基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究天麻素抗阿爾茲海默癥的作用機(jī)制*

張 科

(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津 300052)

阿爾茲海默癥(alzheimer’s disease，AD)是一種發(fā)病隱匿的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，65歲以上的人群多發(fā)，確診后很難控制，且目前治療效果不佳[1-3]。隨著全球人口老齡化社會的到來，AD 的發(fā)病率及患病人數(shù)逐年增加，嚴(yán)重威脅老年人群的健康，給人們的生活和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)，已經(jīng)成為亟待解決的一個世界難題[4-7]?，F(xiàn)代研究表明，AD的可能的主要病理特征有：β-淀粉樣蛋白斑塊(β-amyloid plaques，Aβ斑塊)、過度磷酸化Tau蛋白形成神經(jīng)纖維纏結(jié)、乙酰膽堿遞質(zhì)減少、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元丟失及淀粉樣血管病等[8]。但是AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與多種因素有關(guān)，目前確切原因尚不明確。研究表明，氧化應(yīng)激損傷參與AD的發(fā)病過程，并在AD發(fā)病機(jī)制的眾多學(xué)說中，氧化應(yīng)激學(xué)說與其他諸多假說之間存在間接或直接的聯(lián)系[9]。目前AD的治療藥物主要有M型膽堿能受體激動劑、膽堿酯酶抑制劑、抗氧化藥物、抑制β-淀粉樣蛋白沉積藥等[10-11]。由于這些藥物的治療效果仍不太理想，同時某些化學(xué)合成類藥物還會造成一定的不良反應(yīng)[12]。因而進(jìn)一步從中藥中探索新的AD治療藥物，是一個重要的研究趨勢[13]。

天麻素(gastrodin，GAS)，是從蘭科植物天麻的干燥根塊中提取的一種天然酚類物質(zhì)，具有較好的鎮(zhèn)靜、安眠、抗炎、抗氧化自由基作用，對神經(jīng)衰弱、失眠、頭痛有緩解作用[14]。研究表明，GAS通過抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化，減少Aβ蛋白的沉積保護(hù)神經(jīng)元，起到改善學(xué)習(xí)和記憶功能障礙的作用[15-17]。在AD防治方面具有重要的理論意義，但對于GAS的潛在靶點及作用機(jī)制仍然不明確。

近年來，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對中藥復(fù)方或者單體成分進(jìn)行物質(zhì)基礎(chǔ)、靶點、通路分析的研究成為熱點。該方法通過構(gòu)建多層次網(wǎng)絡(luò)，從基因、分子和細(xì)胞層面闡釋藥物的作用機(jī)制。PharmMapper是一款通過整合DrugBank、BindingDB、Target Bank和PPTD數(shù)據(jù)庫對藥效團(tuán)模型進(jìn)行反向預(yù)測靶點的工具，它能快速預(yù)測藥物分子作用靶標(biāo)[18]。本文擬采用該方法探究GAS防治AD的潛在靶點及作用機(jī)制，為其進(jìn)一步的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 預(yù)測天麻素的作用靶點 在Pubchem數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索關(guān)鍵詞“Gastrodin”獲取天麻素(CAS號：62499-27-8)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，保存為“SDF”格式文件。利用Chem3D 18.0進(jìn)行MM2力場優(yōu)化后保存為mol2格式文件并上傳至PhrmMapper平臺服務(wù)器，設(shè)定物種為人類，選取z’-scoer>0[19]進(jìn)行靶點預(yù)測，得到結(jié)果作為天麻素的靶點。并使用Uniprot數(shù)據(jù)庫，將靶點蛋白名稱(Protein name)轉(zhuǎn)換標(biāo)準(zhǔn)基因名(Gene symbol)，得到天麻素的潛在靶點。

1.2 篩選天麻素抗AD的靶點 打開Genecards數(shù)據(jù)庫，以“Alzheimer’s Disease”為關(guān)鍵詞檢索，收集AD疾病靶點，以 Excel 格式導(dǎo)出，然后將1.1中潛在靶點的標(biāo)準(zhǔn)基因名與疾病靶點基因取交集，作為天麻素抗AD的候選靶點。

1.3 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵靶點的篩選 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction networks，PPI)是由蛋白通過彼此之間的相互作用構(gòu)成，來參與生物信號傳遞、基因表達(dá)調(diào)節(jié)、能量和物質(zhì)代謝及細(xì)胞周期調(diào)控等生命過程的各個環(huán)節(jié)。系統(tǒng)分析蛋白在生物系統(tǒng)中的相互作用關(guān)系，對了解生物系統(tǒng)中蛋白質(zhì)的工作原理，了解疾病等特殊生理狀態(tài)下生物信號和能量物質(zhì)代謝的反應(yīng)機(jī)制，以及了解蛋白之間的功能聯(lián)系都有重要意義[20]。應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫對1.2項的候選靶點基因進(jìn)行分析，使用Cytoscape軟件將分析結(jié)果繪制成天麻素抗AD的PPI 網(wǎng)絡(luò)，并對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析。使用Cytoscape軟件中的“Generate style from statistics”工具設(shè)置網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的大小和顏色。節(jié)點的大小和顏色深淺代表Degree值的大小，邊的粗細(xì)反映了Combine Score的大小，從中篩選出Degree值排名靠前的靶點作為重要靶點。

