銀翹清咽顆粒中IL-6調控成分的篩選和HPLC同時測定各組分含量

陳健勇，許俏苑

（廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院），廣東廣州 510095）

上呼吸道感染為常見多發(fā)病癥，寒熱交替、環(huán)境潮濕和人群密集時猶易爆發(fā)[1]。除注意時常清洗手、口、鼻，加強鍛煉，注意環(huán)境通風等良好衛(wèi)生、生活習慣養(yǎng)成外，西醫(yī)多根據病癥及相關生化指標使用非甾體抗炎藥、抗生素或抗病毒藥進行治療[2-3]。中醫(yī)則將該病癥歸為濕氣、寒邪入侵[4]，治療也以行氣解表，清熱解毒等為主[5]。銀翹清咽顆粒由我院臨床驗方改進、優(yōu)化所得，主要藥味為金銀花、連翹、板藍根、大青葉、升麻等，具有清熱解毒、利咽消腫、行氣解表的功效，常用于外感風寒所致的流涕、咳嗽[6-8]。研究表明，中藥治療上呼吸道感染的機制，可能與其調控機體白介素-6（ⅠL-6）水平密切相關[9-11]。ⅠL-6是機體內調控多種免疫反應的重要遞質，當機體發(fā)生炎癥反應或出現細菌、病毒感染等異常狀況時，ⅠL-6水平出現不同程度的升高并向病變部位聚集[12-13]。因此，找到并評價銀翹清咽顆粒中ⅠL-6調控活性成分，并建立同時、準確測定這些成分含量的方法，是研究該制劑功效機理和物質基礎的重要途徑。

1 儀器、試劑和材料

1.1 儀器Ⅴarioskan Flash全波長多功能酶標儀（美國Thermo公司）；Waters 2695高效液相色譜儀（美國Waters公司），配備PDA檢測器，自動進樣器和柱溫箱；Mettler-Toledo精密分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 試藥、材料和試劑 綠原酸（批號110753-201817，純度96.1%）、連翹苷（批號：110821-201816，純 度94.9%）、腺苷（批號：110879-201703，純度99.7%）、靛玉紅（批號：110717-201805，純度99.1%）、升麻素苷（批號：111522-201913，純度94.6%）、橙皮苷（批號：110721-201818，純度95.3%）、柚皮苷（批號：110722-201815，純度93.5%）購自中國食品藥品檢定研究院（中國）；表告依春（批號：B-014，純度98%）購自成都瑞芬思生物科技有限公司（中國），直鐵線蓮寧B為實驗室制備，經UⅤ測定純度98%以上。THP-1細胞液購自ATCC公司（美國），分子生物學實驗和HPLC分析用DMSO、乙腈、磷酸均為色譜純，購自Merck（德國），供試品制備用甲醇為分析純，購自廣州化學試劑廠（中國）；ELⅠSA試劑盒購自Abcam公司；銀翹清咽顆粒（批號：J1808002-1～3、J1902001-1～4、J1907005-1～3）系廣東省第二中醫(yī)院制劑室制備。

2 實驗方法與結果

2.1 ⅠL-6調控活性成分篩選 精密吸取THP-1細胞液100μL，依次加入培養(yǎng)基、各組分對照品單體溶液（DMSO溶液，25mmol），一 抗（ⅠL-6抗 體，批號：ab234570）、二抗（鼠-ⅠgG，批號：ab189578），按試劑盒說明書和文獻報道方法處理[12]，酶標儀測定各組熒光量，將結果與對照組（僅加入DMSO）進行比較。所得測定值結果（相對表達值）代入SPSS軟件中，使用one way-ANOVA檢驗進行數據分析，對比各給藥組與對照組的差異。結果表明，綠原酸、連翹苷、腺苷、靛玉紅、表告依春、直鐵線蓮寧B、升麻素苷等成分具有較為明顯的調控活性（P＜0.01），橙皮苷、柚皮苷與對照組比較無顯著性差異（P＞0.05），結果見圖1。

