水楊酸對(duì)干旱脅迫下鳳仙花生長(zhǎng)、生理特性及相關(guān)基因表達(dá)的影響

沈 昀， 馬 甜， 王夢(mèng)雨

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300)

水楊酸(SA)是植物體內(nèi)含量最多且作用最廣的激素之一，參與許多植物生理和發(fā)育代謝過(guò)程，包括植物病原體防御反應(yīng)和對(duì)非生物脅迫的調(diào)控，因此SA通常用作外源植物激素/植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。一些證據(jù)證明，即使在低濃度下，SA對(duì)增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)同樣具備高效的功能。非生物脅迫下SA可刺激植物HO合成，進(jìn)而誘導(dǎo)基因相關(guān)抗氧化酶的表達(dá)，提高植物中SOD、過(guò)氧化物酶(POD)和CAT等抗氧化酶的活性，最終上調(diào)植物相關(guān)防御基因表達(dá)以緩解應(yīng)激反應(yīng)帶來(lái)的損傷。同時(shí)，SA的應(yīng)用可降低膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的積累和葉膜通透性。迄今為止，多項(xiàng)研究報(bào)告了非生物脅迫下外源SA應(yīng)用對(duì)植物調(diào)節(jié)作用的影響，發(fā)現(xiàn)其效果取決于應(yīng)用方法(如噴葉、浸種、莖注、根施)、時(shí)間、外源和內(nèi)源SA水平、脅迫因子、植物種類(lèi)以及發(fā)育階段。鳳仙花()是廣泛分布于亞洲與非洲的重要園藝植物，因葉子多肉、花色多樣及次生代謝旺盛，因此具有較好的觀賞及藥用價(jià)值，然而在種植、運(yùn)輸及應(yīng)用過(guò)程中易受到干旱和高溫等影響，且鳳仙花對(duì)干旱反應(yīng)極為敏感，當(dāng)水分供應(yīng)不足時(shí)植株枯萎迅速。目前，關(guān)于干旱脅迫對(duì)鳳仙花生理及生化反應(yīng)的研究較少，對(duì)應(yīng)用水楊酸的耐旱機(jī)制亦知之甚少?；诖耍狙芯刻剿髁怂畻钏岵煌昧繉?duì)不同干旱程度下鳳仙花生理代謝及相關(guān)基因表達(dá)的影響。研究結(jié)果有助于為水楊酸應(yīng)用于干旱脅迫提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試地點(diǎn)與供試材料

試驗(yàn)于2021年6—8月在江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院溫室中進(jìn)行?？諝庀鄬?duì)濕度為75%，溫度為18～28 ℃。鳳仙花植物來(lái)自江蘇省沐陽(yáng)縣九洲苗木場(chǎng)。水楊酸[SA，2-(HO)CHCOH]購(gòu)自Sigma-Aldrich化工試劑公司。供試培養(yǎng)基質(zhì)為泥炭、珍珠巖、蛭石按體積比2 ∶1 ∶1復(fù)配而成。