1.4 功能注釋和KEGG通路富集分析 DAVID不僅是個生物數(shù)據(jù)庫，也是一款在線分析軟件?？梢杂脕碜龌虻牟町惙治?，系統(tǒng)的生物功能注釋信息，進(jìn)行基因本體論(gene ontology，GO)富集分析和KEGG通路分析[21]。將候選靶點導(dǎo)入DAVID6.8數(shù)據(jù)庫，并限定物種為人，進(jìn)行基因功能注釋分析和功能富集分析，然后導(dǎo)出數(shù)據(jù)，對生物過程(P<0.05)和信號通路(P<0.05)進(jìn)行篩選，并進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 天麻素靶點的預(yù)測結(jié)果 經(jīng)PhrmMapper平臺服務(wù)器對天麻素進(jìn)行靶點預(yù)測，將所得靶點蛋白名稱轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)基因名，刪除重復(fù)和無效靶點，共獲得有效靶點69個，詳見表1。

表1 天麻素靶點預(yù)測結(jié)果

2.2 成分靶點與疾病靶點的交集 Genecards數(shù)據(jù)庫檢索得到10972個AD相關(guān)靶點基因，使用在線韋恩圖工具獲得55個天麻素預(yù)測靶點與AD的共有基因，見圖1、圖2。具體為：NUDT9、CA12、GSTP1、CHEK1、PGR、MTAP、BCHE、TGFBR2、FCAR、CA1、CCNA2、RTN4R、CA2、BMP7、HSPA8、PYGL、QPCT、ANg，HK1、GALK1、DAPK1、F2、PPARg，AMD1、PAH、DHFR、MMP3、CTSK、PLK1、MMP8、ESR1、CSNK1G2、BAG1、RHEB、MIF、CRAT、AZGP1、ESR2、ADE4D、

圖1 交集基因的韋恩圖

ADPK1、ESRRg，GPI、SORD、LDHB、B3 gAT1、EPHB4、GSK3B、PLAU、HEXB、DPP4、CES1、CASP3、ATOX1、LCK、HMGCR。

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)的分析 將共有基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，結(jié)果以TSV格式導(dǎo)入Cytoscape(v 3.7.1)軟件進(jìn)行分析和可視化處理，節(jié)點的大小和顏色的深淺表示節(jié)點的度(Degree)的變化。分析結(jié)果顯示：PPI網(wǎng)絡(luò)包含44個節(jié)點，92條邊，平均節(jié)點Degree值為3.35，見圖2；使用軟件中Network Analyzer選項中的Network Analysis模塊進(jìn)行分析，結(jié)果網(wǎng)絡(luò)中Degree值排名前20的靶點包括ESR1、CASP3、HSPA8、CCNA2、LDHB、PLAU、DHFR、PGR、GSK3B、BMP7、PPARg，MMP3、CHEK1、GSTP1、GPI、BAG1、F2、SORD、CTSK、MMP8。其中ESR1(Degree=17)，CASP3(Degree=15)，HSPA8(Degree=7)，CCNA2(Degree=7)，LDHB(Degree=7)，PLAU(Degree=6)在網(wǎng)絡(luò)中具有較高的Degree值，網(wǎng)絡(luò)參數(shù)見表2。

圖2 潛在靶點與AD靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

表2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)參數(shù)

2.4 功能注釋分析和KEGG通路富集分析結(jié)果

2.4.1 GO富集分析結(jié)果 DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫得到天麻素與AD的交集基因GO功能富集分析的結(jié)果：GO條目79個(P<0.05)，包括46個生物過程(BP)，8個細(xì)胞組成(CC)，25個分子功能(MF)，主要涉及生物學(xué)功能與過程包括：肽基蘇氨酸磷酸化、肽基絲氨酸磷酸化、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄起始、激酶活性、碳酸鹽脫水酶活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性等，具體結(jié)果見圖3和表3。

表3 潛在靶點與AD靶點交集基因 GO 富集分析結(jié)果(P<0.05，BP、MF、CC的 PValue值前5注釋)

圖3 GO富集分析結(jié)果

2.4.2 KEGG通路富集分析結(jié)果 通路富集分析結(jié)果得到信號通路8條(P<0.05)，包括氨基糖和核苷酸糖代謝、氮代謝、AMPK信號通路、胰島素信號通路、淀粉和蔗糖代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、甲狀腺激素信號通路、細(xì)胞周期，富集結(jié)果見圖4和表4。

