暴馬桑黃赤霉素合成基因GGPS的克隆及誘導(dǎo)表達(dá)

劉增才，唐玉倩，佟鑫宇，鄒 莉

（東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

桑黃是一類大型藥用真菌的統(tǒng)稱，隸屬于刺革菌科，桑黃孔菌屬。目前桑黃孔菌屬在世界范圍內(nèi)已知種有12 個(gè)，其種類常與其生長(zhǎng)的樹(shù)木之間存在較強(qiáng)的專一寄生關(guān)系[1]。暴馬桑黃是寄生在暴馬丁香樹(shù)上的桑黃，研究發(fā)現(xiàn)暴馬桑黃中含有多種藥用活性成分，如多糖、黃酮、三萜等[2]，在治療各種疾病上發(fā)揮主要藥用功效。傳統(tǒng)研究中，暴馬桑黃常用于痢疾、血崩、盜汗、經(jīng)閉、脾虛泄瀉等疾病的治療[1-3]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，暴馬桑黃在保護(hù)肝臟、調(diào)節(jié)免疫、降低血糖、抗腫瘤等方面具有顯著功效。Jeon 等[4]在研究暴馬桑黃提取物對(duì)四氯化碳導(dǎo)致的大鼠肝損傷實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，暴馬桑黃提取物能夠阻斷四氯化碳引起的過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性降低，對(duì)肝損傷能夠起到很好的保護(hù)作用。Kim 等[5]發(fā)現(xiàn)暴馬桑黃多糖與β-葡聚糖相比，能夠表現(xiàn)出更廣泛的免疫刺激活性。不僅能夠提高T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫水平，還能在B 細(xì)胞上作為多克隆激活劑。并且桑黃多糖還被發(fā)現(xiàn)能夠顯著降低大鼠血糖[6]。張林芳等[7]研究結(jié)果表明，暴馬桑黃總?cè)颇軌蛞种瓢┘?xì)胞MCF-7 的增殖，同時(shí)還能夠誘導(dǎo)MCF-7 凋亡，在利用暴馬桑黃菌絲和子實(shí)體對(duì)照實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，暴馬桑黃子實(shí)體對(duì)MCF-7 抑制增殖和凋亡方面表現(xiàn)更好。隨著暴馬桑黃藥用特性研究不斷深入，暴馬桑黃在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用前景十分廣闊，市場(chǎng)上對(duì)暴馬桑黃的需求量也不斷增加。目前市場(chǎng)上的暴馬桑黃子實(shí)體多為野生資源，而人工馴化暴馬桑黃子實(shí)體也正在積極探索，現(xiàn)在僅在實(shí)驗(yàn)室有小規(guī)模試驗(yàn)栽培，難以滿足生產(chǎn)需要[8-10]。其主要原因是暴馬桑黃生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)理尚不清晰，難以實(shí)現(xiàn)工廠化栽培。隨著分子生物技術(shù)不斷發(fā)展，利用基因工程定向培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的暴馬桑黃菌株成為一種可靠的技術(shù)手段。

赤霉素（GA）是一類重要的生長(zhǎng)激素，主要從植物和微生物中提取獲得。研究表明，赤霉素不僅能促進(jìn)植物的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)[11-12]，而且對(duì)細(xì)菌、真菌的生長(zhǎng)發(fā)育也有明顯促進(jìn)作用[13]。赤霉素作為一類二萜化合物，是通過(guò)甲羥戊酸途徑（mevalonate pathway，MVA）合成的。首先利用MVA 途徑合成前體物質(zhì)法呢基焦磷酸（farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP），然后FPP 在第一個(gè)二萜合成關(guān)鍵酶牻牛兒基焦磷酸合酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPS）的催化下，生成牻牛兒基焦磷 酸（geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP），GGPP 再經(jīng)過(guò)一系列酶促反應(yīng)最終合成赤霉素[14]，代謝途徑如圖1所示。目前GGPS基因已經(jīng)在茶樹(shù)[15]、丹參[16]、雨生紅球藻[17]等多種生物中被成功克隆，但在暴馬桑黃中還未見(jiàn)GGPS基因的有關(guān)報(bào)道。

