Rab蛋白參與結核分枝桿菌胞內吞噬的研究進展

孫巧玲，袁 欣，秦 歡，王 玉

(遵義醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 微生物學教研室， 貴州 遵義 563003)

結核病(tuberculosis，TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tuberculosis，Mtb)引起的嚴重傳染病。雖然已有疫苗進行預防接種，每年全球仍有超過1 000萬新發(fā)結核病例，100余萬人死于結核相關的疾病[1]。中國每年新增超過80萬結核病病例。近年來由于多重耐藥菌株的出現(xiàn)、艾滋病雙重感染病例的增多以及免疫抑制劑的濫用導致結核病的發(fā)病率和死亡率不斷上升。

Mtb主要經(jīng)由呼吸道進入機體，到達肺部遠端，隨后被肺泡巨噬細胞或樹突狀細胞捕獲，內化形成含Mtb吞噬體。對于普通細菌，細胞內吞噬體能與溶酶體結合形成吞噬溶酶體，再通過吞噬體酸化、水解酶、氧化酶作用等來清除細菌[2]。而Mtb能夠通過其菌體成分干擾宿主細胞內吞噬作用，進而阻止吞噬體成熟，使得Mtb能夠在細胞內存活和增殖[3]。

Rab蛋白屬于小GTP酶家族，在真核細胞中廣泛表達，調控了胞內各種膜轉運過程，包括吞噬過程。大量研究表明Rab蛋白與結核分枝桿菌胞內吞噬密切相關。因此，本綜述著重討論影響胞內吞噬作用的Mtb菌體成分以及Rab蛋白對Mtb吞噬的影響，以期深入了解Mtb與Rab蛋白在胞內吞噬中的相互作用，探索Mtb的胞內免疫機制。

1 Mtb對于胞內吞噬過程的影響

吞噬是胞內抵抗病原菌感染的重要防御機制之一。吞噬過程包括了病原菌識別、吞噬體的形成、吞噬溶酶體成熟、病原菌降解4個階段。Mtb首先被機體吞噬細胞如巨噬細胞表面Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)等識別后，內吞進入細胞內形成吞噬體，通過菌體成分干擾和阻止胞內吞噬，細菌能在胞內存活和增殖。由此可見，Mtb菌體成分與吞噬過程的相互作用決定了其胞內吞噬的結局。

1.1 Mtb脂質對胞內吞噬的影響

Mtb脂質是Mtb的主要毒性因子，與結核病的發(fā)生密切相關。Mtb存在大量脂質，如脂阿拉伯甘露聚糖(mannose-capped lipoarabinomannan，ManLAM)等。ManLAM廣泛分布于Mtb表面，是一種復雜的脂聚糖，它能與甘露糖受體(mannose receptor，MR)結合，進而介導Mtb吞噬。而且ManLAM還能阻斷吞噬體與溶酶體的融合，幫助細菌在胞內存活[4]。此外，有些Mtb脂類可通過調節(jié)ManLAM來影響胞內吞噬過程。P27是牛型結核分枝桿菌等表達的一種分泌型表面糖脂蛋白，因其能與P55共同協(xié)助Man-LAM組裝和轉運到細胞表面，故P27缺失時，可導致細菌表面Man-LAM表達減少，進而促進巨噬細胞內吞噬體的成熟[5]。此外，P27還能通過與DC-SIGN受體結合，介導Mtb與宿主間的黏附。Mtb細胞壁脂質成分PDIM(phthiocerol dimycocerosates)與Mtb胞內逃逸相關。PDIM可通過排出吞噬體膜中空泡質子ATP酶來阻斷吞噬體的酸化，也能通過增加吞噬體膜通透性和造成膜損傷來幫助細菌存活和增殖[6]。

