外源植物激素對(duì)‘赤霞珠’葡萄冬芽萌發(fā)的影響

張鴻雁，陳莉，屈嘉燕，李少華，曾青青，張鵬，管雪強(qiáng)，張克坤，房玉林*，陳可欽*

（1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西楊凌 712100/西北農(nóng)林科技大學(xué)合陽葡萄試驗(yàn)示范站，陜西合陽 715300/西北農(nóng)林科技大學(xué)寧夏賀蘭山東麓葡萄酒試驗(yàn)示范站，寧夏永寧 750104；2. 山東省葡萄研究院，濟(jì)南 250100/山東省釀酒葡萄與葡萄酒技術(shù)創(chuàng)新中心，山東煙臺(tái) 265608）

與其他多年生植物類似，葡萄進(jìn)化出了冬季休眠策略，以抵御寒冷威脅。冬芽休眠不僅是葡萄生存的有效生物學(xué)特性，也是影響葡萄生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)性的生物學(xué)事件。休眠和萌發(fā)是兩個(gè)連續(xù)的生物過程，芽休眠是溫帶落葉果樹的一種適應(yīng)機(jī)制[1]，在休眠期間，植物生長(zhǎng)受到抑制，細(xì)胞分裂受阻，呼吸和代謝活動(dòng)減緩，使植物適應(yīng)季節(jié)性環(huán)境變化，并能夠在惡劣的冬季環(huán)境中生存，只有在環(huán)境適合時(shí)芽才能進(jìn)入萌發(fā)狀態(tài)。在休眠階段，芽的萌發(fā)受到外部或內(nèi)部信號(hào)的抑制，根據(jù)抑制信號(hào)的不同，可將每年的休眠周期劃分為3個(gè)階段：類休眠（Paradormancy，PD）、內(nèi)休眠（Endodormancy，ED）和生態(tài)休眠（Ecodormancy，ECD）[2]。類休眠是由分生組織外的因子引起的植物生長(zhǎng)暫停，本質(zhì)上是一個(gè)器官對(duì)另一個(gè)器官的影響，例如芽的頂端優(yōu)勢(shì)。內(nèi)休眠發(fā)生在寒冷月份，此時(shí)芽的發(fā)育受到分生組織或附近組織中生理因素的調(diào)控，如低溫或光周期變化[3]，觸發(fā)了芽向內(nèi)休眠的轉(zhuǎn)變，在此階段，溫度或營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)（碳水化合物、營(yíng)養(yǎng)素等）的增加無法刺激芽重新生長(zhǎng)。生態(tài)休眠標(biāo)志著休眠的最后階段，此時(shí)芽已經(jīng)恢復(fù)了生長(zhǎng)能力，但受到不利氣候條件的影響沒有萌發(fā)，通常發(fā)生在內(nèi)休眠完成后（已滿足低溫要求）。

植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要信號(hào)通路[4]，控制著植物生長(zhǎng)發(fā)育的大多數(shù)路徑。植物激素在整個(gè)生命周期中調(diào)節(jié)發(fā)育和生長(zhǎng)，并觸發(fā)由環(huán)境變化和生物或非生物脅迫等外部刺激誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)。植物激素自發(fā)現(xiàn)以來一直是人們研究的熱點(diǎn)，影響著植物生長(zhǎng)發(fā)育的方方面面。近年來，大量植物激素的合成、信號(hào)途徑等突變體被分離、鑒定，相應(yīng)基因被克隆和研究，使人們對(duì)于植物激素在調(diào)控植物芽的生長(zhǎng)發(fā)育方面也有了比較深入的了解。大量研究表明，許多植物激素參與了芽休眠的高度復(fù)雜的協(xié)調(diào)過程[5-9]，尤其是生長(zhǎng)素、脫落酸和赤霉素。生長(zhǎng)素被認(rèn)為在類休眠中起重要作用，調(diào)控葡萄芽從類休眠向生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)變[10]；隨著時(shí)間的推移，在單芽扦插中，生長(zhǎng)素生物合成基因的表達(dá)增加，強(qiáng)烈表明生長(zhǎng)素促進(jìn)葡萄芽萌發(fā)[11]。長(zhǎng)期以來，外源赤霉素一直被用于打破休眠和促進(jìn)芽萌發(fā)，但其在解除休眠中的作用因物種而異[12]。在葡萄芽自然休眠過程中，赤霉素生物合成基因的表達(dá)水平通常在休眠解除期間增加[13]；脫落酸被認(rèn)為是進(jìn)入休眠的關(guān)鍵內(nèi)部因素，并參與休眠誘導(dǎo)和維持[7]，并且在內(nèi)休眠階段是芽生長(zhǎng)的主要抑制因子[10]；脫落酸水平的增加是植物芽和種子休眠的開始[14-15]。目前，不同激素對(duì)葡萄冬芽萌發(fā)的影響已有研究，但不同激素間作用效果的差異以及各類激素的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步挖掘。

