右美托咪定通過(guò)HIF-1α對(duì)缺血性腦卒中線粒體功能的調(diào)控*

張?chǎng)?梅靜 張宇軒 李瑞軒 陳哲徐 徐桂萍

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院麻醉科，新疆 烏魯木齊 830001)

缺血性腦卒中(Ischemia stroke, IS)是一種嚴(yán)重威脅中老年人健康的腦血管疾病[1-2]。目前IS主要以靜脈溶栓等方式恢復(fù)缺血區(qū)血流，但這常會(huì)伴隨再灌注損傷的風(fēng)險(xiǎn)。其機(jī)制包括活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的生成和釋放，線粒體凋亡途徑啟動(dòng)，線粒體結(jié)構(gòu)的破壞[3]。如何減輕IS治療過(guò)程中再灌注損傷已成為目前國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。低氧誘導(dǎo)因子-1α (Hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α) 是機(jī)體應(yīng)對(duì)缺氧反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子[4]。缺氧條件下，由于線粒體呼吸鏈電子傳遞阻斷會(huì)造成ROS的大量產(chǎn)生，在此過(guò)程中，HIF-1α由于脯氨酰羥化酶的抑制而在細(xì)胞核中積累。然而已有研究表明，低氧環(huán)境中，HIF-1α可以通過(guò)多種途徑修復(fù)呼吸鏈損傷，轉(zhuǎn)變能量產(chǎn)生方式，減少細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生[5]。因此，HIF-1α表達(dá)增加可能是低氧環(huán)境下機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)通路的啟動(dòng)，對(duì)IS局部缺血區(qū)具有正向的調(diào)節(jié)作用。右美托咪定是一種選擇性α2腎上腺素受體激動(dòng)劑，具有良好的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用而被廣泛用于圍手術(shù)期的各個(gè)過(guò)程[6]。近年來(lái)研究表明右美托咪定對(duì)身體器官的缺血/再灌注損傷具有明顯保護(hù)作用，涉及線粒體功能的保護(hù)，氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)的抑制[7-8]。然而，右美托咪定對(duì)于HIF-1α信號(hào)通路調(diào)節(jié)研究鮮少。因此，本研究擬通過(guò)腦缺血再灌注模型構(gòu)建，探究HIF-1α在右美托咪定調(diào)節(jié)IS神經(jīng)功能與梗死面積中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 48只SPF級(jí)健康的雄性大鼠，7周齡，體質(zhì)量220～250g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK(新)2018-0001。所有大鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房中，恒溫(22±2)℃，恒濕(60±5)%，日常采用日光燈采光，周期為12h，自由飲食攝水。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的操作和處理過(guò)程全部遵守《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理?xiàng)l例》及《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)定》，并經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 鹽酸右美托咪定(美國(guó)MCE公司，純度：98.54%，批號(hào)：420397)；YC-1(美國(guó)MCE公司，純度：99.48%，批號(hào)：370255)；腦缺血線栓(廣州佳靈生物科技公司，型號(hào)：L3200，批號(hào)：1020-1905)；戊巴比妥鈉(上海思域化工科技有限公司，批號(hào)：394003)，乙酰水楊酸(麥克林試劑公司，批號(hào)：M390293)，2, 3, 5-三苯基氯化四氮唑(TTC，北京索萊寶生物科技公司)溶液；線粒體分離試劑盒(上海碧云天生物科技公司，批號(hào)：379843)；BCA試劑盒(上海碧云天生物科技公司，批號(hào)：463721)；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(南京建成生物科技公司，批號(hào)：A350-17)；線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ試劑盒(南京建成生物科技公司，批號(hào)：A659-20)；谷胱甘肽(GSH)試劑盒(南京建成生物科技公司，批號(hào)：A673-31)；ATP檢測(cè)試劑盒(南京建成生物科技公司，批號(hào)：A932-13)；HIF-1α(武漢三鷹生物科技公司，批號(hào)：4304-1583)與β-actin(武漢三鷹生物科技公司，批號(hào)：4307-1674)。分光光度儀(上海元析儀器公司，型號(hào)：AA3800)；熒光酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司，型號(hào)：Fluoroskan FL)；凝膠電泳裝置(美國(guó)Biorad公司，型號(hào)：Mini-protean Tetra)；化學(xué)發(fā)光成像儀(上海天能生物公司，型號(hào)：5200)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與方案 大鼠入組后隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦缺血組、右美托咪定組、右美托咪定+YC-1組，每組12只。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，開展中動(dòng)脈缺血/再灌注模型的構(gòu)建，在中動(dòng)脈封閉后，根據(jù)不同的分組腹腔注射右美托咪定或者YC-1，參考文獻(xiàn)中藥物劑量，右美托咪定為50 μg/kg[9]，YC-1劑量為5 mg/kg[10]。假手術(shù)組與腦缺血組大鼠腹腔注射生理鹽水，2 h后拔出線栓，恢復(fù)缺血區(qū)血流，24 h后開展神經(jīng)功能評(píng)估測(cè)試。最后，處死所有大鼠，取腦組織開展腦梗死體積染色、線粒體功能評(píng)估，氧化/還原因子檢測(cè)與Western blot。