1.2 Mtb蛋白質對胞內吞噬的影響

目前已知結核分枝桿菌能夠產(chǎn)生多種酶類，如蛋白激酶G(protein kinase G，PKnG)、酪氨酸激酶A(tyrosine kinase A，PtKA)等。PKnG類似于蛋白激酶，可通過增加胞內信號傳導來阻止吞噬體和溶酶體的融合，干擾吞噬體成熟；另一方面，PKnG也具有泛素激活酶和泛素連接酶功能，能夠調節(jié)腫瘤壞死因子受體相關因子2(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2，TRAF2)和β-TGF活化激酶1(TGF-beta-activated kinase 1，TAK1)的泛素化和降解來抑制NF-κB通路激活，從而抑制機體免疫力[7]。PtKA缺失時，Mtb不能抑制吞噬體酸化，導致巨噬細胞內細菌死亡[8]。此外，Mtb H37Rv菌株產(chǎn)生的蘋果酸合酶(malate synthase，MS)GlcB是一種幫助Mtb在缺氧環(huán)境中以甘油為碳源增殖時必需的酶類。當GlcB缺失時，Mtb與溶酶體標志物LAMP1共定位增加，細菌載量增加，提示GlcB能夠阻止吞噬體成熟[9]。肌微管素相關蛋白4(myotubularin-related protein-4，MTMR4)是一種肌微管素-3-磷酸磷脂酰肌醇磷酸酶，表達減少時能夠升高巨噬細胞表面免疫球蛋白受體FcγRs(Fc gamma receptors)的表達，并增加3-磷酸磷脂酰肌醇[phosphatidylinositol 3-phosphate，PtdIns(3)P]在吞噬體膜上持續(xù)的時間，從而抵抗海洋分枝桿菌誘導的吞噬體阻斷作用[10]。此外，PtpA、SapM等磷脂酶缺失時，海洋分枝桿菌可招募更多的Ptdlns3P，故磷脂酶參與了分枝桿菌的胞內逃逸機制，而且PtpA還可通過阻斷V-ATP酶的招募來減少含菌囊泡的酸化，阻斷吞噬體成熟[11]。Rv3091屬于馬鈴薯糖蛋白樣磷脂酶家族，能夠促進結核分枝桿菌從巨噬細胞吞噬體中逃逸，促進細菌的胞內存活[12]。O-甘露糖轉移酶(protein O-mannosyl transferase，PMT)能夠催化結核分枝桿菌O-甘露糖基化蛋白。PMT缺失時，恥垢分枝桿菌不能阻斷吞噬體和溶酶體的融合，導致巨噬細胞內細菌增殖減少，同時也引起細胞分泌TNF-α和IL-6減少[13]。

除了酶類外，Mtb還能產(chǎn)生WhiB3、Rv3463等蛋白質。Wbl家族蛋白WhiB3是結核分枝桿菌whiB編碼的一種對氧化還原反應敏感的轉錄因子，能夠檢測細菌內氧化還原電勢。其在囊泡內酸性pH環(huán)境中調節(jié)胞質內放線硫醇氧化還原電勢(EMSH)，從而阻斷吞噬體的成熟。此外，WhiB3除了通過改變多聚乙酰脂合成來阻止吞噬體的成熟外，也能夠通過緩解由過氧化氫異丙苯、過氧化氫和酸化亞硝酸鹽和過氧亞硝酸鹽導致的氧化還原壓力[14]。Rv3463是從Mtb培養(yǎng)懸液中分離得到的一種蛋白質，它能促進Mtb與早期吞噬體標志(如Rab5、VPS34)，及晚期吞噬體標志Rab7共定位，幫助吞噬體成熟。轉染Rv3463的恥垢分枝桿菌感染小鼠后，小鼠載菌量明顯減少，這些結果提示Rv3463可通過促進吞噬來減少Mtb的感染[15]。Mtb產(chǎn)生的分泌性蛋白ESAT-6(the 6-kDa early secreted antigenic target)，又稱EsxA，是ESX-1型VII分泌系統(tǒng)的一種關鍵效應分子。ESAT-6與PDIM作用相似，能夠破壞吞噬體膜，PDIM還能促進ESAT-6的作用，而且ESAT-6還能誘導細胞IFN-Ⅰ的產(chǎn)生[16]，或誘導巨噬細胞線粒體中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD-2)來幫助細菌存活[17]。此外，ESAT-6還可通過促進HIF1α基因表達來增強巨噬細胞的吞噬能力[18]。ESX-1還可通過下調miR-147-3p來抑制促進海洋分枝桿菌的存活[19]。

2 Rab蛋白對Mtb胞內吞噬過程的影響

Rab GTP酶是小GTP酶Ras超家族中最大的成員之一，目前在人體中已發(fā)現(xiàn)超過70種Rab蛋白。編碼Rab蛋白的基因約為600 bp，序列保守性較高，在不同物種間其序列同源性高達75%～95%。Rab蛋白約含有200個氨基酸，具有一些共同的結構特征，如G結構域等。Rab蛋白與GTP結合后活化，行使調節(jié)胞內膜轉運的功能；而當Rab蛋白與GDP結合，Rab蛋白處于失活狀態(tài)。這一轉換過程受到鳥苷酸交換因子(GMP exchange factors，GEFs)和GTP酶活化蛋白(GTPase-activating protein，GAPs)的調控。Rab蛋白在真核生物內幾乎所有膜相關細胞器中均存在，調節(jié)胞內各種生命活動，包括胞內吞噬作用。

最早有關Rab蛋白調節(jié)Mtb吞噬作用的研究主要是分離Mtb吞噬體，檢測Rab蛋白的表達差異。強毒株Mtb吞噬體招募的Rab蛋白與普通病原菌和弱毒株Mtb均不同，這表明Rab蛋白在Mtb吞噬中具有獨特的作用，具有深入研究的價值。