表4 潛在靶點與AD靶點交集基因 KEGG 通路富集分析結(jié)果(P<0.05)

圖4 KEGG富集分析的8條通路圖

3 討論

從蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖分析可知，雌激素受體(ESR1)，半胱氨酸蛋白酶-3(CASP3)，尿激酶型纖溶酶原激活因子(PLAU)在網(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵地位。研究發(fā)現(xiàn)，衰老過程中雌激素受體的活性、表達(dá)水平及分布變化會引起大腦中雌激素的變化，而AD病情發(fā)展的一個重要的危險因素就是腦源性雌激素的下降[23]。Aβ毒性假說是目前AD 致病機(jī)制中占主導(dǎo)地位的學(xué)說。淀粉樣前體蛋白APP由于基因突變，在β分泌酶作用下產(chǎn)生具有神經(jīng)毒性的Aβ，當(dāng)其含量升高后，細(xì)胞并不能將其代謝掉，在細(xì)胞中大量的積累形成Aβ纖維沉積。幾乎所有的AD 患者腦細(xì)胞中都會出現(xiàn)不同程度的Aβ纖維沉積。胰島素降解酶(insulin degrading enzyme，IDE)可以促進(jìn)AD患者腦Aβ降解，在AD患者腦中IDE會隨年齡的增加而下降，而雌激素受體β的激活可以上調(diào)IDE的表達(dá)，從而減少Aβ的沉積。同時雌激素受體的激活可以抑制促凋亡蛋白Bim的表達(dá)，增加抗凋亡蛋白Bcl-xL和Bcl-w的含量，從而降低Aβ介導(dǎo)的神經(jīng)元毒性損傷[24]。同時，選擇性雌激素受體激動劑通過激活神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子快速內(nèi)流，引起絲裂原活化蛋白激酶信號傳導(dǎo)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶的磷酸化，起到保護(hù)神經(jīng)的作用[25]；Caspase-3通過剪切靠近胞漿側(cè)C末端720位的天冬氨酸產(chǎn)生C末端異常的Aβ蛋白，這些蛋白對細(xì)胞有毒性作用，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[26]。另外，當(dāng)早老素蛋白PS1和PS2基因突變和蛋白質(zhì)過度表達(dá)時，Caspase-3可以酶切上述蛋白產(chǎn)生異常的氨基酸C末端片斷，而這些片段可以促進(jìn)APP水解產(chǎn)生更多Aβ，從而加速神經(jīng)元的凋亡[27]。PLAU基因可以編碼產(chǎn)生尿激酶型纖溶酶原激活因子(uPA)，該因子與特異受體相結(jié)合，催化生成具有降解神經(jīng)毒性Aβ蛋白作用的纖溶酶。因此uPA及其受體與AD發(fā)病的關(guān)系越來越受到關(guān)注[28]；而HSPA8、CCNA2、LDHB 與AD的關(guān)系尚未見相關(guān)報道，或可成為潛在作用靶點。

KEGG通路富集分析共得到8條與AD相關(guān)的通路，分別是氨基糖和核苷酸糖代謝、氮代謝、AMPK信號通路、胰島素信號通路、淀粉和蔗糖代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、甲狀腺激素信號通路、細(xì)胞周期，以上通路均與代謝相關(guān)。在AD患者中，功能失調(diào)的下丘腦導(dǎo)致能量穩(wěn)態(tài)紊亂和隨之而來的代謝障礙。在改變的代謝途徑中，肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病和病毒感染增加了患AD的風(fēng)險。研究顯示，AD患者的神經(jīng)退行性表現(xiàn)與腦能量代謝紊亂有關(guān)[29]。研究顯示，在AMPKα2敲除的神經(jīng)元細(xì)胞中Aβ生成會增加?？赡艿臋C(jī)制是由于激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)后，調(diào)節(jié)APP生成進(jìn)而減少Aβ的產(chǎn)生[30-31]。胰島素信號通路可以直接或間接地參與Aβ的清除過程。研究發(fā)現(xiàn)，人體出現(xiàn)胰島素抵抗時，升高的胰島素水平可以提高β分泌酶活性，從而加速APP剪切生成更多的Aβ蛋白。因此通過調(diào)節(jié)IDE的活性來抑制Aβ的生成[32]。

綜上，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對天麻素抗阿爾茲海默癥的潛在靶點進(jìn)行了預(yù)測，并對潛在靶點進(jìn)行了蛋白互作研究，以及通路富集分析。天麻素或可以作為治療AD的一個新的潛在化合物。同時本研究也具有一定的局限性，所得結(jié)論均建立于數(shù)據(jù)庫及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，缺乏相關(guān)實驗的驗證。后期將繼續(xù)從其化合物結(jié)構(gòu)改造、藥效評價以及機(jī)制驗證等方向開展試驗，為其進(jìn)一步深入研究提供思路和參考。