1.4 中動(dòng)脈缺血/再灌注模型構(gòu)建 參考文獻(xiàn)[11]中改進(jìn)的Longa線栓法構(gòu)建中動(dòng)脈缺血/再灌注模型。取非假手術(shù)組大鼠麻醉(0.3%戊巴比妥鈉，腹腔注射，0.1～0.15 mL/10g)，固定于鼠板上，頸部消毒、開口并分離出左側(cè)頸動(dòng)脈，夾閉頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈并結(jié)扎頸外動(dòng)脈。頸外動(dòng)脈開口，插入線栓，前進(jìn)至頸內(nèi)動(dòng)脈約16 mm。固定線栓，待中動(dòng)脈缺血2 h，麻醉大鼠(若蘇醒則補(bǔ)加0.1 mL戊巴比妥鈉)，拔出線栓并結(jié)扎，縫合傷口。假手術(shù)組大鼠麻醉后，分離出頸動(dòng)脈血管，不插線栓。所有動(dòng)物手術(shù)過(guò)程中使用保溫毯維持體溫，在術(shù)后接受鎮(zhèn)痛/抗炎治療(乙酰水楊酸 5 mg/kg)。參考文獻(xiàn)[12]中改進(jìn)的神經(jīng)功能缺損評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)再灌注24h大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)估，總分由0分至18分，其中0分代表神經(jīng)功能正常，評(píng)分增加代表神經(jīng)功能損傷加重。測(cè)試內(nèi)容包括：提尾測(cè)試，運(yùn)動(dòng)測(cè)試，感覺測(cè)試，平衡測(cè)試，反射評(píng)估和不正常運(yùn)動(dòng)評(píng)估。

1.5 腦梗死體積占比評(píng)估 將大鼠處死，取完整腦組織，-20℃環(huán)境中冷凍變硬，切成5片，約2 mm。將切片浸潤(rùn)于2% TTC溶液中，37℃避光孵育，每5 min翻動(dòng)一次，共30 min。染色后，將切片按順序排列，拍照后分析梗死區(qū)面積，最終計(jì)算得出梗死體積占比。TTC染色原理是正?；罴?xì)胞組織存在脫氫酶，將TTC還原成紅色甲臜化合物，但梗死區(qū)細(xì)胞死亡，脫氫酶活力喪失，無(wú)法還原TTC。

1.6 大鼠線粒體指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 大鼠腦組織線粒體分離 腦缺血再灌注后24 h，大鼠處死后分離腦組織，按照質(zhì)量∶體積=1∶4的比例加入PMSF溶液與預(yù)冷的線粒體分離緩沖液混合溶液勻漿。將勻漿液在1000 r/min條件下離心10 min，取上清液。將上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離心管中，在15000 r/min條件下離心10 min，得到沉淀即為線粒體。將線粒體沉淀以100 μL分離緩沖液重懸，通過(guò)BCA法測(cè)定線粒體蛋白濃度。

