YAP和TAZ在宮頸癌中表達(dá)及臨床意義

曲長(zhǎng)萍 田君 王寧 霍會(huì)蠶 盧慧芳

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 開(kāi)封 475000)

子宮頸癌是威脅婦女健康的第四位惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球年新發(fā)病例約60.4萬(wàn)例，死亡約34.2萬(wàn)例〔1〕。在發(fā)達(dá)國(guó)家，行之有效的篩查方案及人乳頭瘤病毒(HPV)疫苗的普及將宮頸癌的發(fā)生率和死亡率減半，調(diào)查結(jié)果顯示目前約85%的新發(fā)病例及90%的死亡病例發(fā)生在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)〔2，3〕。高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的始動(dòng)因素〔4〕。80%的女性一生中至少感染過(guò)一次HPV，但發(fā)展為宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)不到1%〔5〕，因此單純HPV感染不足以使宮頸上皮細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化及無(wú)限增殖，由此，針對(duì)宮頸癌發(fā)生的相關(guān)分子機(jī)制一直都是研究的熱點(diǎn)。Hippo信號(hào)通路與人類(lèi)多種惡性腫瘤有關(guān)，且與腫瘤的惡性表型及患者預(yù)后密切相關(guān)〔6〕,Yes相關(guān)蛋白(YAP)與轉(zhuǎn)錄共激活因子PDZ結(jié)合基(TAZ)是Hippo通路下游的主要效應(yīng)因子，作為細(xì)胞外應(yīng)力作用調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，二者在調(diào)節(jié)組織再生及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用〔7〕。本研究探討YAP/TAZ蛋白在宮頸癌組織中表達(dá)及二者與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系。一是為Hippo信號(hào)通路參與宮頸癌的發(fā)病機(jī)制提供一定的參考依據(jù)，二是為尋找宮頸癌新的腫瘤分子標(biāo)記物及潛在的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1臨床樣本收集 選取2020年1月至2021年12月河南大學(xué)淮河醫(yī)院婦科行手術(shù)治療的宮頸癌患者98例，其中65例病理診斷為宮頸癌并行廣泛全子宮切除+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)的患者。其中鱗癌57例，腺癌8例；宮頸癌分期采用國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)2018年的診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰb2期13例，Ⅱa1期35例,Ⅱa2期17例；按腫瘤分化程度分為高分化10例，中分化36例，低分化19例；根據(jù)病理證明盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為有轉(zhuǎn)移22例，無(wú)轉(zhuǎn)移43例。對(duì)照組33例選自同期因子宮良性病變(子宮平滑肌瘤、子宮腺肌病等)行子宮全切術(shù)的正常宮頸標(biāo)本，術(shù)前HPV檢測(cè)陰性，術(shù)后病理證實(shí)無(wú)宮頸病變。宮頸癌組年齡33～71歲，平均54.15歲，對(duì)照組年齡34～57歲，平均52.58歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤、急性生殖道感染或其他嚴(yán)重疾病、就診前接受放化療等特殊治療、精神異常或有溝通障礙，臨床及病理資料完整。所有參加本研究對(duì)象或其法定代理人自愿接受此項(xiàng)研究并簽署知情同意書(shū)，并已通過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批。

1.2試劑與方法 主要試劑：兔抗人YAP多克隆抗體(APR10774G)、兔抗人TAZ多克隆抗體(APR10378G)均購(gòu)自Proteintech公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠通用二抗(ab97040)購(gòu)自DAKO公司；組化試劑盒二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3檢測(cè)YAP、TAZ的表達(dá) 兔抗人YAP多克隆抗體、兔抗人TAZ多克隆抗體均以1∶600稀釋。免疫組化SP法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，包括脫蠟、水化，抗原修復(fù)，3% H2O2孵育5～10 min，3%牛血清白蛋白(BSA)血清封閉，滴加一抗37℃孵育1 h，二抗37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、二甲苯透明、封片等。

1.4結(jié)果判斷 采用免疫組化法檢測(cè)YAP和TAZ蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果判讀〔8,9〕由2名病理科醫(yī)師獨(dú)立完成，共同商議最終結(jié)果，YAP和TAZ均表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性細(xì)胞染色為棕黃色，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目計(jì)分，染色強(qiáng)度：不染色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞<25%為0分，25%～50%為1分，51%～75%為2分，>75%為3分；兩者乘積為最終結(jié)果：0～1分為陰性表達(dá)，2分及以上為陽(yáng)性表達(dá)。

1.5統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS20.0進(jìn)行χ2檢驗(yàn)及秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1YAP在宮頸癌組織與正常宮頸組織中表達(dá) YAP在宮頸癌組織中表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀，在正常宮頸組織中不表達(dá)(圖1)。宮頸癌組YAP陽(yáng)性表達(dá)率〔54例(83.07%)〕與正常組〔7例(21.21%)〕差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-5.940，P=0.000)。

2.2TAZ在宮頸癌組織與正常宮頸組織中表達(dá) TAZ在宮頸癌組織中表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀，而在正常宮頸組織中很少表達(dá)或不表達(dá)(圖1)。宮頸癌組TAZ陽(yáng)性表達(dá)率〔49例(75.38%)〕與正常組〔4例(12.12%)〕差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-5.909，P=0.000)。

宮頸癌組YAP

2.3YAP和TAZ表達(dá)與宮頸癌患者臨床特征的關(guān)系 YAP陽(yáng)性表達(dá)與組織浸潤(rùn)深度、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和FIGO分期有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；TAZ與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和FIGO分期有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而二者與年齡因素?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 YAP和TAZ陽(yáng)性表達(dá)與宮頸癌患者臨床特征的關(guān)系(n)

