材含量測定：取黃連藥材0.1 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密吸取甲醇-鹽酸(100∶1)溶液10 mL溶解，稱重，超聲30 min，補足重量，再精密吸取溶液1 mL，加甲醇-鹽酸(100∶1)溶液定容至25 mL容量瓶，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，進樣，計算含量，平行三次，結(jié)果見表2。結(jié)果表明：黃連藥材中鹽酸小檗堿含量為6.68%，符合2020版《中華人民共和國藥典》一部黃連項下相關(guān)要求。

表2 黃連藥材的含量測定結(jié)果

鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率計算：已知黃連藥材中鹽酸小檗堿的含量為6.68%，則鹽酸小檗堿的轉(zhuǎn)移率=液相測得的鹽酸小檗堿含量/6.68%×黃連藥材用量×100%。

1.2.4.2 提取物得率計算 黃連提取物(干膏)得率公式：干膏得率(%)=黃連提取物/黃連藥材用量×100%。

1.2.4.3 綜合評分的計算 信息熵權(quán)重法(EWM)計算權(quán)重：設響應曲面試驗原始數(shù)據(jù)為矩陣(Yij)，將其采用極值法(公式1)進行處理，轉(zhuǎn)為(0，1)之間的數(shù)值得到響應原始矩陣[4]。根據(jù)公式(2)、(3)計算各指標信息熵“Hij=[0.9973，0.9981]，信息熵值越大，權(quán)重系數(shù)越低，信息效用值越低；計算鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率、干膏得率兩個指標權(quán)重系數(shù)分別為：59.24%，40.76%。

(1)

(2)

綜合評分：以鹽酸小檗堿的轉(zhuǎn)移率及干膏得率的綜合評分為指標，根據(jù)各權(quán)重系數(shù)，得綜合評分=(鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率/鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率最大值×59.24%+干膏得率/干膏得率最大值×40.76%)×100。

2 結(jié)果

2.1 單因素試驗

2.1.1 藥材吸水率考察 取黃連藥材粗粉7份，每份5 g，加入10倍量的水，分別于15、30、45、60、75、90、105 min后測定吸水率。(吸水率=[(飲片濕重-飲片干重)/飲片干重)]×100%)，結(jié)果顯示各時間段吸水率分別為74.21%、78.94%、81.49%、85.25%、86.37%、86.39%、86.46%，結(jié)果表明，當浸泡時間為75 min，90 min，105 min時，吸水量不再升高，故選擇75 min為最佳浸泡時間，此時的吸水率為86.37%，故在提取時，首次需加0.8倍量的水。

2.1.2 提取方法考察 以四種常用方法提取黃連，比較不同提取方法所得黃連提取物的含量及干膏得率，以“2.2”項下制備提取物供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定各提取物中的鹽酸小檗堿含量，計算綜合評分，優(yōu)選最佳藥材提取方法。四種提取方法試驗結(jié)果見表3。

酸水浸提法：取黃連粗粉20 g，精密稱定，加入0.2%硫酸溶液200 mL，浸漬24小時，濾過，濾渣同法提取1 次，合并濾液，加入氯化鈉，使含鹽量約達 4%(W/V)的濃度，攪拌，放置即有鹽酸小檗堿沉淀析出，抽濾，得黃連提取物。

超聲提取法：取黃連粗粉20 g，精密稱定，加入0.2%硫酸溶液200 mL，超聲處理60 min后過濾，濾渣同法提取1次，合并濾液，加入氯化鈉，使含鹽量約達 4%(W/V)的濃度，攪拌使氯化鈉完全溶解，靜置，抽濾，得黃連提取物。

回流提取法：取黃連20 g，精密稱定，加入200 mL水，回流60 min，趁熱過濾，加入4% NaCl，攪拌溶解，靜置，濾渣同法提取1次，合并抽濾，即得黃連提取物。

食鹽提取法：取黃連20 g，精密稱定，加入200 mL水，同時加入8 g食鹽，煎煮60 min，趁熱過濾，靜置析晶，抽濾，濾渣同法提取1次，合并抽濾，即得黃連提取物。