1.2 試驗(yàn)試劑與儀器

(1)儀器：AKF-IS2020V型水分儀，購(gòu)自上海禾工科學(xué)儀器有限公司；UV-1800紫外分光光度計(jì)，購(gòu)自上海美譜達(dá)儀器有限公司；TP-PW-Ⅱ自動(dòng)植物水勢(shì)儀(數(shù)顯式)，購(gòu)自浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司；Nanodrop 2000分光光度計(jì)，購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司。(2)試劑：A003-3-1丙二醛試劑盒、A107-1-1脯氨酸試劑盒、A064-1-1過(guò)氧化氫試劑盒、A001-4-1超氧化物歧化酶試劑盒、A123-1-1過(guò)氧化氫酶試劑盒、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；OMEGA BS8231450植物DNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；PrimerScript RT試劑盒，購(gòu)自日本TaKaRa生物試劑公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，設(shè)置3個(gè)水楊酸處理(SA)：0、1、2 mmol/L，分別記為SA0、SA1、SA2，3個(gè)基質(zhì)含水率處理(WW)：95%、75%、55%，分別對(duì)應(yīng)為水分充沛、輕度干旱和中度干旱，分別記為WW95、WW75、WW55，共9個(gè)組合處理。各處理重復(fù)3次。盆栽器具采用塑料圓桶，每盆裝培養(yǎng)基質(zhì)3 kg，將各處理的1株鳳仙花小植株移入桶中，采用配備時(shí)域反射計(jì)(TDR)的水分儀保持相應(yīng)處理基質(zhì)含水率。SA處理為每周進(jìn)行10 mL藥液的葉片噴施。期間及時(shí)補(bǔ)充培養(yǎng)基質(zhì)水分并記錄用水量，鳳仙花培育75 d。

1.4 樣品采集及測(cè)定分析

1.4.1 鳳仙花生長(zhǎng)參數(shù)測(cè)定 鳳仙花生長(zhǎng)參數(shù)包括株高、有效葉數(shù)、葉面積、莖粗、根長(zhǎng)、根體積及干物質(zhì)。株高、有效葉數(shù)、葉面積、莖粗、根長(zhǎng)采用數(shù)字尺測(cè)定，鮮質(zhì)量采用電子天平稱(chēng)量，葉面積=長(zhǎng)×寬×0.643 5，根體積采用排水法測(cè)定。以上農(nóng)藝性狀測(cè)定完畢后將鳳仙花植株105 ℃殺青 30 min，65 ℃烘干至恒質(zhì)量，記錄干物質(zhì)累積量。

1.4.2 光合色素含量及植株水分利用測(cè)定 光合色素含量測(cè)定：選取第6張(從上往下數(shù))完全展開(kāi)葉測(cè)定光合色素含量，光合色素包含葉綠素a、葉綠素b及類(lèi)胡蘿卜素，三者皆采用丙酮-乙醇混合浸提，采用紫外分光光度計(jì)分別在665、649、470 nm處測(cè)定，具體步驟參照李合生的方法。

鳳仙花植株的葉片水勢(shì)()采用TP-PW-Ⅱ自動(dòng)植物水勢(shì)儀(數(shù)顯式)測(cè)定。植株水分利用效率(WUE)=DW/用水量，式中：DW代表干質(zhì)量；植株相對(duì)含水量(RWC)采用烘干稱(chēng)質(zhì)量法測(cè)定，RWC=(FW-DW)/(TW-DW)×100%，式中：FW、DW、TW分別為鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、膨壓質(zhì)量。

1.4.3 植株滲透物質(zhì)及氧化酶活性測(cè)定 鳳仙花的丙二醛、脯氨酸、過(guò)氧化氫含量及超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、抗壞血酸過(guò)氧化物酶活性均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的相應(yīng)試劑盒測(cè)定。

1.4.4 脯氨酸合成基因相對(duì)表達(dá)水平測(cè)定 采用植物DNA提取試劑盒對(duì)鳳仙花進(jìn)行基因組總RNA的提取。通過(guò)在0.7%瓊脂糖凝膠上電泳并使用Nanodrop 2000分光光度計(jì)評(píng)估總RNA的濃度和質(zhì)量。第1鏈cDNA合成參照PrimerScript RT試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。借助Primer Express 3軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物(表1)，以肌動(dòng)蛋白基因()為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行qRT-PCR分析。使用SYBR Premix ExⅡ (TliRNaseH Plus；TaKaRa生物公司，日本)在主循環(huán)儀系統(tǒng)(ABI，生物系統(tǒng)，美國(guó))上進(jìn)行qRT-PCR分析。反應(yīng)程序、反應(yīng)條件及反應(yīng)體系參照Safari等所述。實(shí)時(shí)定量試驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔ算法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)水平計(jì)算。