圖1 各成分ⅠL-6調控活性

2.2 含量測定樣品制備方法

2.2.1 混合對照品溶液制備方法 取綠原酸、連翹苷、腺苷、靛玉紅、表告依春、直鐵線蓮寧B、升麻素苷對照品，分別精密稱定約1mg，置于同一10mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得上述各化合物含量均為100μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備方法 取銀翹清咽顆粒，精密稱取約5g，置于25mL具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，密塞，精密稱重，超聲處理30min，取出，冷卻后精密稱重，加50%甲醇補足減失重量，0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 HPLC同時測定方法 取對照品和供試品溶液，使用Agilent EC C18色譜柱（柱長250mm，直徑4.6mm，粒徑5μm），0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動相，梯度洗脫，程序：0～15min，90%-75%A；15～25min，75%-50%A；25～40min，50%-10%A；40～55min，10%-10%A；55～60min，10%-90%A。流 速1.0mL/min，檢測波長254nm，進樣量10μL，柱溫30℃。記錄對照品和供試品色譜圖，并進行峰指認，將供試品中峰面積≥對照品中峰面積10%的成分列為含量測定指標，所得色譜圖見圖2。

圖2 銀翹清咽顆粒含量測定供試品（A）和混合對照品（B，各成分濃度均為100μg/mL）色譜圖

2.4 含量測定方法學考察

2.4.1 線性關系考察 取綠原酸、連翹苷、腺苷對照品，精密稱取約2mg，置于同一5mL量瓶中，加50%甲醇溶解并定容至刻度，即得三種化合物濃度均為400μg/mL的溶液；精密吸取上述溶液適量，置于多個5mL量瓶中，加50%甲醇稀釋并定容至刻度，即得上述各成分濃度均為5、10、20、50、100、200μg/mL的溶液。吸取上述溶液，按“2.3”所述HPLC方法測定，記錄各成分峰面積，通過線性回歸計算標準曲線。得腺苷的標準曲線為y=31027x+24791（r2=0.9996），連翹苷的標準曲線為y=3690.3x-1767.9（r2=0.9997），綠原酸的標準曲線為y=6705.4x-358.69（r2=0.9997）。結果表明，本方法所測定結果在5～200μg/mL濃度范圍內呈線性關系。

2.4.2 精密度試驗 取同一批供試品溶液（批號：J1907005-1），按“2.2.2”所述方法制備供試品溶液，吸取所得溶液，按“2.3”所述HPLC方法測定，連續(xù)進樣6次，記錄各成分峰面積，計算峰面積的RSD。結果顯示，腺苷、綠原酸、連翹苷峰面積的RSD分別為0.83%、1.06%和1.22%，表明方法精密度良好。

2.4.3 重復性試驗 取同一批銀翹清咽顆粒（批號：J1907005-1），按“2.2.2”所述方法制備供試品溶液，共平行制備6份，吸取所得溶液，按“2.3”所述HPLC方法測定，記錄各成分峰面積，計算上述成分的含量和含量的RSD。結果顯示，腺苷、綠原酸、連翹苷含量的RSD分別為0.87%、1.31%和1.40%，表明方法重復性良好。

2.4.4 加樣回收率試驗 取銀翹清咽顆粒，精密稱取約2.5g，置于25mL錐形瓶中，精密加入綠原酸、連翹苷、腺苷混合對照品溶液適量（供試品中濃度見表1、表2、表3），分別記為低、中、高三個濃度，按“2.2.2”所述方法，自“精密加入50%甲醇25mL”起制備供試品溶液，每個濃度平行制備3份。取上述溶液，按“2.3”所述HPLC方法測定，記錄各成分峰面積，計算上述成分的含量、回收率和回收率的RSD。結果顯示，腺苷的平均回收率為98.61%、RSD為2.24%；綠原酸的平均回收率為100.70%、RSD為2.72%；連翹苷的平均回收率為100.24%、RSD為2.81%。上述結果表明方法準確度良好。