圖1 赤霉素生物合成途徑Fig.1 The biosynthesis pathway of GA

茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）常作為一種外源誘導(dǎo)劑，是次生代謝中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子[18]。其通過(guò)調(diào)節(jié)次生代謝途徑中轉(zhuǎn)錄因子的活性，轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)而影響相應(yīng)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，最終決定次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。在靈芝研究中發(fā)現(xiàn)，MeJA 的誘導(dǎo)能夠顯著提高靈芝次生代謝產(chǎn)物三萜合成途徑中關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄水平，同時(shí)上調(diào)靈芝三萜含量[19]。同樣，本實(shí)驗(yàn)室前期研究中發(fā)現(xiàn)MeJA 能夠促進(jìn)暴馬桑黃次生代謝產(chǎn)物三萜合成途徑中關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄，并促進(jìn)三萜含量的積累[20]。但MeJA 對(duì)次生代謝產(chǎn)物赤霉素含量及合成途徑基因轉(zhuǎn)錄水平的影響還未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)通過(guò)PCR 擴(kuò)增技術(shù)克隆得到暴馬桑黃GGPS基因及其啟動(dòng)子序列，測(cè)序后進(jìn)行生物信息學(xué)分析；隨后用MeJA 誘導(dǎo)暴馬桑黃菌絲體，并檢測(cè)誘導(dǎo)后的暴馬桑黃菌絲體中GGPS基因轉(zhuǎn)錄水平，赤霉素含量及菌絲體生物量的變化；最后將GGPS基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體驗(yàn)證其表達(dá)情況。本試驗(yàn)結(jié)果可為闡明暴馬桑黃GGPS基因功能的研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為培育暴馬桑黃優(yōu)質(zhì)品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

暴馬桑黃菌種DL101，大腸桿菌克隆菌株Top10，大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)以及原核表達(dá)載體pET-32a 保存于本實(shí)驗(yàn)室。植物基因組DNA 提取試劑盒，植物總RNA 提取試劑盒，瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒均購(gòu)于北京天根生化公司。質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自于上海Omega公司。聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司。限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ，Premix Taq 酶，TB Green ? Premix Ex Taq ? Ⅱ（Tli RNaseH Plus）酶，pMD18-T 載體，5×In-Fusion HD 試劑盒，PrimeScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒，PrimeScript ? RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒均購(gòu)自大連Takara 公司。MeJA 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。其余所需藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)引物

利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)所需特異性引物，試驗(yàn)過(guò)程中用于目的基因克隆、啟動(dòng)子克隆、熒光定量分析及PCR 檢測(cè)的引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列?Table 1 Primer sequence

1.2.2 SbGGPS 啟動(dòng)子與基因克隆

分別采用植物基因組DNA 提取試劑盒與植物總RNA 提取試劑盒提取暴馬桑黃總DNA 和總RNA，并將得到的總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以暴馬桑黃DNA 為模板，GGPS-pro-F1和GGPSpro-R1（表1）為引物進(jìn)行SbGGPS啟動(dòng)子PCR 擴(kuò)增；另以cDNA 為模板，GGPS-F1和GGPS-R1（表1）為引物擴(kuò)增SbGGPS基因。2 種擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后，分別與PMD18-T 載體過(guò)夜連接，再轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top10 感受態(tài)細(xì)胞。以M13F-47、M13R-48（表1）為引物進(jìn)行菌落PCR 檢測(cè)，結(jié)果呈陽(yáng)性的菌液送至哈爾濱擎科生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

得到SbGGPS啟動(dòng)子及基因序列后，利用Neural Network Promoter Prediction、PlantCARE 等在線軟件對(duì)啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)子區(qū)和作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；利用軟件ProtParam、TMHMM、SignalP、Euk-mPLoc、SPOMA、Swiss-Model 對(duì)SbGGPS基因編碼的氨基酸序列的理化特性、信號(hào)肽、跨膜區(qū)、亞細(xì)胞定位以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)[21]。并用MEGA5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 MeJA 誘導(dǎo)

將培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的暴馬桑黃菌絲接種到PD培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)10 d，然后使用勻漿儀打碎菌絲體，打碎后的均勻菌絲體作為種子菌液。吸取10 mL 種子菌液接種到250 mL PD 培養(yǎng)基中，在搖床中25 ℃、180 r /min 培養(yǎng)8 d，然后分別向搖瓶中添加無(wú)菌水、吐溫-20（助劑）及不同濃度MeJA（100、150、200、250、300）處理菌絲體48 h。收集MeJA 誘導(dǎo)后的暴馬桑黃菌絲體分為三部分：第一部分用于熒光定量分析，第二部分用于赤霉素含量測(cè)定，第三部分用于生物量測(cè)定。

