利拉魯肽對(duì)糖尿病腦梗死大鼠腦組織胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-3及血管生成的影響

卜一 張碩 錢旭東 王紅梅 竇志杰

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 承德 067000)

糖尿病(DM)導(dǎo)致的代謝紊亂可引起大血管、毛細(xì)血管病變，是腦梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一；和非DM腦梗死比較，DM腦梗死患者腦組織血管狹窄病變程度更嚴(yán)重，病變支數(shù)更多；DM本身影響側(cè)支循環(huán)的建立，DM患者血糖水平升高是由單核細(xì)胞參與的大血管或毛細(xì)血管的形成能力及重塑能力降低〔1〕。利拉魯肽(LIRA)為胰高血糖素樣肽受體激動(dòng)劑，在DM治療中被廣泛應(yīng)用，可通過(guò)葡萄糖依賴性方式促進(jìn)胰島素分泌〔2〕；在正常血糖腦梗死小鼠中有通過(guò)促進(jìn)血管新生而促進(jìn)腦梗死后神經(jīng)功能恢復(fù)的作用〔3〕。胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)結(jié)合蛋白(IGFBP)-3在DM和心血管疾病中的作用越來(lái)越受到重視〔4〕，在新生血管形成中也發(fā)揮重要作用〔5〕。應(yīng)芝英等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)IGFBP-3在急性腦梗死患者血清中表達(dá)下降，分析IGFBP-3可能參與急性腦梗死的發(fā)病過(guò)程。本文以尼莫地平為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)LIRA對(duì)DM腦梗死大鼠腦組織IGFBP-3及血管形成的影響進(jìn)行研究，探討LIRA對(duì)DM腦梗死的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 清潔級(jí)、健康、體重220～260 g、雌雄各半、SD大鼠購(gòu)自北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，許可證號(hào)：SYXK(京)2015-0005。2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)、電化學(xué)發(fā)光(ECL)液、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒(美國(guó)Bioworld公司)，蘇木素、水合氯醛、Trizol(上海碧云天生物技術(shù)公司)，兔抗鼠IGFBP-3多克隆抗體、兔抗鼠CD34多克隆抗體、兔抗鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.2分組與建模 將144只大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為對(duì)照組(C組)、生理鹽水組(S組)、利拉魯肽組(LIRA組)、尼莫地平組(N組)，每組36只。S組、N組和LIRA組建立DM腦梗死大鼠模型：將大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素50 mg/kg，然后給予高脂肪食物喂養(yǎng)，共14 d，測(cè)量大鼠隨機(jī)血糖，連續(xù)7 d空腹血糖(FPG)>16.6 mmol/L為DM模型建立成功；水合氯醛麻醉DM模型大鼠，頸正中偏右側(cè)取豎直切口，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，采用經(jīng)典的Longa經(jīng)頸總動(dòng)脈插入尼龍線栓致大腦中動(dòng)脈閉塞法〔7〕建立急性腦梗死模型：在頸總動(dòng)脈分叉處做一小切口，插入尼龍線栓至大腦中動(dòng)脈起始段，插入深度為18～20 mm，2 h后麻醉大鼠，拔退線栓。C組正常飼料飲食；術(shù)中插線深度10 mm，其他步驟同生理鹽水組。

1.3神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 術(shù)后24 h，采用Bederson等〔8〕評(píng)分方法對(duì)各組進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。無(wú)神經(jīng)缺損癥狀為0分，對(duì)側(cè)前肢不能伸展為1分，行走向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為2分，行走向?qū)?cè)傾倒為3分，意識(shí)受抑制不能行走為4分，死亡為5分。S組、LIRA組和N組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分1～3分為建模成功，評(píng)分0分、4分及5分者予以剔除，取大鼠按照上述方法建模予以補(bǔ)充。

1.4處理 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分結(jié)束后，N組給予二甲雙胍〔27 mg/(kg·d)，2次/d〕及尼莫地平〔2.16 mg/(kg·d)，2次/d〕灌胃；LIRA組給予二甲雙胍〔27 mg/(kg·d)，2次/d〕及LIRA〔0.4 mg/(kg·d)，1次/d〕皮下注射〔9〕；C組和S組皮下注射等量生理鹽水。共14 d。治療后再次進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，方法同上。