表3 黃連的4種提取方法試驗結(jié)果

由表3可知，4種提取方法試驗結(jié)果可以看出，干膏得率最高的是回流提取法為8.03%，鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率最高的是超聲提取法，其中回流提取法綜合評分最高為96.43，故選擇回流提取法對黃連進行提取。

2.2 Box-Behnken響應面法優(yōu)化提取工藝

2.2.1 提取響應面法的因素水平確定及設計與結(jié)果 為優(yōu)化回流提取方，在單因素考察的基礎上，以加水倍數(shù)(A)、提取時間(B)、提取次數(shù)(C)3個因素為自變量，以干膏得率、鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率的綜合評分為響應值，進行三因素三水平中心組合設計，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設計原理進行試驗設計，優(yōu)化水提取工藝，各因素及水平見表4。響應面試驗設計及結(jié)果見表5。

表4 試驗因素水平表

表5 響應面分析方案及結(jié)果

表6 回歸模型的方差分析

2.2.2 響應面分析與優(yōu)化 圖2的響應曲面圖和等高線圖直觀的反映了水提的各因素與響應值的交互作用。根據(jù)對綜合評分的影響程度看，提取次數(shù)與提取時間交互作用影響顯著，加水倍數(shù)和提取時間、加水倍數(shù)和提取次數(shù)交互作用影響不顯著，所得結(jié)論與方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 提取工藝的驗證 通過響應面法分析，預測最佳提取工藝為：加水量為10倍、提取時間為1.76 h、提取次數(shù)為3次，綜合評分理論預測值為99.23。為驗證模型與實際結(jié)果的準確性，以實際操作為準，即以10倍水量提取3次，每次1.8 h，平行操作3次。驗證結(jié)果見表7。

表7 提取工藝驗證試驗

由上表可知，干膏得率分別為12.54%、12.72%和12.55%，鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率分別為63.97%、63.65%和64.02%，相應的綜合評分為99.13、99.76、99.21，三者的RSD值分別為0.80、0.31%、0.35%(n=3)，結(jié)果顯示，干膏得率、鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率均合理，綜合評分接近預測值，工藝穩(wěn)定可行，具重現(xiàn)性和可操作性，證明優(yōu)選條件可行。

圖2 加水量與提取次數(shù)、加水量與提取時間、提取次數(shù)與提取時間的響應曲面圖和等高線圖

3 討論

信息熵權(quán)重法(Entropy Weight Method，EWM)是一種客觀賦權(quán)法，用來判斷某個指標的離散程度，離散程度越大，該指標對綜合評價的影響越大[5]。熵是不確定性的一種度量。信息量越大，不確定性就越小，熵也就越?。恍畔⒘吭叫?，不確定性越大，熵也越大[6]。相對于層次分析法(Analytic Hierarchy Process，AHP)而言，以熵權(quán)法確定權(quán)重系數(shù)，更加注重了數(shù)據(jù)的客觀性，而非決策者的主觀認識及經(jīng)驗判斷。同時采用響應面法可連續(xù)對實驗各因素水平進行分析，能夠?qū)⒏饕蛩鼐哂写硇缘臈l件進行組合實驗[7]，回歸擬合各因素與響應值的函數(shù)關(guān)系并進行分析，給出三維立體曲面圖[8]，更直觀地觀察出優(yōu)化區(qū)域，選擇實驗設計中的優(yōu)化條件確定[9-10]。本方首次采用EWM法結(jié)合響應曲面法優(yōu)化工藝各指標，使得出的相關(guān)數(shù)據(jù)更加科學、嚴謹。

方中龍血竭、冰片在制劑工藝成型中可直接入藥，無需提取，且龍血竭中龍血素為脂溶性成分[11]，故未納入評價指標。黃連具有清熱燥濕，瀉火解毒的功效，其有效成分為以小檗堿為代表的異奎寧類生物堿，具有抗心律失常[12]、抗高血壓[12]、抗腫瘤[13]等藥理作用，其治療口腔潰瘍的機制可能是通過競爭性抑制 PI3Kα、PI3Kγ、PI3Kδ、IKKβ 4個炎癥靶標蛋白的活性，抑制炎癥信號傳遞，從而發(fā)揮抗炎作用[14]。