非布司他對高尿酸血癥大鼠p38 MAPK/NF-κB通路及腦血管粥樣硬化的影響

李芳 姚嘉怡 姚建華 曹京旌 寧曉然

(1河北省人民醫(yī)院風濕免疫科，河北 石家莊 050000；2華北理工大學冀唐學院中醫(yī)系；3河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院老年病科)

高尿酸血癥(HUA)為一種因尿酸代謝功能障礙引起的慢性代謝疾病，可因尿酸鹽沉積而導致關(guān)節(jié)痛風發(fā)作和尿酸性腎結(jié)石，并可引起血管內(nèi)皮功能異常、動脈粥樣硬化、血管鈣化等心血管功能異?！?，2〕。研究表明，HUA與腦血管粥樣硬化有著密切聯(lián)系〔3〕，而尿酸誘導的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)是造成腦血管粥樣硬化的主要病理基礎(chǔ)，清除氧自由基，抑制炎癥是對抗上述血管損傷的一種有效治療方法〔4，5〕。p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB可調(diào)控機體炎癥及氧化應(yīng)激過程，尿酸可增強p38 MAPK的磷酸化，進而激活NF-κB信號，促使其核轉(zhuǎn)移及促炎因子表達，誘導血管平滑肌細胞炎癥；抑制p38 MAPK/NF-κB激活，可減少活性氧產(chǎn)生，降低炎癥因子表達，減輕動脈血管炎癥損傷，改善動脈粥樣硬化〔6，7〕。因此推測，p38 MAPK/NF-κB信號是治療HUA大鼠腦血管粥樣硬化的主要作用靶點。非布司他作為一種黃嘌呤氧化酶抑制劑，是臨床中用于治療HUA的一線藥物，可降低尿酸水平，對于慢性腎病HUA患者療效確切，安全可靠〔8，9〕，但非布司他對HUA大鼠p38 MAPK/NF-κB通路與其腦血管粥樣硬化的影響，目前還尚未有明確闡述，本文以不同劑量非布司他處理HUA模型大鼠，對此課題進行探討。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 清潔級Wistar大鼠購自南方醫(yī)科大學，許可證號為SCXK(粵)2016-0041，雄性，體重200～220 g。在河北省人民醫(yī)院動物房中嚴格參照《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》飼養(yǎng)，室內(nèi)環(huán)境保持清潔級，噪音不超過80 dB，通風良好，溫度25℃，相對濕度55%，飼養(yǎng)適應(yīng)1 w后進行實驗。

1.1.2試劑與儀器 非布司他片(規(guī)格：40 mg/片)，生產(chǎn)廠家：江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司，國藥準字：H20130058；別嘌醇片(規(guī)格：0.1 g/片)，生產(chǎn)廠家：上海信誼萬象藥業(yè)股份有限公司，國藥準字：H31020334；超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒，生產(chǎn)廠家：上海晶抗生物工程有限公司，貨號：JK-(a)-2293、JK-(a)-2197；兔源p38 MAPK、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、NF-κB p65、磷酸化(p)-p38 MAPK及增殖細胞核抗原(PCNA)一抗、大鼠白細胞介素(IL)-6及腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、耦聯(lián)辣根過氧化物酶(HRP)的山羊抗兔二抗，生產(chǎn)廠家：美國Abcam公司，貨號：ab181602、ab1194、ab16502、ab17942、ab18197、ab100772、ab5603、ab205718；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒，生產(chǎn)廠家：北京金克隆生物技術(shù)有限公司，貨號：RS3390；氧嗪酸鉀，生產(chǎn)廠家：上海源葉生物科技有限公司，貨號：S17112；BCA試劑盒、蛋白裂解液，生產(chǎn)廠家：上海碧云天公司，貨號：P0011、P0013B等。SHE-3000酶標儀，生產(chǎn)廠家：北京賽爾福知心科技有限公司；KEEBIO-600N電泳儀電源、KEEBIO-HE120水平電泳槽、轉(zhuǎn)移電泳槽KEEBIO-VE186，生產(chǎn)廠家：上海金鵬分析儀器有限公司；SD-1全自動生化分析儀，生產(chǎn)廠家：成都斯馬特科技有限公司；HM355S全自動輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機，生產(chǎn)廠家：上海涵飛醫(yī)療器械有限公司；37XF-PC倒置生物顯微鏡，生產(chǎn)廠家：上海永亨光學儀器制造公司；WD-9413B化學凝膠成像儀，生產(chǎn)廠家：濟南來寶醫(yī)療器械有限公司等。

1.2方法

1.2.1大鼠HUA模型制備及分組給藥 遵循文獻〔10〕中方法，將氧嗪酸鉀溶于蒸餾水中，并拌入大鼠飼料中，使氧嗪酸鉀占飼料的質(zhì)量分數(shù)為2%。然后以2%的氧嗪酸鉀飼料喂養(yǎng)65只大鼠，6 w后進行血清尿酸水平檢測，當明顯高于正常飼料喂養(yǎng)大鼠時，即表明HUA模型構(gòu)建成功，共成功構(gòu)建模型60只，隨機分為M組、FX-L組、FX-M組、FX-H組、Allo組，每組12只模型大鼠，另取12只大鼠以正常飼料喂養(yǎng)同樣時間，設(shè)為NC組。