1.6.2 線粒體膜電位檢測(cè) 取新鮮分離的線粒體樣品，采用JC-1熒光探針檢測(cè)線粒體膜電位。用PBS洗滌線粒體樣品，取試劑盒中incubation buffer，混勻并預(yù)熱至37℃。吸取100 μL incubation buffer，加入10 μL JC-1試劑，渦旋混勻配成JC-1工作液，加入10 μg的線粒體樣品，37℃孵育15 min，混勻細(xì)胞，使用熒光酶標(biāo)儀掃描激發(fā)波長(zhǎng)550 nm，發(fā)射波長(zhǎng)600 nm條件下紅色熒光與激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)535 nm條件下綠色熒光。最終結(jié)果以紅色/綠色相對(duì)熒光強(qiáng)度表示線粒體膜電位，比值高表明線粒體膜電位正常。

1.6.3 大鼠腦組織線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性測(cè)定 取新鮮分離的線粒體樣品，測(cè)試原理與步驟如下：復(fù)合物Ⅰ通常稱為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶Q還原酶(NADH-CoQ)，基于輔酶Q底物，在魚藤酮存在的情況下，通過(guò)復(fù)合物Ⅰ催化轉(zhuǎn)化成還原型泛醌，同時(shí)還原型NADH轉(zhuǎn)化為氧化型NADH，造成340 nm處吸收峰值的降低，由此測(cè)定復(fù)合物Ⅰ的活性。移取780 μL緩沖液(reagent A)至新的比色皿中，加入100 μL 反應(yīng)液(regent B)，再加入20 μL底物液(reagent D)，30℃條件下孵育3 min，加入10 μg線粒體樣品蛋白，混勻后在分光光度儀下檢測(cè)，樣品活性讀數(shù)：0分鐘時(shí)(340波長(zhǎng)讀數(shù)-380波長(zhǎng)讀數(shù))-3分鐘時(shí)(340波長(zhǎng)讀數(shù)-380波長(zhǎng)讀數(shù))。復(fù)合物Ⅱ通常稱為琥珀酸-輔酶Q還原酶，基于琥珀酸底物，通過(guò)復(fù)合物Ⅱ的催化氧化為富馬酸，同時(shí)氧化型二氯酚靛酚(Dichlorophenal-indophenol, DCPIP)被還原，造成600 nm處吸光度值降低，由此測(cè)定復(fù)合物Ⅱ的活性。移取780 μL緩沖液(reagent A)至新的比色皿中，加入100 μL 反應(yīng)液(regent B)，再加入20 μL底物液(reagent D)，30℃條件下孵育3 min，加入10 μg線粒體樣品蛋白，混勻后在分光光度儀下檢測(cè)，樣品活性讀數(shù)：0分鐘時(shí)(600波長(zhǎng)讀數(shù))～5分鐘時(shí)(600波長(zhǎng)讀數(shù))。復(fù)合物Ⅲ通常稱為輔酶Q-細(xì)胞色素C還原酶，基于還原型輔酶Q底物，在抗霉素存在的情況下，通過(guò)復(fù)合物Ⅲ的催化，轉(zhuǎn)化為泛醌或輔酶Q，同時(shí)氧化型細(xì)胞色素C轉(zhuǎn)化為還原型細(xì)胞色素C，造成550 nm處吸光值的降低，由此測(cè)定復(fù)合物Ⅲ的活性。移取870 μL GENMED緩沖液(reagent A)至新的比色皿中，加入10 μL GENMED反應(yīng)液(regent B)，再加入20 μL GENMED底物液(reagent D)，室溫下靜置10 min，加入20 μL GENMED專性液(reagent E)，加入15 μg線粒體樣品蛋白，混勻后在分光光度儀下檢測(cè)，樣品活性讀數(shù)：2分鐘時(shí)(550波長(zhǎng)讀數(shù))～0分鐘時(shí)(550波長(zhǎng)讀數(shù))。