1.2.5 熒光定量分析

采用植物總RNA 提取試劑盒提取MeJA 誘導(dǎo)后的暴馬桑黃菌絲體總RNA，用Prime Script ? RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒將總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以得到的cDNA 為模板，GGPS-F2、GGPS-R2為引物進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)。根據(jù)得到的不同Ct 值，以α-tubulin基因?yàn)閮?nèi)參（表1），按照公式2-ΔΔCt計(jì)算不同濃度MeJA 誘導(dǎo)的暴馬桑黃菌絲體中SbGGPS基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平[23]。

1.2.6 赤霉素含量測(cè)定

赤霉素含量測(cè)定方法及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制參照肖志壯等[24]。將收集到的MeJA 誘導(dǎo)后的暴馬桑黃菌絲體分別用液氮迅速冷凍，并在研缽中研磨。稱取0.5 g 研磨后的樣品加入4.5 mL 70%的乙醇中溶解，5 000×g 離心10 min，將上清液用0.45 μm濾膜過(guò)濾。取0.5 mL 過(guò)濾后的樣品溶液進(jìn)行后續(xù)的反應(yīng)，反應(yīng)步驟與肖志壯等步驟相同，反應(yīng)液在412 nm 波長(zhǎng)條件下測(cè)定吸光值。

1.2.7 生物量測(cè)定

將收集到的MeJA 誘導(dǎo)后的暴馬桑黃菌絲體置于烘箱內(nèi)50℃烘干至恒重，然后用電子天平分別測(cè)定菌絲體干重。

1.2.8 SbGGPS 基因原核表達(dá)

用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ對(duì)pET-32a 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物用DNA 回收試劑盒純化回收。In-Fusion HD 試劑盒將質(zhì)粒酶切回收產(chǎn)物與SbGGPS基因片段（以GGPS-F3、GGPS-R3為引物擴(kuò)增得到）進(jìn)行同源重組，得到pET-32a-SbGGPS重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top10 感受態(tài)細(xì)胞中擴(kuò)增并重新提取，然后用引物pET-32a-F3、pET-32a-R3（表1）對(duì)提取到的質(zhì)粒進(jìn)行PCR 檢測(cè)，檢測(cè)正確的陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21 中，SDS-PAGE 試劑盒檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 SbGGPS 啟動(dòng)子及基因的克隆結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示（圖2），SbGGPS啟動(dòng)子在1 100 bp 左右出現(xiàn)一條特異片段，SbGGPS基因在 900 bp左右出現(xiàn)一條特異片段，與預(yù)測(cè)結(jié)果大小吻合。PCR 產(chǎn)物純化回收后連接PMD18-T 載體并轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top10 感受態(tài)細(xì)胞，檢測(cè)呈陽(yáng)性的菌液送至生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast 比對(duì)，確定為SbGGPS啟動(dòng)子和基因序列。

圖2 PCR 產(chǎn)物電泳檢測(cè)Fig.2 Electrophoresis detection of SbGGPS and the promoter product

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 SbGGPS 啟動(dòng)子分析

利用在線網(wǎng)站Neural Network Promoter Prediction 對(duì)SbGGPS啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，得分大于0.80 的核心啟動(dòng)子區(qū)共有3 個(gè)，其中454～504 bp（ccggagcttgca taagcggcgcggtaccctcctgcattcgTgtataccaa）之間是核心啟動(dòng)子區(qū)的概率最高，達(dá)到0.99，加粗的大寫(xiě)字母T 為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，說(shuō)明該部位最有可能是啟動(dòng)子上RNA 聚合酶結(jié)合的區(qū)域，其余兩處概率為0.82 和0.94。

利用在線網(wǎng)站PlantCARE 對(duì)SbGGPS啟動(dòng)子的作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)（圖3）。結(jié)果顯示該啟動(dòng)子具有典型的啟動(dòng)子保守序列CAAT-box（控制轉(zhuǎn)錄起始的頻率）和TATA-box（決定RNA 合成的起始位點(diǎn)），同時(shí)還有響應(yīng)MeJA 的信號(hào)分子元件CGTCA-motif，響應(yīng)厭氧誘導(dǎo)元件ARE，參與干旱誘導(dǎo)元件MBS。

圖3 SbGGPS 啟動(dòng)子的主要作用元件及位置Fig.3 The main cis-acting elements and positions of SbGGPS promoter

