藍(lán)莓果渣中總黃酮的提取工藝優(yōu)化

張 齊，張圣煜，王俊穎

（安徽科技學(xué)院食品工程學(xué)院，安徽 鳳陽 233100）

藍(lán)莓的果肉及果殼在食品研發(fā)的過程中具有很高的營養(yǎng)價(jià)值[1]，其蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維C含量豐富，除此之外，類黃酮、花青素、多酚類也包含其中。隨著藍(lán)莓果汁和果醬產(chǎn)品的發(fā)展與衍生，在其生產(chǎn)過程中產(chǎn)生了許多藍(lán)莓果渣[2-5]。關(guān)于此類工藝對藍(lán)莓果渣利用率不高，但是藍(lán)莓果渣中可用物質(zhì)非常多，如果能提高果渣利用率，不僅可以節(jié)約資源，也可以避免環(huán)境污染，是學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界應(yīng)該盡快解決的問題[6-8]。

黃酮類化合物有2種存在方式，其一是游離的苷元，其二是與糖等結(jié)合的苷[9-11]。類黃酮具有很好的醫(yī)學(xué)功效，是一種抗氧化劑，有改善血液循環(huán)、降低膽固醇、減少心肌氧耗氧量、明顯緩解心攪拌痛、預(yù)防心肌梗塞和心律失常的效果[12-14]。作為健康食品的一種功能因子被列舉出來。因此，為了藍(lán)莓副產(chǎn)物得到充分利用，提高綜合使用價(jià)值，此試驗(yàn)以藍(lán)莓果渣作為原料，采用超聲波輔助的提取方法研究藍(lán)莓果渣中的類黃酮物質(zhì)，同時(shí)也為藍(lán)莓工業(yè)化生產(chǎn)黃酮類化合物提供一定的試驗(yàn)數(shù)據(jù)[15]。

當(dāng)今社會(huì)，人們對食品質(zhì)量的要求越來越高，尤其是對延緩衰老、美容保健等功能食品的需求加大[16-17]。藍(lán)莓果渣中含有的總黃酮具有延緩細(xì)胞衰老、抗癌的功能，是一種天然的抗氧化劑[18]。因此，藍(lán)莓果渣產(chǎn)品的開發(fā)及功能活性的研究，具有很高的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓果渣（制作藍(lán)莓果汁飲料及果酒所剩的殘?jiān)?；無水乙醇、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見光分光光度計(jì)，上海光譜儀制造有限公司產(chǎn)品；超聲波輔助清洗器，昆山超聲波設(shè)備有限公司產(chǎn)品；電子天平，上海浦春計(jì)量儀器有限公司產(chǎn)品；離心機(jī)，上海天美科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；萬能粉碎機(jī)，上海隆拓儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

藍(lán)莓果渣黃酮提取過程如下：

藍(lán)莓果渣→洗凈烘干→粉碎→超聲波輔助提?。ㄒ掖冀幔x心過濾→紫外分光光度計(jì)檢測。

1.3.2 測定指標(biāo)與方法

測定指標(biāo)：藍(lán)莓果渣總黃酮提取率。

測定方法：具體步驟如下：

（1）稱取干燥的藍(lán)莓果渣粉末3.0 g，使用體積分?jǐn)?shù)65%的乙醇溶液浸提藍(lán)莓果渣粉末，超聲波輔助提取。

（2）設(shè)置離心機(jī)參數(shù)，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心15 min，放入提取液，離心后保留上清液。

（3）設(shè)置分光光度計(jì)參數(shù)，波長為510 nm，將空白對照組與樣品置于其中，測定其吸光度A。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制圖過程如下：

（1）稱取10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶解于體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液，定容于50 mL容量瓶中。