本研究以一年生的‘赤霞珠’枝條為試材，研究不同外源激素處理下葡萄冬芽的萌發(fā)和發(fā)育狀況，并檢測(cè)不同處理下冬芽過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（OFR）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、以及植物淀粉、果糖（FT）、可溶性糖和總蛋白質(zhì)含量，闡明冬芽萌發(fā)過程與生理生化特性的相關(guān)性，為葡萄冬芽萌發(fā)調(diào)控措施的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料‘赤霞珠’于2018年定植在陜西省楊凌農(nóng)業(yè)示范區(qū)西北農(nóng)林科技大學(xué)曹辛莊葡萄示范基地。株行距1.5 m×3 m，南北行向，常規(guī)管理。

1.2 激素處理

于2022年2月26日，采集長(zhǎng)勢(shì)一致、無病害的一年生枝條，選擇健壯、飽滿的冬芽，上切口平剪、下切口斜削，制備單芽插條。

基于實(shí)驗(yàn)室前期研究的葡萄冬芽相關(guān)激素檢測(cè)結(jié)果（數(shù)據(jù)未發(fā)表），選擇使用200 mg·L-1脫落酸（ABA）、25 mg·L-1的吲哚-3-甲酸（ICA）、20 mg·L-1赤霉素（GA7）、20 mg·L-1氟啶酮、100 mg·L-12,3,5- 三碘苯甲酸（TIBA）和1000 mg·L-1多效唑于2022年2月26日采集當(dāng)天對(duì)冬芽進(jìn)行涂抹（0 d），共計(jì)6種處理，以清水涂抹作對(duì)照。將枝條插在沙子中，定期澆水使水位保持稍沒過沙子。于25 ℃長(zhǎng)日照（16 h/8 h）光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察萌芽率，每6 d觀察冬芽發(fā)育情況。采集激素處理后0、6、12、18 d的冬芽，沿冬芽四周將枝干和多余組織剪除，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 萌芽率調(diào)查及冬芽萌發(fā)過程觀察

以冬芽鱗片開裂，露出清晰可見的綠色組織視為芽萌發(fā)，萌芽率以百分比計(jì)算。

每組隨機(jī)選擇3～4個(gè)激素處理后0、6、12 d的單芽插條（因18 d芽已萌發(fā)到幼葉出現(xiàn)期，故未觀察）。使用體視鏡（徠卡顯微系統(tǒng)有限公司、M205FCA型號(hào)）觀察冬芽正視圖和側(cè)視圖，手動(dòng)切片后觀察冬芽橫切面和縱切面的結(jié)構(gòu)變化。

1.4 生理數(shù)據(jù)

使用中通量組織研磨儀（北京鼎昊源科技有限公司，TL-2010S）液氮粉碎樣品。每個(gè)處理組的冬芽樣品設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。正式測(cè)定之前選擇2～3個(gè)預(yù)期差異大的樣品做預(yù)測(cè)定。18 d的樣本已萌發(fā)為新梢，因此未曾檢測(cè)相關(guān)生理指標(biāo)，僅用于統(tǒng)計(jì)萌芽率。

過氧化氫、超氧陰離子、超氧化物歧化酶、丙二醛、植物淀粉、果糖、植物可溶性糖和雙縮脲法蛋白質(zhì)含量測(cè)定用試劑盒均購于蘇州科銘生物技術(shù)有限公司，檢測(cè)步驟及數(shù)值計(jì)算方法參考試劑盒說明書。

1.5 數(shù)據(jù)處理

每項(xiàng)生理指標(biāo)的測(cè)定設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。使用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和繪圖，使用SPSS進(jìn)行差異顯著性分析。聚類分析利用聯(lián)川生物云平臺(tái)（https://www.omicstudio.cn/tool）完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源植物激素對(duì)葡萄冬芽萌芽率的影響

統(tǒng)計(jì)不同激素處理下葡萄冬芽的萌芽率（圖1）。與對(duì)照相比，TIBA促進(jìn)萌芽，多效唑、氟啶酮和ICA的萌芽率與對(duì)照基本一致，ABA、GA7抑制冬芽萌發(fā)。18 d時(shí)萌芽率除GA7處理組（63. 93%）外均超過90%。