2.2.2 SbGGPS 基因及編碼蛋白分析

NCBI ORF finder 顯示，SbGGPS基因具有一個(gè)最大長(zhǎng)度為945 bp 的開(kāi)放閱讀框，編碼314 個(gè)氨基酸，具有IspA 保守結(jié)構(gòu)域，是Isoprenoid_Biosyn_C1 超家族成員。ProtParam 分析結(jié)果顯示，SbGGPS基因編碼的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為35.89 kDa，不穩(wěn)定系數(shù)為42.29，GRAVY 值為-0.366，表明該蛋白是不穩(wěn)定的親水性蛋白。TMHMM 預(yù)測(cè)SbGGPS 氨基酸序列（1～314 位）全部在膜外，不具有跨膜結(jié)構(gòu)（圖4A）。SignalP 預(yù)測(cè)SbGGPS 蛋白不存在信號(hào)肽序列（圖4B）。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，SbGGPS 蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)。使用SOPMA 對(duì)SbGGPS 蛋白的二維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示該序列中處于α 螺旋狀態(tài)的氨基酸為58.28%，處于延伸鏈狀態(tài)為6.69%，處于β 轉(zhuǎn)角狀態(tài)為5.10%，處于無(wú)規(guī)則卷曲狀態(tài)為29.93%，說(shuō)明蛋白質(zhì)中除了含量最豐富的α 螺旋外，該蛋白多數(shù)氨基酸處于無(wú)規(guī)卷曲狀態(tài)。使用Swissmodel對(duì)SbGGPS 蛋白三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，以疣孢青霉GGPS 蛋白三維結(jié)構(gòu)圖（6v0k.1.A）為模型進(jìn)行構(gòu)建，兩者序列相似度為52.4%，結(jié)果見(jiàn)圖4C。在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載與暴馬桑黃GGPS 具有較高同源性的氨基酸序列，采用MEGA 軟件進(jìn)行同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖4D）。結(jié)果表明暴馬桑黃GGPS 蛋白與真菌GGPS 蛋白同源性較高，與動(dòng)物（小鼠、褐家鼠）、細(xì)菌（谷氨酸棒桿菌、鮑氏不動(dòng)桿菌）、植物（梔子、簸箕柳）GGPS 蛋白同源性較低，符合生物進(jìn)化關(guān)系。

圖4 SbGGPS 蛋白生物信息學(xué)分析Fig.4 Bioinformatic analysis of the SbGGPS protein

2.3 MeJA 對(duì)SbGGPS 基因轉(zhuǎn)錄的影響

采用qRT-PCR 技術(shù)檢測(cè)經(jīng)過(guò)H2O、吐溫-20以及不同濃度MeJA 誘導(dǎo)后的暴馬桑黃菌絲體SbGGPS基因轉(zhuǎn)錄水平變化。檢測(cè)結(jié)果顯示（圖5），與對(duì)照組H2O 和吐溫-20 相比，MeJA 處理后SbGGPS基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯降低；且MeJA 濃度高于100 μmol·L-1后，對(duì)SbGGPS基因轉(zhuǎn)錄水平的抑制作用更加顯著；SbGGPS基因轉(zhuǎn)錄水平最低的是經(jīng)過(guò)150 μmol·L-1MeJA 處理的一組，僅為對(duì)照組（H2O）的2/5 左右。

圖5 不同濃度MeJA 處理下的SbGGPS 基因轉(zhuǎn)錄水平Fig.5 The transcript level of SbGGPS gene under different MeJAconcentrations

2.4 MeJA 對(duì)暴馬桑黃菌絲赤霉素含量的影響

采用分光光度法測(cè)定經(jīng)過(guò)H2O、吐溫-20 以及不同濃度MeJA 誘導(dǎo)后的暴馬桑黃菌絲體中赤霉素含量。檢測(cè)結(jié)果顯示（圖6），經(jīng)過(guò)外源物質(zhì)處理后的暴馬桑黃菌絲體中赤霉素含量均呈顯著性下降，而MeJA 誘導(dǎo)后的暴馬桑黃菌絲體中赤霉素含量下降趨勢(shì)明顯。經(jīng)過(guò)250 μmol·L-1MeJA 處理的一組赤霉素含量最低（0.33 mg·g-1），僅為對(duì)照組（H2O）的2/5 左右。

圖6 不同濃度MeJA 處理下的暴馬桑黃菌絲體赤霉素含量Fig.6 GA content of S.baumii mycelium under different MeJA concentrations

2.5 MeJA 對(duì)暴馬桑黃菌絲體生物量的影響

分別稱量經(jīng)H2O、吐溫-20 以及不同濃度MeJA 誘導(dǎo)后暴馬桑黃菌絲體的生物量。由圖7可以看出，MeJA 濃度的升高，使得暴馬桑黃菌絲體生物量明顯下降；經(jīng)過(guò)300 μmol·L-1MeJA 處理的一組生物量最低（2.82 g·L-1），僅為對(duì)照組（H2O）的3/5 左右。