（2）將樣品均分為6份，稱量6組蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，體積分別為0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，10.0 mL，分別置于25 mL容量瓶，加入5%的亞硝酸鈉溶液1.00 mL，搖勻靜置6 min；再加入10%硝酸鋁溶液1.00 mL，搖勻靜置6 min；最后加入4%的氫氧化鈉溶液10 mL，用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇定容，搖勻，放置15 min[19]。

（3）和空白組對照一起置于波長510 nm處測定吸光度。

根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，作出標(biāo)準(zhǔn)的蘆丁回歸曲線及方程，藍(lán)莓果渣中總黃酮提取率（Y）的計(jì)算公式為：

式中：Y總——藍(lán)莓果渣總黃酮的提取率，%；

V總——提取液的總體積，mL；

m——稱取的藍(lán)莓果渣粉的質(zhì)量，mg；

C——樣品提取液中藍(lán)莓果渣總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL。

2 試驗(yàn)方法

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對藍(lán)莓果渣中總黃酮提取效果的影響

取5份藍(lán)莓果渣粉，每份3.0 g。根據(jù)工藝流程，在料液比為1∶20，超聲溫度為70℃，超聲時(shí)間2 h固定的條件下。改變乙醇體積分?jǐn)?shù)，設(shè)置5個(gè)水平分別為45%，55%，65%，75%，85%，分組進(jìn)行試驗(yàn)，測定不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)對工藝的影響，得出最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

乙醇體積分?jǐn)?shù)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 乙醇體積分?jǐn)?shù)因素與水平設(shè)計(jì)/%

2.1.2 料液比對藍(lán)莓果渣中總黃酮提取效果的影響

取5份藍(lán)莓果渣粉，每份3.0 g。根據(jù)工藝流程，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，超聲溫度為70℃，超聲時(shí)間2 h固定的條件下。改變提取料液比，設(shè)置5個(gè)水平分別為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，分組進(jìn)行試驗(yàn)，測定不同比例的料液比對工藝的影響，得出最佳的料液比。

料液比因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 料液比因素與水平設(shè)計(jì)/g∶mL

2.1.3 超聲時(shí)間對藍(lán)莓果渣中總黃酮提取效果的影響

取5份藍(lán)莓果渣粉，每份3.0 g。根據(jù)工藝流程，在料液比1∶20，乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，超聲溫度70℃固定的條件下。改變超聲時(shí)間，設(shè)置5個(gè)水平分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h，分組進(jìn)行試驗(yàn)。測定不同的超聲時(shí)間對工藝的影響，得出最佳超聲時(shí)間。

超聲時(shí)間因素與水平設(shè)計(jì)見表3。

表3 超聲時(shí)間因素與水平設(shè)計(jì)t/h

2.1.4 超聲溫度對藍(lán)莓果渣中總黃酮提取效果的影響

取5份藍(lán)莓果渣粉，每份3.0 g。根據(jù)工藝流程，在料液比1∶20，乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，超聲時(shí)間為2 h固定的條件下。改變超聲溫度，設(shè)置5個(gè)水平為55，60，65，70，75℃，分組進(jìn)行試驗(yàn)。測定不同的超聲溫度對工藝的影響，得出最佳超聲溫度。

超聲溫度因素與水平設(shè)計(jì)見表4。

表4 超聲溫度因素與水平設(shè)計(jì) θ/℃

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

采用Design Expert 12.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。以3個(gè)影響因素作為試驗(yàn)參數(shù)，設(shè)計(jì)出方案和變量水平。

響應(yīng)面水平見表5。

表5 響應(yīng)面水平

3 結(jié)果與分析

3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，得到回歸方程的公式為：

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對藍(lán)莓果渣中總黃酮提取效果的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對藍(lán)莓果渣中總黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對藍(lán)莓果渣中總黃酮提取率的影響