以生理鹽水溶解非布司他片及別嘌醇片，配制為0.1、0.2、0.4 mg/ml的非布司他〔11〕溶液和2.4 mg/ml的別嘌醇〔12〕溶液，F(xiàn)X-L組、FX-M組、FX-H組與Allo組大鼠分別以上述溶液10 ml/kg的劑量灌胃，M組和NC組以10 ml/kg的生理鹽水灌胃，每天1次，持續(xù)21 d。

1.2.2標本采集及腦血管病理形態(tài)檢測 末次用藥后24 h，吸入乙醚麻醉大鼠，解剖、開腹，經(jīng)腹主動脈取血3 ml，4℃，3 000 r/min，離心15 min，吸出上清即能得到各組血清，于-80℃冰箱中儲存?zhèn)溆?；將各組大鼠斷頭取出大腦，分離動脈血管，剪取約0.5 cm漂洗后，置于4%多聚甲醛溶液中固定，剩余血管儲存在液氮中備用。將固定后的腦血管組織依次浸入75%、90%、95%、100%濃度的梯度酒精中進行脫水，取出切片浸入二甲苯中孵育透明后置于熱石蠟中包埋，將得到的石蠟組織塊放入切片機中做常連續(xù)切片，得到厚度約為5 μm的切片備用。

1.2.3大鼠血清尿酸、TNF-α及IL-6水平測定和腦血管組織中氧化應(yīng)激水平檢測 將1.2.2中儲存于-80℃冰箱中的血清置于冰水浴中解凍，以全自動生化分析儀檢測其中尿酸含量，參照ELISA試劑盒說明書的操作步驟測定其中TNF-α、IL-6含量。

分別將1.2.2中的各組腦血管組織剪碎，與蛋白裂解液混勻后勻漿，每個樣品取出一半勻漿液提取總蛋白，剩余一半勻漿液提取核內(nèi)蛋白，運用BCA法分別測定總蛋白和核內(nèi)蛋白濃度，步驟具體參照制造商說明書指導操作，每組各取500 μl總蛋白樣品液，使用檢測試劑盒并遵照其制造商說明書指導測得其中SOD、MDA水平，剩下的總蛋白和核內(nèi)蛋白樣品液后續(xù)做蛋白表達檢測實驗。

1.2.4腦血管組織p38 MAPK/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達檢測1.2.3中剩余的蛋白樣品液，根據(jù)蛋白濃度測定結(jié)果將其調(diào)至各組相同，每組總蛋白和核內(nèi)蛋白樣品液各取15 μl，變性蛋白后上樣跑十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，通過濕轉(zhuǎn)將分離膠中全部蛋白移至PVDF膜，將膜浸入5%脫脂奶粉溶液中室溫孵育2 h，對蛋白非特異抗原進行封閉處理，然后分別以兔源GAPDH、p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65、PCNA一抗溶液4℃孵育過夜，稀釋比例均為1：2 000，TBST漂洗3次后將各蛋白膜浸入耦聯(lián)HRP的山羊抗兔二抗溶液(稀釋比例為1∶1 000)，室溫孵育2 h后TBST漂洗3次，于膜上滴加增強化學發(fā)光試劑對顯色蛋白條帶，在凝膠成像儀中采集各組蛋白條帶圖像，并運用Image-J軟件分析圖片，定量各組蛋白灰度值后量化得到其相對表達量。

1.3統(tǒng)計學分析 采用軟件SPSS26.0進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1非布司他對大鼠血清尿酸的影響 與NC組相比，M組血清尿酸明顯升高(P<0.05)；與M組相比，F(xiàn)X-L、FX-M、FX-H組及Allo組血清尿酸明顯降低(P<0.05)，且FX-L、FX-M、FX-H組之間呈劑量依賴性(P<0.05)；FX-H組與Allo組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2非布司他對大鼠血清中TNF-α與IL-6水平的影響 與NC組相比，M組血清中TNF-α與IL-6水平明顯增高(P<0.05)；與M組相比，F(xiàn)X-L、FX-M、FX-H組及Allo組大鼠血清中TNF-α與IL-6水平顯著降低(P<0.05)，且FX-L、FX-M、FX-H組之間呈劑量依賴性(P<0.05)；FX-H組與Allo組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

2.3非布司他對大鼠腦血管組織氧化應(yīng)激的影響 與NC組相比，M組腦血管組織SOD水平顯著降低(P<0.05)，MDA水平顯著升高(P<0.05)；與M組相比，F(xiàn)X-L、FX-M、FX-H組及Allo組大鼠腦血管組織SOD水平均升高，MDA水平均降低，且FX-L、FX-M、FX-H組之間呈劑量依賴性(P<0.05)；FX-H組與Allo組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組血清尿酸、TNF-α、IL-6、SOD、MDA水平及腦血管組織p38 MAPK/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達比較