圖7 不同濃度MeJA 處理下的暴馬桑黃菌絲體生物量Fig.7 Biomass of S.baumii mycelium under different MeJA concentrations

2.6 相關(guān)性分析

為研究MeJA 誘導(dǎo)對(duì)SbGGPS基因轉(zhuǎn)錄水平、赤霉素含量及生物量的影響，分別對(duì)其進(jìn)行Pearson 相關(guān)分析（表2）。結(jié)果顯示MeJA 與SbGGPS基因轉(zhuǎn)錄水平、赤霉素含量及生物量均呈顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明隨著MeJA 濃度的升高，對(duì)SbGGPS基因轉(zhuǎn)錄水平、赤霉素含量及生物量均有顯著抑制作用。隨后利用Pearson 分析了MeJA 誘導(dǎo)下SbGGPS基因轉(zhuǎn)錄水平、赤霉素含量及生物量三者之間的相關(guān)性（表2），結(jié)果表明SbGGPS基因轉(zhuǎn)錄水平、赤霉素含量、生物量?jī)蓛芍g均呈顯著正相關(guān)關(guān)系。說(shuō)明SbGGPS基因可能在暴馬桑黃菌絲生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要作用，通過(guò)調(diào)節(jié)赤霉素的合成，進(jìn)而影響菌絲體生物量。

表2 Pearson 相關(guān)性分析?Table 2 Pearson correlations analysis

2.7 SbGGPS 基因原核表達(dá)

將構(gòu)建成功的pET-32a-SbGGPS重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）中，用1 mmol·L-1IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。SDS-PAGE結(jié)果顯示，在經(jīng)過(guò)2、4、6、8h 和10 h 的誘導(dǎo)后，轉(zhuǎn)化后的菌體均表達(dá)出一條56.89 kDa 左右的蛋白條帶，與預(yù)測(cè)條帶大小一致（SbGGPS 蛋白35.89 kDa+標(biāo)簽蛋白21 kDa），而且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)目的蛋白表達(dá)量逐漸增加，且總體處于較高表達(dá)水平。

3 結(jié)論與討論

圖8 SDS-PAGE 分析SbGGPS 基因誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物Fig.8 Results of the expression of SbGGPS in E.coli BL21 by SDS-PAGE analysis

3.1 討 論

啟動(dòng)子是RNA 聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的一段DNA 序列。一個(gè)高效啟動(dòng)子能夠顯著增加基因的轉(zhuǎn)錄水平。Johanson 等[25]研究發(fā)現(xiàn)使用基因自身啟動(dòng)子能顯著增加基因自身的表達(dá)水平，并可將產(chǎn)物濃度提高3 倍以上。目前食藥用菌遺傳轉(zhuǎn)化體系仍存在轉(zhuǎn)化效率低的問(wèn)題[26]，為了提高遺傳轉(zhuǎn)化效率，現(xiàn)在食藥用菌轉(zhuǎn)基因研究中逐漸使用基因同源啟動(dòng)子，這樣有利于受體細(xì)胞調(diào)控因子的識(shí)別，減少甲基化，提高轉(zhuǎn)化效率[27]。通過(guò)對(duì)SbGGPS啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)，該啟動(dòng)子在454～504 bp 之間為核心啟動(dòng)區(qū)的概率達(dá)到0.99，表明克隆得到的啟動(dòng)子片段含有轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵區(qū)域。作用元件分析發(fā)現(xiàn)，SbGGPS啟動(dòng)子含有決定基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵順式作用元件TATA-box和CAAT-box。為響應(yīng)外界物質(zhì)的誘導(dǎo)脅迫，啟動(dòng)子通常還包含多種其他作用元件，包括MeJA 的信號(hào)分子元件CGTCA-motif，響應(yīng)厭氧誘導(dǎo)元件ARE，參與干旱誘導(dǎo)元件MBS 等。上述結(jié)果初步說(shuō)明克隆到的SbGGPS啟動(dòng)子序列具有正常的調(diào)控轉(zhuǎn)錄功能，并且能夠響應(yīng)外界的誘導(dǎo)和脅迫。