表1 脯氨酸合成基因的qRT-PCR引物序列信息

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，采用鄧肯氏多重比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(=0.05)，采用Origin 8.5進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下水楊酸對(duì)鳳仙花生長(zhǎng)的影響

由表2可知，不同基質(zhì)含水率處理(WW)在地上部生長(zhǎng)參數(shù)(株高、有效葉數(shù)、葉面積、莖粗、地上部干質(zhì)量)、根系生長(zhǎng)參數(shù)(根長(zhǎng)、根體積、根系干質(zhì)量)的規(guī)律基本一致，即同一水楊酸濃度處理(SA)下，隨著基質(zhì)含水率的降低，地上部、根系生長(zhǎng)參數(shù)隨之降低。而同一基質(zhì)含水率處理下，不同水楊酸濃度處理在不同生長(zhǎng)參數(shù)指標(biāo)中表現(xiàn)不一。特別地，在上述生長(zhǎng)參數(shù)中，整體皆以水楊酸處理(SA1、SA2)下的WW95處理生長(zhǎng)最佳，在株高、有效葉數(shù)及根長(zhǎng)中，最大值皆為SA1-WW95處理，而在葉面積、莖粗、根體積、地上部干質(zhì)量、根系干質(zhì)量中，峰值皆出現(xiàn)在SA2-WW95處理，而在干旱脅迫處理(WW75、WW55)中，整體而言，以水楊酸處理(SA1、SA2)的生長(zhǎng)參數(shù)數(shù)值大于無(wú)水楊酸處理(SA0)。在株高、有效葉數(shù)及根長(zhǎng)中，其他處理較SA1-WW95處理分別降低3.38%～45.57%、5.32%～77.43%及10.46%～23.38%；在葉面積、莖粗、根體積、地上部干質(zhì)量及根系干質(zhì)量中，其他處理較SA2-WW95處理分別降低35.08%～66.42%、3.35%～54.24%、12.66%～82.76%、15.45%～83.96%及10.42%～79.17%。

表2 干旱脅迫下水楊酸對(duì)鳳仙花生長(zhǎng)參數(shù)的影響

2.2 干旱脅迫下水楊酸對(duì)鳳仙花水分利用及光合色素含量的影響

由圖1-a可知，在鳳仙花光合色素(葉綠素a、葉綠素b、類(lèi)胡蘿卜素)中，各色素含量呈葉綠素a>葉綠素b>類(lèi)胡蘿卜素。在SA與WW的組合處理中，當(dāng)水楊酸濃度一定時(shí)，隨著基質(zhì)含水率降低，上述光合色素含量均呈降低趨勢(shì)；相反地，當(dāng)培養(yǎng)基質(zhì)含水率不變時(shí)，隨著水楊酸濃度增加，上述光合色素含量均呈升高趨勢(shì)。此外，皆以SA2-WW95處理的葉綠素a、葉綠素b、類(lèi)胡蘿卜素含量最高。由圖1-b可知，在鳳仙花水分利用效率中，同一水楊酸濃度處理下，隨著基質(zhì)含水率降低，WUE呈顯著降低趨勢(shì)，同一培養(yǎng)基質(zhì)含水率處理下，隨著水楊酸濃度增加，WUE呈升高趨勢(shì)，且相應(yīng)基質(zhì)含水率的SA2處理皆顯著大于SA0處理。由圖1-c可知，在鳳仙花相對(duì)含水率中，當(dāng)水楊酸濃度處理一定時(shí)，隨著基質(zhì)含水率降低，RWC呈降低趨勢(shì)，均表現(xiàn)為WW95屯WW75處理無(wú)顯著差異，但WW95處理顯著大于WW55處理，且就WW55處理而言，以SA1、SA2處理顯著大于SA0處理。由圖1-d可知，在鳳仙花葉水勢(shì)中，SA0處理下，基質(zhì)含水率處理間呈WW95>WW75>WW55；在SA1、SA2處理中，則皆呈WW55