表2 綠原酸加樣回收率試驗結果（n=3）

表3 連翹苷加樣回收率試驗結果（n=3）

2.4.5 樣品穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，放置在自動進樣器中，分別于放置后0、2、4、6、8、12h按“2.3”所述HPLC方法測定，記錄各成分峰面積，計算上述成分的含量和含量的RSD。結果得腺苷、連翹苷、綠原酸含量的RSD分別為1.47%、1.05%和0.93%，表明方法所制備樣品在12h內穩(wěn)定性良好。

2.5 IL-6調控活性成分同時測定 取各批次銀翹清咽顆粒，按“2.2.2”所述方法制備供試品溶液，按“2.3”所述HPLC方法測定，記錄各成分峰面積，計算上述成分的含量。結果得腺苷、連翹苷、綠原酸的 含 量 分 別 為0.1622～0.2157mg/g、0.5602～0.6904mg/g、0.4033～0.5091mg/g，見表4。

表4 含量測定結果

3 討論

當機體產生發(fā)熱、感冒、損傷等炎癥反應時，體內的ⅠL類成分合成量顯著增加，且向病變部位聚集，加劇炎癥反應癥狀，升高機體產熱、體溫，增加能量和相關物質代謝，使相關病癥加重，因此ⅠL可以作為評價病程和藥物療效的重要指標。ⅠL-6調控活性篩選結果可知，橙皮苷、柚皮苷并無明顯的ⅠL-6調控活性，這可能與上述成分主要活性為抗氧化、清除自由基有關，因此并無與炎癥反應和ⅠL-6代謝通路相關靶點結合并起調控作用的能力。雖然上述成分對銀翹清咽顆粒的治療功效可能有一定貢獻，但由于本研究主要聚焦于ⅠL-6調控活性成分，且橙皮苷、柚皮苷藥理活性研究已有較多報道[14]，故本文暫不涉及。

由于銀翹清咽顆粒為多藥味復方中藥制劑，且ⅠL-6調控活性研究結果顯示方中主要活性成分化學性質差異較大，因此各目標成分的洗脫時間差異較為明顯，為這些同時測定和基線分離提供了一定的便利性[15]。但與此同時，藥材提取、藥物制劑工藝、供試品制備方法和分離檢測用固定相、流動相等相比傳統(tǒng)的測定一類同系物的含量測定研究，對各組分色譜行為、峰型、信號強度影響也更為顯著。為建立多指標活性成分同時測定方法，本實驗在色譜條件摸索過程中，主要考慮增加信號強度最低成分（在本實驗中為連翹苷）的響應值，對其他成分的信號強度有一定犧牲，但并未影響目標化合物的準確測定，故采用。

由圖2可知，靛玉紅、表告依春、直鐵線蓮寧B、升麻素苷等成分的對照品溶液雖能正常出峰[16]，但在供試品中未檢出或含量不符合要求（低于對照品的10%，即在銀翹清咽顆粒中含量低于1/10000），因此并未被列入含量測定指標成分中。產生上述結果的原因，可能是制備顆粒用浸膏的過程中，為保持制劑與原中藥湯劑的一致性而采用水提，因此出現部分成分含量較低或未檢出。在今后的研究中，可考慮使用乙醇提取或高速逆流色譜法、超臨界萃取法等手段，增加有效成分的種類和含量。

總而言之，本研究對銀翹清咽顆粒中多種成分進行了ⅠL-6調控活性評價和含量測定研究，建立了基于功效主治的多指標含量測定方法，最終確定綠原酸、連翹苷、腺苷等三個成分同時具有明顯的ⅠL-6調控活性和適宜的含量，可作為評價該制劑質量的指標成分。