RhoA/ROCK信號(hào)通路在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)心肌H9C2細(xì)胞損傷中調(diào)控機(jī)制

林顯文 喬國(guó)艷

(成飛醫(yī)院 1干部保健科，四川 成都 610031；2神經(jīng)內(nèi)科)

缺氧性心臟病是由冠狀動(dòng)脈硬化所致血管管腔狹窄阻塞，或冠狀動(dòng)脈功能改變引起心臟正常供血功能受阻，進(jìn)而發(fā)生心肌缺血缺氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷〔1〕。作為心臟生理功能的基礎(chǔ)單元，心肌細(xì)胞處于損傷狀態(tài)時(shí)，心肌細(xì)胞的基礎(chǔ)代謝受到影響，心臟物質(zhì)及能量交換均處于不正常狀態(tài)，甚至基本的心臟形態(tài)也會(huì)隨之改變，誘發(fā)惡性心臟事件出現(xiàn)〔2〕。缺血再灌注損傷是阻礙缺氧性心臟病患者在再灌注治療中獲益的主要問(wèn)題，研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注會(huì)提高心肌細(xì)胞凋亡的比例〔3〕，因此明確心肌細(xì)胞在缺血再灌注中的損傷及凋亡機(jī)制一直是心血管疾病研究的熱點(diǎn)。心肌細(xì)胞損傷和凋亡，受許多信號(hào)通路和調(diào)控因子的影響，是體內(nèi)的一種復(fù)雜的生物反應(yīng)過(guò)程〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)Ras同源基因家族蛋白(Rho)A/Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)在心血管疾病中表現(xiàn)出來(lái)的對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用引起關(guān)注〔5〕。研究表明通過(guò)抑制RhoA/ROCK能夠促進(jìn)心肌梗死后充質(zhì)肝細(xì)胞的歸巢，減輕心肌梗死的癥狀〔6〕。RhoA/ROCK已成為心血管疾病分子靶向治療的研究新方向。但是RhoA/ROCK信號(hào)通路在心肌缺血再灌注損傷中的作用鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)體外構(gòu)建心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型，探討RhoA/ROCK在缺血再灌注的心肌細(xì)胞損傷與凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及主要試劑和儀器 H9C2細(xì)胞(上海中科院細(xì)胞庫(kù))；RhoA-siRNA重組腺病毒載體及空載質(zhì)粒Ad5-EGFP購(gòu)自上海吉瑪生物有限公司；DMEM培養(yǎng)基(TOYOBO)；Trizol 試劑盒(TaKaRa)；Hoechst 33258 染色試劑、DCFH-DA 染液、Rh123染色劑(美國(guó)Abcamn公司)；B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、RhoA、SDF-1α、鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體(美國(guó)Jackson公司)；Transwell小室(美國(guó)BD公司)； Western印跡試劑盒(美國(guó)Sigma公司)；全蛋白抽提試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)含量試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)vector公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，美國(guó)Amresco公司)；蘇凈Airtech超凈工作臺(tái)(北京六一儀器廠)；SANYO MCO-15AC細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)強(qiáng)生公司)；Nikon Ti-U/Ti-s倒置熒光顯微鏡(日本三菱公司)；5810R 型高速離心機(jī)(日本島津公司)；微量移液槍(美國(guó)Promega公司)；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，美國(guó)Corning公司)；E-Gel Imager凝膠成像儀(美國(guó)Beckma公司)。

1.2方法

1.2.1心肌缺氧復(fù)氧損傷模型的建立及分組處理 細(xì)胞分為正常組、模型組、對(duì)照組(轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒Ad5-EGFP)、RhoA-siRNA組(轉(zhuǎn)染RhoA-siRNA)。將H9C2細(xì)胞接種于含有滅活的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，條件37℃，5%CO2，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)85%時(shí)，25%胰蛋白酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9C2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，采用Lipofectamine3000通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)法，將濃度均為200 nmol/L的空載質(zhì)粒Ad5-EGFP和RhoA-siRNA重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染操作完成后，37℃，5%CO2常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