1.7 腦組織中谷胱甘肽、ROS和ATP水品檢測(cè) 取大鼠缺血區(qū)組織，按質(zhì)量∶體積=1∶4加入PBS勻漿，3000 r/min條件下離心后取上清液備用。谷胱甘肽是由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成的三肽，基于還原型GSH可與二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)反應(yīng)，生成一種黃色化合物，在405 nm下可以通過(guò)比色定量測(cè)定，結(jié)果以熒光強(qiáng)度表示。分別取一只酶管和非酶管，加入0.2 mL 1 mmol/L的GSH溶液與0.2 mL待測(cè)勻漿，37℃反應(yīng)5 min，加入0.1 mL試劑一應(yīng)用液，37℃反應(yīng)5 min。3000 r/min條件下離心10 min，取1 mL上清液，加入1 mL試劑三應(yīng)用液，0.25 mL 試劑四應(yīng)用液液與0.05 mL試劑五應(yīng)用液，混勻后室溫靜置15 min，分光光度儀在412nm條件下檢測(cè)各管OD值。由于DCFH-DA(2,7-Dichlorofuorescin Diacetate)探針可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜，當(dāng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，會(huì)被水解為DCFH，在活性氧存在條件下，被氧化為強(qiáng)綠色熒光物質(zhì)DCF。取勻漿后細(xì)胞懸液，加入DCFH-DA熒光探針，避光孵育30～60 min，3000 r/min條件下離心，收集細(xì)胞沉淀，PBS重懸。使用分光光度儀在激發(fā)波長(zhǎng)502 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm處檢測(cè)DCF熒光強(qiáng)度，結(jié)果以熒光強(qiáng)度表示。由于肌酸激酶催化ATP和肌酸生成磷酸肌酸，可以通過(guò)檢測(cè)磷鉬酸來(lái)反映ATP含量。取30 μL樣本，加入100 μL 底物I，200 μL底物Ⅱ， 30 μL 促進(jìn)劑，混勻后水浴30 min。加入50 μL 沉淀劑，充分混勻后，4000 r/min離心5 min，取上清液300 μL與500 μL顯色液，混勻，室溫靜置2 min，加入500 μL終止劑，室溫靜置5 min，使用分光光度儀在636 nm處檢測(cè)各管OD值，根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算出ATP含量。

1.8 HIF-1α蛋白表達(dá)檢測(cè) 提取分離大鼠缺血區(qū)組織，按質(zhì)量∶體積=1∶4加入RIPA裂解液，在冰上研磨成單細(xì)胞懸液，離心(12000 r/min, 10 min)后取上清液，加入5×上樣緩沖液，蛋白煮沸變性后開展SDS-PAGE電泳。每個(gè)樣品孔加入10 μg樣品，設(shè)置電泳分離條件為30V/30min，90V/60min，待上樣緩沖液到達(dá)膠底。截取目標(biāo)蛋白條帶并開展?jié)穹ㄞD(zhuǎn)膜，設(shè)置轉(zhuǎn)膜條件為2mA/60min。PBST清洗，2%牛血清蛋白封閉2 h。PBST清洗，滴加檢測(cè)Anti-HIF-1α或Anti-β-actin一抗稀釋液，4℃孵育過(guò)夜。次日取出條帶，PBST清洗，孵育二抗稀釋液，滴加ECL發(fā)光液顯影，獲得條帶后使用ImageJ軟件進(jìn)行分析，最終結(jié)果以HIF-1α與β-actin蛋白灰度值的比值表示。

2 結(jié)果

2.1 右美托咪定對(duì)IS大鼠神經(jīng)功能的影響 假手術(shù)組大鼠未進(jìn)行插線栓操作，神經(jīng)功能評(píng)分為0分，腦缺血組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分增加，癥狀表現(xiàn)為前肢屈曲，單側(cè)轉(zhuǎn)圈且在平衡木上易于跌落；與腦缺血組比較，右美托咪定組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分減少(P<0.05)。與右美托咪定組相比，右美托咪定+YC-1組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯增加(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的比較Table 1 Comparison of neurological scores of rats in each group

2.2 右美托咪定對(duì)IS大鼠缺血區(qū)梗死的影響 假手術(shù)組大鼠沒有插入線栓，大腦切片TTC染色呈現(xiàn)為紅色，但腦缺血組缺血側(cè)腦組織展現(xiàn)出明顯的白色區(qū)域，即梗死區(qū)域；與腦缺血組相比，右美托咪定組大鼠缺血側(cè)梗死體積占比明顯減少(P<0.05)；然而，與右美托咪定組相比，右美托咪定+YC-1組大鼠缺血側(cè)梗死體積占比明顯增加(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 各組大鼠腦梗死區(qū)域染色Figure 1 Staining of cerebral infarct area of rats in each group