1.5取材 治療結(jié)束后，每組取12只大鼠過(guò)量麻醉處理，斷頭取腦用于TTC染色；每組取12只大鼠深度麻醉后，經(jīng)心臟灌注生理鹽水，然后灌注多聚甲醛，至大鼠四肢微顫、全身僵硬，取出大腦組織，于多聚甲醛中固定，石蠟包埋、切片呈厚4 μm切片用于免疫組化染色；每組取12只剩余大鼠，深度麻醉后冰上斷頭取腦組織，液氮中保存，用于RT-PCR。

1.6TTC染色 將腦組織冰凍30 min，切成2 mm厚切片，在TTC中孵育15 min(每5 min翻動(dòng)1次)，紅色染色為正常腦組織，白色染色為腦梗死組織，TTC染色后放入多聚甲醛中，過(guò)夜浸泡，腦梗死面積采用Image J軟件測(cè)定，計(jì)算腦梗死體積(腦梗死體積比=患側(cè)腦梗死體積/患側(cè)腦半球體積×100%)。

1.7免疫組化染色測(cè)定腦組織缺血皮層區(qū)IGFBP-3、VEGF表達(dá)及CD34+微血管密度 將切片于烤箱中烤2 h，經(jīng)脫蠟、脫水，加入枸櫞酸鈉緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，加入過(guò)氧化氫孵育10 min，山羊血清封閉30 min，加入IGFBP-3、VEGF、CD34一抗(稀釋比例：1∶200、1∶200、1∶50)過(guò)夜孵育，加入生物素標(biāo)記二抗孵育30 min，C組以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素染色5 min，加入鹽酸酒精分化2 s，碳酸鋰返藍(lán)30 s，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。圖像采用Image-Pro Plus軟件處理。

1.8Western印跡測(cè)定腦組織缺血皮層區(qū)IGFBP-3、VEGF蛋白水平 取缺血皮層區(qū)腦組織，提取總蛋白質(zhì)，經(jīng)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗：兔抗鼠IGFBP-3單克隆抗體和兔抗鼠VEGF單克隆抗體，一抗稀釋比例1∶300，過(guò)夜孵育，加入二抗(1∶5 000)孵育2 h，以β-actin為內(nèi)參，蛋白條帶灰度值用Image J圖像分析軟件分析。IGFBP-3、VEGF蛋白水平=IGFBP-3、VEGF蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。

1.9RT-PCR測(cè)定腦組織缺血皮層區(qū)IGFBP-3、VEGF mRNA水平 取缺血皮層區(qū)腦組織，勻漿，提取腦組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以GAPDH為內(nèi)參，反應(yīng)條件為：預(yù)反應(yīng)：95℃ 30 s；PCR：95℃ 10 s、60℃ 30 s，共42個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt表示IGFBP-3、VEGF mRNA水平。引物序列IGFBP-3上游引物：5′-AGAGCACAGATACCCAGAAC T-3′,下游：5′-GGTGATTCATGTTGTCTTCCAT T-3′;VEGF上游引物：5′-CGGATCAAACCTCACCAA-3′下游：5′-TCTCCGCTCTGAACGAGG-3′;GAPDH上游引物：5′-CTCTAAGGCTGTGGGCAAGGTCAT-3′下游：5′-GAGA-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組隨機(jī)血糖和神經(jīng)評(píng)分比較 C組無(wú)神經(jīng)功能缺損，隨機(jī)血糖正常；與C組比較，S組隨機(jī)血糖和神經(jīng)功能評(píng)分增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與S組比較，LIRA組和N組隨機(jī)血糖和神經(jīng)功能評(píng)分下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，LIRA組和N組隨機(jī)血糖和神經(jīng)功能評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組隨機(jī)血糖和神經(jīng)功能評(píng)分比較

2.2各組腦組織TTC染色比較 C組腦組織無(wú)白色梗死灶出現(xiàn)，S組腦組織有白色梗死灶出現(xiàn)，腦梗死體積〔(34.25±4.12)%〕；與S組比較，LIRA組〔(12.35±2.57)%〕和N組〔(11.28±2.74)%〕大鼠腦梗死體積均明顯減少(t=15.623、16.082，P=0.000)，LIRA組和N組腦梗死體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組腦組織TTC染色

2.3各組缺血皮層區(qū)IGFBP-3和VEGF免疫組化染色 C組缺血皮層區(qū)有少量IGFBP-3和VEGF表達(dá)，S組缺血皮層區(qū)IGFBP-3和VEGF表達(dá)增強(qiáng)，LIRA組和N組缺血皮層區(qū)IGFBP-3和VEGF表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)。見(jiàn)圖2和圖3。各組IGFBP-3和VEGF IOD值比較：C組