除正常組外，模型組、對(duì)照組、RhoA-siRNA組細(xì)胞構(gòu)建心肌缺氧復(fù)氧損傷模型，方法如下： 在37℃、5%CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)H9C2 細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度超過(guò)60%以后，更換培養(yǎng)基，添加等量不含血清的DMEM 培養(yǎng)基，將細(xì)胞放在37℃、5%CO2、95%N2的缺氧培養(yǎng)箱中封閉培養(yǎng)12 h。取出培養(yǎng)板，用移液槍把原來(lái)的培養(yǎng)液吸除后，再次更換培養(yǎng)基，添加相同體積的10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，將細(xì)胞放在37℃、5%CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，即為缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞模型。正常組H9C2細(xì)胞始終常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2顯微鏡下觀察細(xì)胞H9C2形態(tài)學(xué)變化 調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104個(gè)/ml接種于6孔板中，分組處理同上， 37℃，5%CO2生化培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及形態(tài)變化。

1.2.3各組心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平的檢測(cè) 調(diào)整細(xì)胞濃度至3×106個(gè)/ml接種于24孔板中，分組處理同上，37℃，5%CO2生化培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS緩沖液沖洗2次，轉(zhuǎn)移至5 ml無(wú)菌EP管中，1 000 r/min離心5 min，留取沉淀，添加5 μl的10 μmol/L DCFH-DA 染液，37℃避光孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min。上熒光顯微鏡觀察，并且用Image J1.41軟件對(duì)綠色熒光強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4各組心肌細(xì)胞線粒體膜電位的檢測(cè) 參照J(rèn)C-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，依次完成實(shí)驗(yàn)步驟，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，在不同波長(zhǎng)下觀察細(xì)胞顯色水平，其中紅色熒光：激發(fā)波長(zhǎng)490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)580 nm；綠色熒光：激發(fā)波長(zhǎng)490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm 觀察。使用計(jì)算機(jī)采集熒光圖像，Image J軟件重疊紅綠熒光，將合成熒光的紅、綠色熒光光密度比值作為膜電位表達(dá)水平值。

1.2.5彗星實(shí)驗(yàn)測(cè)定各組心肌細(xì)胞DNA損傷程度 調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105個(gè)/ml接種于6孔板中，分組處理同上，37℃，5%CO2生化培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，將各組細(xì)胞分別與凝膠以1∶10比例混合后鋪片，經(jīng)制片、細(xì)胞裂解、解旋、電泳、中和、脫水等步驟后制成單細(xì)胞凝膠標(biāo)本，標(biāo)本經(jīng)SYBR膠體染料染色20 min后，實(shí)驗(yàn)操作必須在避光下進(jìn)行，以避免光線引起的DNA的額外損傷。在熒光顯微鏡下拍照觀察，并采用KOMET8.0圖像軟件分析圖像以指標(biāo)Olive尾矩來(lái)評(píng)價(jià)DNA的損傷程度。

1.2.6各組心肌細(xì)胞凋亡的測(cè)定 調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/ml接種于24孔板中，分組處理同上，37℃，5%CO2生化培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS 緩沖液沖洗2 次，每次5 min，4%甲醛固定10 min，PBS 沖洗3次，每次5 min，加入5 mg/L Hoechst 33258 染色試劑，室溫下封閉孵育30 min，PBS 沖洗2次。在熒光顯微鏡下觀察，熒光顯微鏡下，正常細(xì)胞因?yàn)槿旧|(zhì)分布均勻，細(xì)胞核被染成均勻藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞由于核質(zhì)固縮嚴(yán)重、核膜碎裂被染成明亮的藍(lán)色。