3 討 論

Hippo信號(hào)通路是最先在果蠅里通過(guò)遺傳篩選發(fā)現(xiàn)的〔10〕，該通路是1條由一系列蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子組成的激酶鏈，YAP/TAZ是該通路的主要效應(yīng)器，可調(diào)控組織穩(wěn)態(tài)、器官大小、組織再生和腫瘤進(jìn)展〔11〕，以可控的方式穿梭于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)〔12〕。Hippo通路處于激活狀態(tài)時(shí)，會(huì)磷酸化YAP/TAZ蛋白，從而保持細(xì)胞的自我更新與凋亡之間的平衡，當(dāng)Hippo通路失活時(shí)，去磷酸化的YAP/TAZ蛋白會(huì)打破這個(gè)平衡，因此Hippo通路的失控導(dǎo)致細(xì)胞和器官的過(guò)度生長(zhǎng)，突顯了其在癌癥生物學(xué)中的重要意義〔13，14〕,目前已知，YAP/TAZ蛋白在直腸癌〔14〕、乳腺癌〔15〕、胃癌〔16〕、腎癌〔17〕等惡性腫瘤中呈過(guò)表達(dá),并且與癌癥患者低生存率呈正相關(guān)。因此，YAP/TAZ這兩種轉(zhuǎn)錄激活因子的抑制劑可能被用于癌癥的治療。

高危型HPV16和HPV18相關(guān)宮頸癌占宮頸癌總數(shù)的70%以上〔18〕。而HPV基因的2個(gè)早期基因區(qū)的E6和E7基因在細(xì)胞癌性轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是病毒致癌的主要驅(qū)動(dòng)力，除了它們很好地抑制了p53和pRb腫瘤抑制基因的失活外，還調(diào)節(jié)部分基因轉(zhuǎn)化的信號(hào)通路〔19，20〕。研究表明，YAP表達(dá)與HPV感染有關(guān)，HPV E6蛋白可抑制YAP蛋白降解，HPV E7蛋白通過(guò)靶向PTPN14促進(jìn)YAP蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)，HPV E6/E7誘導(dǎo)的YAP蛋白累積并釋放至細(xì)胞核，這可能是通過(guò)Hippo通路促進(jìn)宮頸上皮細(xì)胞增殖并導(dǎo)致癌變的機(jī)制〔21，22〕。因此，HPV可通過(guò)誘導(dǎo)Hippo-YAP/TAZ通路中YAP的激活共同促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

He等〔23〕研究顯示，69例宮頸癌YAP的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)高達(dá)71.88%，弱陽(yáng)性表達(dá)率為18.80%。Xiao等〔24〕的研究顯示，免疫組化法研究YAP在10例宮頸炎標(biāo)本、104例宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅰ～Ⅱ及34例宮頸鱗癌標(biāo)本中表達(dá)情況，在慢性宮頸炎標(biāo)本細(xì)胞質(zhì)中YAP呈陰性或弱表達(dá)，宮頸癌組織較CIN組織中YAP的表達(dá)較強(qiáng)。另外在一個(gè)樣本量194例宮頸癌標(biāo)本中的研究顯示，TAZ陽(yáng)性表達(dá)率為84.54%〔25〕。本研究結(jié)果與上述研究相符。

張?chǎng)┑取?6〕通過(guò)免疫組化法和細(xì)胞轉(zhuǎn)染及干擾實(shí)驗(yàn)對(duì)80例宮頸癌標(biāo)本的研究顯示，Hippo通路最主要的激酶組分大腫瘤抑制基因(LATS)1蛋白在45%的宮頸癌組織中低表達(dá)，LATS1的低表達(dá)與FIGO分期及腫瘤分級(jí)呈正相關(guān)，提示LATS1表達(dá)下調(diào)與宮頸癌腫瘤發(fā)展進(jìn)程相關(guān)。因LATS1/2是激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)鏈中的作用元件，是YAP的上游調(diào)控因子，磷酸化的LATS1/2與Mps-結(jié)合者激酶激活因子(MOB)1形成LATS1/2-MOB復(fù)合物，進(jìn)一步促進(jìn)YAP、TAZ發(fā)生磷酸化，而當(dāng)LATS1表達(dá)下調(diào)，YAP/TAZ去磷酸化核轉(zhuǎn)位后與轉(zhuǎn)錄因子TEA結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子(TEAD)1～4結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、抑制凋亡等〔27〕，Sun等〔28〕研究表明通過(guò)敲除LATS1基因，增加了YAP積累，促進(jìn)原發(fā)性肝癌的遷移和侵襲，這與YAP調(diào)節(jié)有關(guān)。Li等〔29〕研究發(fā)現(xiàn)許多微小RNA通過(guò)抑制LATS1/2的轉(zhuǎn)錄，增加YAP的活性，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和耐藥能力。Li等〔30〕發(fā)現(xiàn)通過(guò)增強(qiáng)YAP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌生長(zhǎng)，并且YAP過(guò)表達(dá)與其預(yù)后不良因素相關(guān)。本研究進(jìn)一步證實(shí)了YAP/TAZ在宮頸癌組織中高表達(dá)，且與宮頸癌不良預(yù)后相關(guān)。同時(shí)揭示了YAP與TAZ同為Hippo信號(hào)通路中同源輔助轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)調(diào)作用，共同促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，今后深入探究其調(diào)控機(jī)制和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，將為宮頸癌患者預(yù)后的評(píng)估及尋找治療的潛在藥物靶點(diǎn)提供依據(jù)。