2.1 Rab5和Rab7

Rab5和Rab7分別是早期吞噬體和晚期吞噬體的標志，常用于吞噬體成熟過程的檢測，在麻風病患者的病變皮膚中表達較高。BCG吞噬體僅能夠募集Rab5，不能募集Rab7。在鳥型結核分枝桿菌研究中發(fā)現(xiàn)類似結果：無論野生型Rab5、活化型Rab5(Q79L Rab5)還是抑制型Rab5(S34N Rab5)均能被募集至骨髓來源的巨噬細胞(bone marrow-derived macrophages，BMMs)內吞噬體上；而野生型Rab7、抑制型Rab7(S22N Rab7)和活化型Rab7(Q67L Rab7)并不能。后證實Rab7能夠被募集到Mtb吞噬體上，但募集后很快被釋放。這可能與活BCG感染抑制Rab7效應分子RILP(Rab7-interacting lysosomal protein)募集，進而阻止了活化型Rab7與RILP的相互作用，阻斷晚期吞噬體形成有關。同時也可能是由于Mtb感染促進吞噬體上Rab7釋放，進而導致Rab7-RILP-動力蛋白/動力蛋白激活蛋白復合物分解，從而阻斷吞噬體與溶酶體的融合[20]。Rab7還通過影響脂滴與吞噬體之間的相互作用來調節(jié)結核分枝桿菌吞噬[21]。

2.2 Rab10蛋白

Rab10最早是在犬腎上皮細胞系MDCK細胞中被檢測到，它參與了基底膜蛋白的胞內轉運。Rab10能夠較Rab5更早地被募集至吞噬體，敲除Rab10或者抑制型Rab10可延遲含熱處理Mtb吞噬體的成熟；而過表達Rab10或活化型Rab10能夠部分地促進吞噬體的成熟[22]，從而促進Mtb的胞內清除，有些miRNA，如miR378d下調時可導致Rab10表達增加，從而促進巨噬細胞吞噬清除細菌[23]。

2.3 Rab14蛋白

Rab14定位于早期內吞體、高爾基體和轉運高爾基體等膜結構，參與了這些膜結構的胞內轉運過程。沉默Rab14或抑制型Rab14表達時，能夠促進Mtb吞噬體成熟。相反，過表達Rab14或活化型Rab14表達時，Mtb吞噬體成熟受阻，維持早期吞噬體特征[24]。

2.4 Rab20蛋白

Rab20定位于高爾基體、內質網(wǎng)以及其他內吞體，屬于干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)誘導可產(chǎn)生的GTP酶，其在活動性肺結核病患者的痰液標本中表達較高。沉默Rab20或抑制型Rab20表達時能促進吞噬體的成熟，同時縮短吞噬體上Rab5存在的時間。但Rab20并不影響Mtb的存活。此外，Rab20能夠募集Rab5鳥苷酸交換因子Rabex5至吞噬體，能短暫地增加吞噬體上活化型Rab5的表達[25]，使得Mtb吞噬體更久地維持在早期吞噬體階段。

3 Mtb通過調節(jié)Rab蛋白而影響胞內吞噬過程

有關Mtb菌體成分通過調節(jié)Rab蛋白而影響胞內吞噬作用的研究已有報道，如PknG。Rab7L1(小鼠Rab29)與細胞內膜-反面高爾基體網(wǎng)絡(trans-Golgi network，TGN)的完整性相關，能夠調節(jié)從高爾基體到溶酶體的轉運過程，能夠被募集到含菌吞噬體上。PknG缺失的恥垢分枝桿菌和BCG能夠在敲除Rab7L1的巨噬細胞內存活，當PknG存在時， 能夠阻止Rab7L1轉變成Rab7L1-GTP，導致吞噬溶酶體形成受阻[26]。

4 問題與展望

Mtb胞內吞噬過程十分復雜，涉及到Mtb菌體成分與胞內吞噬過程的相互作用。一方面，Mtb可通過3條途徑來調節(jié)吞噬過程(圖1)：第一，抑制吞噬溶酶體酸化，減少吞噬細胞對細菌的清除；第二，阻斷吞噬體成熟過程，幫助細菌在胞內長期存活；第三， 破壞吞噬體膜， 增加胞質內細菌的免疫逃逸。

另一方面，不同Rab蛋白在Mtb吞噬中作用不同，如活化型Rab10等能夠抑制Mtb吞噬，而抑制型Rab14等具有阻斷Mtb吞噬作用。雖然已有Mtb菌體成分與Rab蛋白在胞內吞噬過程中的相互作用方面的研究，但目前仍然比較少，許多問題尚未解決。如哪些Rab蛋白在Mtb胞內吞噬中發(fā)揮了關鍵作用，哪些Mtb菌體成分能夠調控Rab蛋白來阻斷吞噬途徑。這些方面的深入研究將有利于揭示Mtb胞內免疫機制，為結核病的治療和疫苗的研發(fā)提供新的思路和研究靶點。

圖1 結核分枝桿菌菌體成分對胞內吞噬作用的示意圖Fig 1 Schematic diagram indicating the effect of the components of M.tuberculosis on intracellular phagocytosis