2.3 干旱脅迫下水楊酸對(duì)鳳仙花滲透物質(zhì)含量的影響

由圖2-a可知，在鳳仙花丙二醛含量中，隨著水楊酸濃度水平提高，MDA含量整體呈下降趨勢(shì)，且SA處理(SA0、SA1、SA2)下，基質(zhì)含水率處理均呈WW95

2.4 干旱脅迫下水楊酸對(duì)鳳仙花抗氧化酶活性的影響

由圖3-a、圖3-b可知，各處理的過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性規(guī)律基本一致，SA處理不變條件下，基質(zhì)含水率處理(WW)表現(xiàn)為WW95SA1>SA2，CAT、SOD指標(biāo)中，酶活性皆以SA0-WW55處理最高，余下處理較SA0-WW55處理在CAT、SOD活性中分別降低27.10%～80.50%、2.65%～50.96%。由圖3-c可知，在抗壞血酸過(guò)氧化物酶中，同一水楊酸施用濃度條件下，隨著基質(zhì)含水率降低，APX隨之顯著升高；APX以SA0-WW55處理活性最高，SA1-WW55處理其次，兩者無(wú)顯著差異，且皆顯著大于余下處理；此外，以SA0-WW95、SA1-WW95處理活性最低，兩者均顯著低于其他處理。

2.5 干旱脅迫下水楊酸對(duì)鳳仙花脯氨酸合成基因表達(dá)的影響

由圖4-a可知，在Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因()中，SA0、SA1、SA2條件下皆以WW55處理顯著高于WW75和WW95處理，其中在SA0處理中WW95、WW75處理較WW55處理分別顯著降低86.46%、57.14%，同理，在SA1處理中分別顯著降低75.66%、72.65%，在SA2處理中分別顯著降低60.76%、21.52%；整體來(lái)看，以SA1-WW55處理相對(duì)表達(dá)水平最高，除與SA2-WW55處理無(wú)顯著差異外皆顯著大于余下處理。由圖4-b可知，脯氨酸還原酶基因()中，隨著水楊酸施用水平增加，表達(dá)水平整體呈增加趨勢(shì)，且任一SA水平處理中，基質(zhì)含水率處理均表現(xiàn)為WW55>WW75>WW95，且兩兩處理間均差異顯著；此外，整體來(lái)看，以SA2-WW55處理表達(dá)水平最高，余下處理較其顯著降低24.40%～83.61%。

3 討論與結(jié)論

干旱脅迫是植物面臨的主要非生物脅迫之一，干旱會(huì)抑制植株的生長(zhǎng)、生理代謝及產(chǎn)量形成。水楊酸是植物莽草酸代謝途徑中的酚酸物質(zhì)，對(duì)植株生長(zhǎng)發(fā)育、開(kāi)花及信號(hào)傳導(dǎo)等一系列生理生化過(guò)程具有顯著影響。本研究中，生長(zhǎng)參數(shù)(株高、有效葉數(shù)、葉面積、莖粗、根長(zhǎng)、根體積、地上部干質(zhì)量、根系干質(zhì)量)及光合色素(葉綠數(shù)a、葉綠數(shù)b、類(lèi)胡蘿卜素)中，任一水楊酸濃度處理下，隨著基質(zhì)含水率降低，生長(zhǎng)參數(shù)、光合色素隨之降低，即表現(xiàn)為WW95>WW75>WW55，參數(shù)峰值均出現(xiàn)在WW95處理；表明隨著干旱程度加劇，植株長(zhǎng)勢(shì)受到嚴(yán)重影響。此外，就試驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)看，干旱脅迫處理(WW75、WW55)下，整體皆以SA1、SA2處理的長(zhǎng)勢(shì)參數(shù)大于SA0處理，且整體來(lái)看SA2處理長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于SA1處理。