表2 各組大鼠腦梗死區(qū)域占比的比較Table 2 Percentage of cerebral infarct area of rats in each group

2.3 右美托咪定對(duì)IS大鼠缺血區(qū)細(xì)胞線粒體膜電位的影響 與假手術(shù)組相比，腦缺血組JC-1水平明顯降低(P<0.05)；與腦缺血組相比，右美托咪定組JC-1水平明顯增加(P<0.05)；與右美托咪定組相比，右美托咪定+YC-1組JC-1水平明顯減少(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠線粒體膜電位的比較Table 3 Comparison of mitochondrial membrane potential of rats in each group

2.4 右美托咪定對(duì)IS大鼠缺血區(qū)細(xì)胞線粒體復(fù)合物活性的影響 與假手術(shù)組相比，腦缺血組線粒體復(fù)合物Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ活性明顯減少(P<0.05)；與腦缺血組相比，線粒體復(fù)合物Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ活性明顯提高(P<0.05)；與右美托咪定組相比，右美托咪定+YC-1組線粒體復(fù)合物Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ活性明顯升高(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠線粒體復(fù)合物活性的比較Table 4 Comparison of mitochondrial complex activity of rats in each group

2.5 右美托咪定對(duì)IS大鼠缺血區(qū)GSH、ROS與ATP水平的影響 與假手術(shù)組相比，腦缺血組大鼠缺血區(qū)GSH水平增加，ROS水平明顯升高(P<0.05)，而ATP水平明顯減少；與腦缺血組相比，右美托咪定組大鼠缺血區(qū)GSH與ATP水平明顯增加，且ROS水平明顯降低(均P<0.05)；與右美托咪定組相比，右美托咪定+YC-1組大鼠缺血區(qū)GSH與ATP水平明顯降低，但ROS水平明顯升高(均P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠GSH、ROS與ATP水平的比較Table 5 Comparison of GSH, ROS and ATP levels of rats in each group

2.6 右美托咪定對(duì)IS大鼠缺血區(qū)HIF-1α蛋白的影響 與假手術(shù)組相比，腦缺血組大鼠缺血區(qū)HIF-1α蛋白增加；與腦缺血組相比，右美托咪定組大鼠缺血區(qū)HIF-1α蛋白明顯增加(P<0.05)；與右美托咪定組相比，右美托咪定+YC-1組大鼠缺血區(qū)HIF-1α蛋白明顯降低(P<0.05)。見圖2、表6。

圖2 各組大鼠HIF-1α蛋白表達(dá)Figure 2 HIF-1αprotein expression of rats in each group

表6 各組大鼠HIF-1α蛋白表達(dá)的比較Table 6 Comparison of HIF-1α protein expression of rats in each group

3 討論

IS是神經(jīng)內(nèi)科及圍手術(shù)期常見的病理?yè)p傷，常表現(xiàn)為口眼歪斜，半身不遂的癥狀[13]。本研究參考Longa線栓法構(gòu)建了大鼠腦缺血/再灌注模型[8]，結(jié)果顯示腦缺血組大鼠出現(xiàn)與臨床相似的病理特征[14]，即前肢無(wú)法完全伸展，行走困難，且腦組織中出現(xiàn)梗死區(qū)域。因此，本研究腦缺血/再灌注模型成功模擬了IS患者溶栓后可能出現(xiàn)的再灌注損傷的現(xiàn)象。