由圖2可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為45%～65%時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，藍(lán)莓果渣中的總黃酮也在增加，乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時(shí)達(dá)到最高，提取率為1.62%。除此之外，倘若繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，藍(lán)莓果渣中所有黃酮的提取率下降，提取率變化不再顯著。原因是總黃酮難以溶于水，乙醇體積分?jǐn)?shù)低的情況下，水分含量高，總黃酮的溶出量低。因此，由單因素試驗(yàn)而選取乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%。

3.2.2 料液比對藍(lán)莓果渣中總黃酮提取效果的影響

料液比對藍(lán)莓果渣中總黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 料液比對藍(lán)莓果渣中總黃酮提取率的影響

由圖3可知，最佳料液比為1∶20，此時(shí)藍(lán)莓果渣中總黃酮提取率最高。從1∶10增加到1∶20時(shí)，藍(lán)莓果渣中總黃酮提取率都有上升趨勢，1∶20時(shí)最多達(dá)到最大值1.63%。當(dāng)料液比從1∶20增加到1∶30時(shí)，此時(shí)可以看到出現(xiàn)拐點(diǎn)，提取率開始下降。通過分析試驗(yàn)得出結(jié)論，主要原因是溶劑量在不斷增加，隨著總黃酮的浸出量不斷增加，藍(lán)莓果渣里的總黃酮的含量有限，所以最后有部分溶于酒精的雜質(zhì)析出影響了總黃酮的析出。因此在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取料液比為1∶20。

3.2.3 超聲時(shí)間對藍(lán)莓果渣中總黃酮提取效果的影響

超聲時(shí)間對藍(lán)莓果渣中總黃酮提取率的影響見圖4。

圖4 超聲時(shí)間對藍(lán)莓果渣中總黃酮提取率的影響

由圖4可知，最佳超聲時(shí)間為2 h，此時(shí)藍(lán)莓果渣中總黃酮提取率最高，從0.5 h增加到2 h時(shí)，藍(lán)莓果渣中總黃酮提取率都有上升趨勢，2 h最多達(dá)到最大值1.59%。當(dāng)時(shí)間從2 h增加到2.5 h時(shí)，此時(shí)可以看到出現(xiàn)拐點(diǎn)，提取率開始下降。經(jīng)分析可能是因?yàn)槌晻r(shí)間的越來越長，原料和溶液的接觸時(shí)間就越來越多，所以藍(lán)莓果渣中所有黃酮的浸出就越多。因此，由單因素試驗(yàn)的結(jié)果可以得出超聲時(shí)間為2 h為最佳條件。

3.2.4 超聲溫度對藍(lán)莓果渣中總黃酮提取效果的影響

超聲溫度對藍(lán)莓果渣中總黃酮提取率的影響見圖5。

由圖5可知，超聲溫度為55～70℃時(shí)，提取率隨溫度上升而增加，在溫度為70℃時(shí)總黃酮的提取率在峰值。在溫度范圍為70～75℃時(shí)，隨著溫度的下降，果渣總黃酮提取率也在下降。在70℃以上提取率降低，這是因?yàn)樵诟邷囟认滤械狞S酮類物質(zhì)都容易氧化，以至于總黃酮的結(jié)構(gòu)被破壞，提取率會(huì)下降。因此，通過單因素試驗(yàn)將超聲溫度設(shè)定為70℃。

圖5 超聲溫度對藍(lán)莓果渣中總黃酮提取率的影響

3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

通過單因素的試驗(yàn)結(jié)果制定響應(yīng)面試驗(yàn)水平數(shù)據(jù)。

響應(yīng)面水平選取見表6，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表7，超聲提取藍(lán)莓渣中總黃酮提取率二次多項(xiàng)式模型方差分析見表8，超聲波提取藍(lán)莓果渣中總黃酮得率回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)見表9。

表6 響應(yīng)面水平選取

表7 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表8 超聲提取藍(lán)莓渣中總黃酮提取率二次多項(xiàng)式模型方差分析