1.2.7Western印跡檢測(cè)各組心肌細(xì)胞中Bax、Bcl-2、RhoA、ROCK1、ROCK2的表達(dá) 調(diào)整細(xì)胞濃度，分組處理同上，37℃，5%CO2生化培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，按照細(xì)胞濃度1×106個(gè)/ml加入300 μl的放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r/min，離心10 min，收集上清液，采用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，將蛋白樣品和結(jié)合緩沖液混合，進(jìn)行SDS-PAGE(5%濃縮膠，10%分離膠)，每孔上樣量25 μl，電泳結(jié)束后，4℃轉(zhuǎn)膜1.5 h，采用5%脫脂奶粉封閉聚偏氟乙烯(PVDF)膜2 h，加入預(yù)稀釋的一抗，4℃過(guò)夜，TBST充分洗膜后加入二抗，37℃孕育2 h，加入ECL顯色液，室溫避光顯色30 min，采用E-Gel Imager自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)掃描圖像，以GAPDH作為內(nèi)參，分析蛋白水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化觀察 倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，正常組細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，形狀規(guī)整，多呈梭形，排列均一，細(xì)胞核形狀規(guī)則且清晰可辨，核質(zhì)間隙清楚，細(xì)胞內(nèi)容物均勻透明，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，膜表面平滑無(wú)褶皺；與正常組細(xì)胞相比，模型組、對(duì)照組、RhoA-siRNA組細(xì)胞生長(zhǎng)出現(xiàn)不同程度的緩慢，模型組細(xì)胞呈現(xiàn)十分明顯凋亡特征，大多數(shù)細(xì)胞已成圓形，胞體嚴(yán)重皺縮，細(xì)胞核固縮明顯，部分核膜已經(jīng)破裂，細(xì)胞膜雖然完整，但皺縮嚴(yán)重，胞膜結(jié)構(gòu)變性明顯，圓形漂浮細(xì)胞數(shù)目增多；對(duì)照組與模型組細(xì)胞相差不大，出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞；與模型組和對(duì)照組相比，RhoA-siRNA組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，圓形漂浮細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞核形狀趨于規(guī)則，核膜基本完整，凋亡現(xiàn)象較輕。見(jiàn)圖1。

圖1 顯微鏡觀察各組H9C2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化(×200)

2.2細(xì)胞內(nèi)ROS水平的檢測(cè) 模型組H9C2細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度〔(7.80±0.56)×105U/ml〕明顯強(qiáng)于正常組〔(2.10±0.42)×105U/ml，P<0.05〕；RhoA-siRNA組H9C2細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度明顯弱于模型組(P<0.05)，對(duì)照組〔(7.65±0.64)×105U/ml〕與模型組差異不明顯(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 各組心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的檢測(cè)(DCFH-DA染色，×400)

2.3各組心肌細(xì)胞線粒體膜電位的檢測(cè) 模型組H9C2細(xì)胞線粒體膜電位〔(80.50±7.78)%〕明顯高于正常組〔(6.58±0.42)%，P<0.05〕；RhoA-siRNA組H9C2細(xì)胞線粒體膜電位〔(41.50±4.95)%〕明顯低于模型組(P<0.05)，對(duì)照組〔(78.50±4.19)%〕與模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 各組心肌細(xì)胞線粒體膜電位的檢測(cè)(JC-1染色，×400)

2.4彗星實(shí)驗(yàn)測(cè)定各組心肌細(xì)胞DNA損傷程度 模型組H9C2細(xì)胞的Olive尾矩〔(77.82±7.07)μm〕明顯長(zhǎng)于正常組〔(15.56±2.24)μm，P<0.05〕，RhoA-siRNA組H9C2細(xì)胞的心肌細(xì)胞Olive尾矩〔(47.54±4.78)μm〕明顯短于模型組(P<0.05)，對(duì)照組〔(74.68±8.36)μm〕與模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖4。

2.5各組心肌細(xì)胞凋亡的測(cè)定 模型組細(xì)胞凋亡率、Bax的表達(dá)水平明顯高于正常組(P<0.05)，Bcl-2的表達(dá)水平明顯低于正常組(P<0.05)；RhoA-siRNA組細(xì)胞凋亡率、Bax的表達(dá)水平明顯低于模型組(P<0.05)，Bcl-2的表達(dá)水平明顯高于模型組(P<0.05)；對(duì)照組與模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖5、6，表1。

圖5 各組心肌細(xì)胞凋亡的測(cè)定(Hoechst33258染色，×200)

圖6 Western印跡檢測(cè)與凋亡相關(guān)的蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)

2.6Western印跡檢測(cè)各組心肌細(xì)胞中RhoA、ROCK1、ROCK2的表達(dá) 模型組心肌細(xì)胞RhoA、ROCK1、ROCK2的表達(dá)水平明顯高于正常組(P<0.05)，RhoA-siRNA組RhoA、ROCK1、ROCK2的表達(dá)水平明顯低于模型組(P<0.05)，對(duì)照組與模型組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1、圖7。