尋找安全高效的腦保護(hù)藥對(duì)于IS的治療具有重要臨床意義。近年來(lái)，右美托咪定作為臨床麻醉過(guò)程中常用藥物，被發(fā)現(xiàn)具有抗腦缺血/再灌注損傷的作用，但其機(jī)制尚未完全闡明[4-5]。本研究中，在大鼠腦缺血發(fā)生后，給予右美托咪定發(fā)現(xiàn)大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分明顯減少，且梗死體積的百分比明顯減少。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和ATP合成的主要場(chǎng)所，是為細(xì)胞生命活動(dòng)提供能量的重要細(xì)胞器[15]。在IS患者中，由于缺血區(qū)血流受阻，O2水平下降，線粒體呼吸鏈電子流傳遞受阻，從而產(chǎn)生ROS[16]。由于ROS累積會(huì)繼續(xù)攻擊線粒體，造成線粒體復(fù)合物活性的降低，在O2恢復(fù)后仍會(huì)出現(xiàn)線粒體呼吸鏈電子流傳遞阻滯的現(xiàn)象[3]。因此，研究中常報(bào)道部分IS患者恢復(fù)了血流后，會(huì)出現(xiàn)更嚴(yán)重的再灌注損傷的情況[17]。與此同時(shí)，再灌注損傷過(guò)程中往往會(huì)伴隨著線粒體膜電位下降，DNA損傷觸發(fā)和蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化，最終引起細(xì)胞功能障礙或死亡。本研究中也有顯示，與對(duì)照組相比，腦缺血組大鼠缺血區(qū)ROS水平升高，且線粒體膜電位明顯降低，線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ活性都明顯降低。與此同時(shí)，右美托咪定的干預(yù)明顯減少了缺血區(qū)ROS水平，且增加了ATP與GSH水平，此外，線粒體膜電位明顯增加，線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ活性都明顯升高。對(duì)應(yīng)著行為學(xué)指標(biāo)中，右美托咪定明顯提高了腦缺血大鼠神經(jīng)功能評(píng)分，且減少了大鼠的腦梗死體積占比。因此，線粒體呼吸鏈傳遞受阻是腦缺血后系列損傷的源頭和始動(dòng)環(huán)節(jié)，提高線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性是減輕再灌注損傷的繼發(fā)性關(guān)鍵因素。

已有研究證實(shí)，HIF-1α在線粒體功能障礙中的發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用[18]。生理?xiàng)l件下，HIF-1α被迅速降解，但缺氧組織中，因?yàn)檠鯕鉂舛冉档蛯?dǎo)致羥基化酶無(wú)法發(fā)揮作用，脯氨酸羥基化無(wú)法實(shí)現(xiàn)，進(jìn)而HIF-1α無(wú)法被泛素化蛋白酶體水解，最終HIF-1α水平增加[19]。本研究也有顯示，HIF-1α在腦缺血組大鼠缺血區(qū)表達(dá)增加，且GSH水平升高。此外，在右美托咪定的作用下，HIF-1α表達(dá)與GSH水平繼續(xù)增加。因此，HIF-1α可能是缺氧環(huán)境中，機(jī)體避免氧化應(yīng)激內(nèi)源性保護(hù)通路的起點(diǎn)[20]。有研究表明，HIF-1α 在缺氧期間通過(guò)多種途徑降低 ROS 水平，包括：通過(guò)將細(xì)胞色素c氧化酶亞基 COX4-1 轉(zhuǎn)換為 COX4-2 來(lái)提高復(fù)合體 IV 的效率；丙酮酸脫氫酶激酶1將丙酮酸從線粒體中分流，而乳酸脫氫酶A的誘導(dǎo)將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸[21-22]。此外，在BNIP3的誘導(dǎo)下，觸發(fā)線粒體選擇性自噬，在溶酶體中將受損的線粒體溶解為新裂變的線粒體提供能量[23-24]。本研究結(jié)果也表明，在HIF-1α抑制劑YC-1的作用下，相比于右美托咪定組，線粒體復(fù)合物Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ活性都出現(xiàn)了明顯的降低，與腦缺血組水平相似，且ROS水平明顯升高，而GSH水平降低。最終，行為學(xué)方面也有顯示，腦缺血大鼠神經(jīng)功能評(píng)分增加，且腦梗死體積占比增加。

4 結(jié)論

HIF-1α表達(dá)上調(diào)激活了機(jī)體內(nèi)源性抗氧化通路，在腦缺血后恢復(fù)血流的過(guò)程中，通過(guò)提高線粒體復(fù)合體活性，促進(jìn)了呼吸鏈中電子流的傳遞，降低缺血區(qū)ROS水平，最終減少了大鼠缺血區(qū)腦死體積占比，改善了大鼠神經(jīng)功能。