2.4非布司他對大鼠腦動脈血管病理形態(tài)的影響 NC組腦動脈血管形態(tài)完好清晰，無損傷；M組腦動脈可見血管平滑肌細胞增生，內(nèi)膜增厚，腔內(nèi)可見向里凸起的斑塊，并發(fā)生變性壞死，血管壁損傷等病理損傷；與M組相比，F(xiàn)X-L、FX-M、FX-H組及Allo組腦動脈血管上述病理損傷減輕，且隨非布司他劑量升高而逐漸減輕；FX-H組與Allo組相比，腦動脈血管上述病理損傷減輕程度無明顯差異，見圖1。

圖1 各組腦動脈血管HE染色結(jié)果(×200)

2.5非布司他對大鼠腦血管組織p38 MAPK/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達的影響 與NC組相比，M組腦血管組織p38 MAPK/NF-κB通路相關(guān)蛋白p-p38 MAPK/p38 MAPK、核內(nèi)NF-κB p65表達明顯增高(P<0.05)；與M組相比，F(xiàn)X-L、FX-M、FX-H組及Allo組大鼠腦血管組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、核內(nèi)NF-κB p65表達明顯降低(P<0.05)，且FX-L、FX-M、FX-H組之間呈劑量依賴性(P<0.05)；FX-H組與Allo組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1、圖2。

圖2 免疫印跡檢測各組大鼠腦血管組織p38 MAPK/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達

3 討 論

近年來，隨著社會發(fā)展及生活水平的提高，人們膳食結(jié)構(gòu)發(fā)生很大改變，HUA的患病率隨之明顯增加，且患者呈明顯年輕化趨勢〔13，14〕。研究發(fā)現(xiàn)，尿酸可減少一氧化氮(NO)合成，誘導炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)，損傷血管，促使血管鈣化，最終導致動脈粥樣硬化，是引發(fā)心血管疾病的獨立危險因素〔15，16〕。本文結(jié)果表明高血酸可引發(fā)嚴重的炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)，損傷HUA大鼠腦動脈血管。

非布司他是一種黃嘌呤氧化酶抑制劑，可通過減少血清尿酸含量達到治療HUA的目的，對尿酸性腎病患者有明顯腎臟保護作用，能明顯改善其腎動脈粥樣硬化程度，還可減輕痛風患者關(guān)節(jié)炎癥狀〔2，17〕，但非布司他對腦血管粥樣硬化的影響，鮮有報道。別嘌醇是臨床及基礎(chǔ)研究中探索HUA治療方法及機制的常用陽性對照藥。本文結(jié)果表明非布司他可減少HUA大鼠血清尿酸含量，抑制炎癥發(fā)生發(fā)展，降低氧化應(yīng)激水平，減輕腦動脈血管損傷，改善腦血管粥樣硬化癥狀，并隨劑量升高而作用增強。

p38 MAPK/NF-κB是機體內(nèi)調(diào)控細胞遷移、增殖、衰老及凋亡、炎癥、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等生理病理過程的重要信號，在急性呼吸窘迫綜合征大鼠肺組織中，處于激活狀態(tài)，此時，p38 MAPK發(fā)生磷酸化，NF-κB大量轉(zhuǎn)入核內(nèi)，介導下游炎癥因子表達，促使炎癥進展，加重肺組織損傷，而阻滯p38 MAPK/NF-κB傳導，可抑制炎癥反應(yīng)，減輕肺組織損傷〔18〕。另外p38 MAPK/NF-κB信號還可介導尿酸誘導的血管組織炎癥及過氧化損傷過程，抑制該信號傳導，可阻止炎癥與過氧化反應(yīng)發(fā)生與發(fā)展，減輕動脈血管粥樣硬化癥狀〔6，7，19〕。本文結(jié)果表明p38 MAPK/NF-κB參與介導HUA大鼠腦血管粥樣硬化病理過程，非布司他可下調(diào)該信號表達，降低血清尿酸水平，改善HUA大鼠腦血管粥樣硬化癥狀。

綜上，非布司他可抑制尿酸合成，減輕p38 MAPK磷酸化，阻止NF-κB p65核轉(zhuǎn)移，降低炎性細胞因子TNF-α、IL-6合成分泌，抑制炎癥及氧化應(yīng)激發(fā)生發(fā)展，減輕腦血管病理損傷，緩解HUA大鼠腦血管粥樣硬化癥狀，阻滯p38 MAPK/NF-κB信號傳導可能是其藥理機制之一。但本文只進行了初步研究，證據(jù)效力不足，還需通過使用p38 MAPK/NF-κB信號激活劑和抑制劑來進行對照驗證。