表9 超聲波提取藍(lán)莓果渣中總黃酮得率回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

根據(jù)Design Expert 12.0軟件二次回歸分析的結(jié)果，得到回歸方程為：

根據(jù)上述方程式的方差分析表可知，試驗(yàn)所選用模型p＜0.000 1較為明顯，失擬項(xiàng)在p=0.258 4＞0.05不顯著，R2=0.993 0，R2Adj=0.984 0，由以上分析可得，預(yù)測值和試驗(yàn)值之間具有較高的相關(guān)性[20]。

3.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比2個(gè)因素分析圖見圖6。

乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比對藍(lán)莓果渣中總黃酮提取效果的影響。由圖6可知，在時(shí)間控制2 h不變時(shí)，改變乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比，提取率呈現(xiàn)出先上升后下降。等高線圖中乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，料液比為1∶20時(shí)，藍(lán)莓果渣中總黃酮達(dá)到最高的提取率。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比2個(gè)因素分析圖

乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時(shí)間2個(gè)因素分析圖見圖7。

乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時(shí)間對藍(lán)莓果渣中總黃酮提取效果的影響。由圖7可知，控制料液比1∶20條件不變時(shí)，超聲時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)的共同作用影響著總黃酮的提取率。固定超聲時(shí)間，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮提取率先是上升后是下降，轉(zhuǎn)折體積分?jǐn)?shù)出現(xiàn)在65%。固定乙醇體積分?jǐn)?shù)，增加超聲時(shí)間，總黃酮提取率趨勢與上述相同，先上升后下降，轉(zhuǎn)折時(shí)間為2 h。根據(jù)等高線圖可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，超聲時(shí)間為2 h時(shí)，藍(lán)莓果渣中總黃酮提取率達(dá)到最高點(diǎn)。

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時(shí)間2個(gè)因素分析圖

料液比和超聲時(shí)間2個(gè)因素分析圖見圖8。

料液比和超聲時(shí)間對藍(lán)莓果渣中總黃酮提取效果的影響。由圖8可知，控制乙醇體積分?jǐn)?shù)65%不變時(shí)，超聲提取時(shí)間和料液比的共同作用影響著總黃酮提取率。固定提取時(shí)間，增加料液比，總黃酮的提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。再通過改變時(shí)間而不改變料液比，提取率先上升后下降。等高線圖中可以看出料液比為1∶20，超聲時(shí)間為2 h時(shí)，藍(lán)莓果渣中總黃酮提取率達(dá)到最高點(diǎn)。

圖8 料液比和超聲時(shí)間2個(gè)因素分析圖

3.3.3 最佳工藝條件及驗(yàn)證試驗(yàn)

由響應(yīng)面圖分析可知，最佳的參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)64.774%，料液比1∶20.475，超聲時(shí)間2.080 h，通過擬合方程預(yù)測得到總黃酮提取率為1.825%。優(yōu)化試驗(yàn)數(shù)據(jù)制定驗(yàn)證試驗(yàn)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)64.7%，料液比1∶20.5，超聲時(shí)間2.1 h，得出藍(lán)莓果渣中總黃酮提取率為1.81%，在該最優(yōu)提取工藝條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證性試驗(yàn)，與模型預(yù)期值基本一致，說明響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)可行。

優(yōu)化工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見表10。

表10 優(yōu)化工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果/%

4 結(jié)論

研究藍(lán)莓果渣總黃酮的提取工藝，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的結(jié)果得知該模型擬合性良好。經(jīng)過響應(yīng)面工藝優(yōu)化確定出在乙醇體積分?jǐn)?shù)為64.7%，料液比為1∶20.5，超聲時(shí)間2.1 h，超聲溫度70℃條件下。此時(shí)藍(lán)莓果渣中總黃酮的實(shí)際提取率達(dá)到最高為1.81%。研究優(yōu)化了藍(lán)莓果渣中總黃酮提取率的工藝，得到的結(jié)果為日后果渣提取工藝提供了一定的試驗(yàn)基礎(chǔ)。