對(duì)暴馬桑黃赤霉素生物合成途徑中的功能基因研究有助于利用分子手段獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的暴馬桑黃菌株。本試驗(yàn)通過(guò)PCR 克隆獲得SbGGPS基因cDNA 序列全長(zhǎng)，序列分析顯示SbGGPS基因具有完整開(kāi)放閱讀框，其編碼的蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白；同時(shí)該蛋白不具有跨越細(xì)胞器膜的結(jié)構(gòu)和引導(dǎo)蛋白的信號(hào)肽，且定位在細(xì)胞質(zhì)中，說(shuō)明其既不是跨膜蛋白也不是分泌蛋白，與前人研究結(jié)果相吻合[14-15]。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建結(jié)果顯示，暴馬桑黃GGPS 蛋白與褐絨蓋牛肝菌、紫芝、灰樹(shù)花等真菌GGPS 蛋白同源性最高，與動(dòng)物（小鼠、褐家鼠）次之，與細(xì)菌（谷氨酸棒桿菌、鮑氏不動(dòng)桿菌）和植物（梔子、簸箕柳）同源性較低，符合生物進(jìn)化關(guān)系，這一結(jié)果在唇形科植物GGPS蛋白物種同源性研究中也被證實(shí)過(guò)[14]。

通過(guò)MeJA 誘導(dǎo)來(lái)增加次生代謝物的產(chǎn)量是研究者常用的技術(shù)手段，并且收到的效果也十分顯著。Ketchum 等[28]發(fā)現(xiàn)MeJA 的誘導(dǎo)使紅豆杉細(xì)胞生產(chǎn)次生代謝物紫杉醇的速度加快，在250 μmol·L-1MeJA 最佳濃度誘導(dǎo)下，紫杉醇濃度能夠達(dá)到23.4 mg·L-1·d-1。Jiao 等[29]發(fā)現(xiàn)MeJA 誘導(dǎo)可以促進(jìn)黃芪材料中次生代謝物三萜皂苷的生物合成，157.4 μmol·L-1MeJA 處理18.4 h 能夠使三萜皂苷含量達(dá)到最大，是未處理對(duì)照的2.1 倍。同時(shí)，MeJA 誘導(dǎo)次生代謝物三萜產(chǎn)量增加在靈芝和暴馬桑黃中也都被證實(shí)[19-20]。但是，本研究發(fā)現(xiàn)MeJA 對(duì)次生代謝物赤霉素的含量及其合成途徑中的關(guān)鍵基因SbGGPS的表達(dá)產(chǎn)生明顯的抑制作用，并且嚴(yán)重影響暴馬桑黃菌絲體的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致其生物量的減少。由此可推測(cè)MeJA 增加其他次生代謝產(chǎn)物的積累很可能是通過(guò)抑制赤霉素合成途徑關(guān)鍵基因表達(dá)，導(dǎo)致前體底物法呢基焦磷酸更多地流向三萜或其他合成途徑（圖1），從而實(shí)現(xiàn)三萜或其他次生代謝產(chǎn)物的增加。結(jié)果分析中也發(fā)現(xiàn)SbGGPS啟動(dòng)子上具有MeJA 響應(yīng)元件，暗示MeJA 很可能通過(guò)作用某個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)而抑制啟動(dòng)子上的CGTCA-motif 元件，降低SbGGPS基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而影響赤霉素的產(chǎn)量，最后降低了暴馬桑黃菌絲體的生物量，該推測(cè)還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證[18]。

此外，我們通過(guò)構(gòu)建SbGGPS基因原核表達(dá)載體來(lái)驗(yàn)證其表達(dá)水平。結(jié)果表明目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功且目的蛋白含量明顯高于雜蛋白，說(shuō)明SbGGPS基因在原核系統(tǒng)中表達(dá)效果良好。在未來(lái)研究中，我們將構(gòu)建真核表達(dá)載體，進(jìn)一步證明SbGGPS基因在暴馬桑黃生長(zhǎng)發(fā)育中的作用機(jī)理。

3.2 結(jié) 論

本研究成功克隆到SbGGPS基因cDNA 全長(zhǎng)（945 bp），其編碼的蛋白質(zhì)不含信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)，能夠在大腸桿菌中表達(dá)。MeJA 誘導(dǎo)顯著抑制SbGGPS基因表達(dá)，同時(shí)使赤霉素含量和生物量明顯降低，很可能是SbGGPS啟動(dòng)子上的CGTCAmotif 元件響應(yīng)MeJA 誘導(dǎo)的結(jié)果。試驗(yàn)初步證實(shí)SbGGPS基因參與暴馬桑黃菌絲生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，并起著重要調(diào)節(jié)作用。