植株水分利用強(qiáng)度是反映植物水分狀況和脫水生理的重要表征，且植株含水量可一定程度上反映植物細(xì)胞活力。本研究中，各處理鳳仙花水分利用效率及水分相對(duì)含量規(guī)律基本一致，即WW處理中均呈WW95>WW75>WW55，SA處理中表現(xiàn)為SA2、SA1>SA0；且整體來(lái)看，同一基質(zhì)含水率條件下，SA2處理在上述2個(gè)指標(biāo)皆顯著大于SA0處理(<0.05)。前人研究表明，外源施用水楊酸可有效提高苜蓿的相對(duì)含水量，維持植株生長(zhǎng)。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)論基本一致，這可能是由于外源水楊酸為信號(hào)小分子物質(zhì)，可介導(dǎo)氣孔關(guān)閉，從而重分配水分及維持植株含水量的緣故。干旱條件下維持較高葉水勢(shì)的能力是植物抗旱性的重要機(jī)制。本研究中，SA0處理下，隨著基質(zhì)含水率降低，葉水勢(shì)隨之減小，而在SA1、SA2處理下，皆以WW75處理水勢(shì)最大，這從側(cè)面說(shuō)明，當(dāng)輕度干旱脅迫處理下，外源噴施水楊酸是較為理想的抗旱策略。

干旱脅迫會(huì)破壞電子傳遞鏈，導(dǎo)致葉綠體、線粒體、過(guò)氧化物酶體以及質(zhì)膜中電子傳遞副產(chǎn)物ROS含量增加，積累的ROS會(huì)損害蛋白質(zhì)、核酸、膜脂和其他細(xì)胞成分，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激。本研究中，與WW95處理相比，WW75和WW55處理的MDA和HO含量更高，表明輕度、中度干旱皆對(duì)鳳仙花造成了過(guò)氧脂質(zhì)損傷。進(jìn)一步研究表明，各處理CAT、SOD、APX活性與MDA、HO含量呈相同趨勢(shì)，且隨著水楊酸施用水平升高，抗氧化系統(tǒng)相關(guān)酶活性隨之降低。這意味著干旱條件下，SA可調(diào)節(jié)抗氧化酶活性從而降低鳳仙花植株的ROS累積及膜脂過(guò)氧化損傷，這與相關(guān)研究結(jié)果趨于一致。

為了應(yīng)對(duì)水分不足，植物細(xì)胞可以通過(guò)生物合成和積累相容溶質(zhì)(如脯氨酸)來(lái)降低其滲透勢(shì)并保持細(xì)胞膨壓，脯氨酸的生物合成涉及谷氨酸(Glu)和鳥(niǎo)氨酸(Orn)途徑。谷氨酸可以通過(guò)Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶還原為谷氨酸-半醛，并自發(fā)地轉(zhuǎn)化為Δ1-吡咯啉-5-羧酸，然后被Δ1-吡咯啉-5-羧酸還原為脯氨酸還原酶。本研究中，各處理的Pro含量與抗氧化酶(CAT、SOD、APX)活性規(guī)律呈相反趨勢(shì)，SA的外源應(yīng)用刺激了干旱脅迫植物中脯氨酸的積累，尤其表現(xiàn)在中等干旱程度處理(WW55)。在脯氨酸合成的2個(gè)酶基因(、)中，隨著干旱程度加劇，、被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，且同一干旱程度水平下，SA處理(SA1、SA2)整體大于SA0處理，尤其表現(xiàn)在SA2處理。再次表明高水平的水楊酸施用處理效果較優(yōu)。綜上，干旱脅迫下外源葉施水楊酸可有效改善鳳仙花的生長(zhǎng)發(fā)育，保護(hù)光合膜和色素防止葉綠素降解。此外可提高抗氧化酶活性，上調(diào)、基因表達(dá)從而提高脯氨酸含量，減少干旱脅迫導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化損傷。