表1 各組心肌細(xì)胞凋亡率、RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

圖7 Western印跡檢測(cè)RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白的表達(dá)

3 討 論

心肌細(xì)胞凋亡失常是心血管疾病中最重要的病理學(xué)改變，尤其是心臟再灌注治療之后的心肌細(xì)胞凋亡已成為手術(shù)成敗的關(guān)鍵因素〔7〕，國(guó)內(nèi)外的眾多學(xué)者就心肌細(xì)胞的異常凋亡開(kāi)展大量的研究。已有研究表明阻止心肌細(xì)胞在遭受刺激時(shí)引發(fā)的損傷能夠明顯的抑制心肌細(xì)胞的凋亡〔8〕。已有研究證實(shí)機(jī)體內(nèi)多種信號(hào)分子調(diào)控或者參與心肌細(xì)胞的損傷及凋亡〔9〕。心臟是能量消耗較高的器官，線粒體是細(xì)胞進(jìn)行能量代謝的場(chǎng)所。研究表明心臟能量代謝失常是心肌細(xì)胞凋亡的始動(dòng)事件，線粒體膜電位的下降是心肌細(xì)胞早期凋亡的標(biāo)志性事件，抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax的比值降低是啟動(dòng)線粒體凋亡途徑的開(kāi)關(guān)〔10〕。研究報(bào)道稱缺血再灌注后心肌細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)減少， Bax的表達(dá)增加，心肌細(xì)胞凋亡率升高〔11〕。有學(xué)者研究證實(shí)在對(duì)心肌缺血再灌注大鼠進(jìn)行抗細(xì)胞凋亡干預(yù)后，明顯改善了大鼠的心功能及減小其心臟發(fā)生微梗死的面積〔12〕。另有研究報(bào)道改善缺血再灌注大鼠的線粒體功能，調(diào)控Bcl-2與Bax的表達(dá)比值，提高其線粒體膜電位，恢復(fù)心肌細(xì)胞線粒體的能量代謝過(guò)程，能明顯降低心肌細(xì)胞的凋亡率〔13〕。此外，氧化應(yīng)激在細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而由自由基介導(dǎo)的細(xì)胞過(guò)氧化損傷可嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞DNA，線粒體是含有大量抗氧化酶的細(xì)胞器，可及時(shí)清除活性氧自由基，一旦受到損傷，不僅造成功能降低，還會(huì)使細(xì)胞因過(guò)高的氧化應(yīng)激水平而發(fā)生凋亡。本研究結(jié)果說(shuō)明在缺氧/復(fù)氧過(guò)程中，心肌細(xì)胞會(huì)因線粒體損傷而提高細(xì)胞氧化應(yīng)激水平從而發(fā)生凋亡。

RhoA/ROCK通路是機(jī)體內(nèi)重要的信號(hào)通路，Rho是小分子G蛋白的成員之一，常作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子開(kāi)關(guān)，直接參與調(diào)控細(xì)胞形態(tài)維持、細(xì)胞黏附與遷移、平滑肌收縮等多種細(xì)胞生物效應(yīng)〔14〕。ROCK主要包括ROCK1和ROCK2兩種亞型，是RhoA下游最重要的效應(yīng)器，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，在細(xì)胞增殖與凋亡，黏附與分裂中發(fā)揮重要作用〔15〕。Yasue等〔16〕臨床研究表明RhoA/ROCK通路與冠狀動(dòng)脈的病變密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明抑制RhoA/Rho通路后，ROCK的轉(zhuǎn)錄功能降低，能夠明顯抑制心肌細(xì)胞的凋亡，改善慢性心力衰竭大鼠的左心室重構(gòu)〔17〕。Cui等〔18〕研究證實(shí)對(duì)缺血再灌注大鼠進(jìn)行法舒地爾(RhoA/ROCK通路抑制劑)治療后，其線粒體功能明顯恢復(fù)，心臟的能量代謝和心功能明顯改善。另有研究發(fā)現(xiàn)，RhoA/ROCK通路可通過(guò)促進(jìn)線粒體損傷而提高細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平〔19〕。本研究結(jié)果表明抑制RhoA/ROCK通路，能明顯改善缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的損傷。