圖2 各組腦組織IGFBP-3(免疫組化染色，×400)

圖3 各組缺血皮層區(qū)VEGF(免疫組化染色，×400)

表2 各組缺血皮層區(qū)IGFBP-3和VEGF IOD值、微血管密度及腦組織IGFBP-3、VEGF蛋白和mRNA水平比較

2.4各組缺血皮層區(qū)微血管密度比較 各組缺血皮層區(qū)微血管密度比較：C組

圖4 免疫組化測(cè)定各組缺血皮層區(qū)中CD34+微血管密度(×200)

2.5各組腦組織IGFBP-3、VEGF蛋白及mRNA水平比較 各組腦組織IGFBP-3、VEGF蛋白及mRNA水平比較：C組

圖5 Western印跡測(cè)定各組腦組織IGFBP-3、VEGF蛋白水平

3 討 論

LIRA為胰高血糖素樣肽受體激動(dòng)劑，有降糖作用，可通過(guò)抑制胰高血糖素分泌、促進(jìn)胰島素分泌而發(fā)揮降糖作用，在DM治療中被廣泛應(yīng)用〔10〕；LIRA還可通過(guò)血腦屏障，胰高血糖素樣肽受體在下丘腦、小腦、海馬組織及神經(jīng)細(xì)胞中均有表達(dá)，LIRA可通過(guò)激活腦組織中胰高血糖素樣肽受體減輕炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)等，從而對(duì)腦組織發(fā)揮保護(hù)作用〔11〕。尼莫地平可有效抑制鈣離子內(nèi)流、抑制血管平滑肌收縮、解除血管痙攣，從而改善腦供血，保護(hù)神經(jīng)元，在腦梗死治療中療效顯著。本研究結(jié)果表明LIRA對(duì)DM腦梗死有保護(hù)作用。

LIRA不僅有降血糖和神經(jīng)保護(hù)作用，在血管新生中也發(fā)揮重要作用，如Chen等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)LIRA可促進(jìn)小鼠局灶性腦缺血后的血管生成。腦梗死后引起微循環(huán)缺血，腦缺血還可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和功能失調(diào)，造成血管壁病變〔13〕。DM患者的高血糖可引起血管新生能力下降，腦梗死后腦缺血局部血氧供應(yīng)減少也顯著降低血管新生能力〔14〕。因此改善DM腦梗死的血管新生能力有重要意義〔15〕。CD34主要在毛細(xì)血管網(wǎng)中表達(dá)，在大血管內(nèi)皮中不表達(dá)CD34，本研究結(jié)果表明LIRA可能通過(guò)促進(jìn)腦組織新生血管生成發(fā)揮腦梗死保護(hù)作用。分析LIRA可能通過(guò)促進(jìn)DM腦梗死大鼠腦組織血管生成能力減輕腦梗死體積、改善神經(jīng)功能損傷程度。

IGF信號(hào)系統(tǒng)在血管生成方面發(fā)揮重要作用，IGFBPs為IGF信號(hào)系統(tǒng)的組成部分，與IGF的親和力比較強(qiáng)，在IGF系統(tǒng)的生物活性調(diào)控中有重要作用。IGFBP3和血管形成關(guān)系比較密切，在不同疾病中對(duì)血管形成的作用不同，在胰腺癌等惡性腫瘤中有抑制血管生成的作用〔16〕；但在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中有促進(jìn)血管生成的作用〔17〕。VEGF具有促進(jìn)血管生成作用〔18，19〕。IGFBP-3和VEGF共同參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程〔20〕，下調(diào)VEGF可抑制IGFBP-3的表達(dá)〔21〕。尼莫地平有促進(jìn)VEGF表達(dá)，改善高血壓腦出血患者神經(jīng)功能的作用〔22〕。本研究結(jié)果表明LIRA可能通過(guò)促進(jìn)IGFBP3表達(dá)促進(jìn)DM腦梗死大鼠腦組織新生血管生成。

綜上，LIRA對(duì)DM腦梗死大鼠有腦保護(hù)作用，其療效與尼莫地平相當(dāng)，但LIRA在促進(jìn)腦組織IGFBP3表達(dá)和血管新生能力方面優(yōu)于尼莫地平，LIRA可能通過(guò)促進(jìn)腦組織IGFBP3表達(dá)和血管新生能力發(fā)揮對(duì)DM腦梗死大鼠的腦保護(hù)作用。