2.2 體視鏡觀察冬芽萌發(fā)過程

如圖2所示，在體視鏡下觀察不同時(shí)期的葡萄冬芽的發(fā)育狀況。0 d時(shí)，各組冬芽芽鱗閉合，呈棕黃色，鱗片內(nèi)絨毛排列緊實(shí)且厚。6 d時(shí)，冬芽開始膨大，芽鱗依舊閉合，但是從冬芽的縱切面來看，芽軸開始伸長(zhǎng)并向四周生長(zhǎng)，對(duì)照組、TIBA、多效唑和氟啶酮處理組冬芽頂端絨毛露出。12 d時(shí)，芽鱗破開，冬芽頂端黃色絨毛清晰可見，除ICA、GA7、ABA和氟啶酮處理組仍然看不到冬芽的綠色組織破出鱗片之外，對(duì)照組、TIBA和多效唑處理組已可見綠色組織，包被冬芽的絨毛被撐破，切面節(jié)間長(zhǎng)度增加。其中GA7處理組冬芽結(jié)構(gòu)變化最小，TIBA處理組冬芽萌發(fā)最旺盛。

2.3 葡萄冬芽萌發(fā)過程中各生理指標(biāo)的變化

2.3.1 過氧化氫和超氧陰離子含量變化情況

H2O2和OFR是生物體內(nèi)最常見的活性氧分子。隨著葡萄冬芽發(fā)育H2O2含量先降低后升高（圖3）。各激素處理下H2O2含量6 d時(shí)差異不顯著；12 d時(shí)激素處理組TIBA、多效唑的H2O2含量偏高，而ICA、氟啶酮、ABA處理后H2O2含量升高較緩，GA7處理下H2O2含量偏低。

隨著葡萄冬芽的發(fā)育，對(duì)照組OFR含量先升高后降低，ICA和TIBA處理組的OFR含量下降，GA7、ABA和氟啶酮處理組的OFR含量先降低后升高，多效唑處理組的OFR含量幾乎不變（圖3）。6 d時(shí)，處理組的OFR含量都顯著低于對(duì)照組；12 d時(shí)，除了TIBA處理組外，其他處理組的OFR含量都顯著高于對(duì)照組。

2.3.2 SOD酶活性和MDA含量的變化

SOD可以在生物體內(nèi)催化超氧陰離子自由基生成氧和過氧化氫，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用。檢測(cè)冬芽萌芽期間SOD酶活性，發(fā)現(xiàn)其含量隨芽的發(fā)育而逐漸上升（圖4）。與對(duì)照相比，6 d時(shí)各激素處理下酶活性差異不顯著，ABA處理下酶活性低于對(duì)照，其余處理酶活性高于對(duì)照；12 d時(shí)，多效唑和氟啶酮處理下的冬芽酶活性顯著高于對(duì)照，GA7顯著低于對(duì)照，其余激素處理下酶活性差異不顯著。相對(duì)應(yīng)的，GA7與ABA處理均顯著降低芽的萌發(fā)率（圖1）。

MDA是膜脂過氧化的重要產(chǎn)物之一，通過檢測(cè)MDA水平即可檢測(cè)脂質(zhì)氧化的水平。隨著冬芽的發(fā)育，MDA含量整體呈下降趨勢(shì)，但下降幅度不大，說明膜脂過氧化程度較低或清除MDA的能力較強(qiáng)。同時(shí)，12 d時(shí)ICA、GA7、ABA處理組的冬芽MDA含量分別小于TIBA、多效唑、氟啶酮處理組的冬芽，但各處理組MDA含量的差異不顯著。

2.3.3 糖類物質(zhì)與蛋白質(zhì)含量的變化

隨著冬芽的發(fā)育，植物淀粉含量在下降（圖5），但氟啶酮處理在6 d時(shí)淀粉含量比0 d時(shí)高，之后淀粉含量下降。與對(duì)照組相比，所有激素組處理后的冬芽淀粉含量均高于對(duì)照組。

植物可溶性糖包括葡萄糖、果糖、蔗糖等，在休眠到萌芽期間，植物淀粉可以轉(zhuǎn)化為可溶性糖，為植物生長(zhǎng)提供可利用的能量。檢測(cè)了果糖在休眠到萌芽期間的變化（圖5），隨著葡萄冬芽的發(fā)育，冬芽中的果糖含量先下降后上升。6 d時(shí)各組果糖含量達(dá)到最低值，各組含量果糖差別不顯著；12 d時(shí)果糖含量升高，其中ABA處理組果糖含量最高，TIBA處理組果糖含量最低。隨著葡萄冬芽的發(fā)育，冬芽中的植物可溶性糖含量呈下降趨勢(shì)（圖5）。12 d時(shí)各激素處理組植物可溶性糖含量都高于對(duì)照組。

可溶性蛋白含量可反映植物的代謝水平，葡萄冬芽的可溶性蛋白質(zhì)含量如圖5所示。各組冬芽可溶性蛋白質(zhì)含量總趨勢(shì)表現(xiàn)為先下降后上升，其中在6 d時(shí)含量最低，隨著休眠的結(jié)束，可溶性蛋白含量升高。6 d時(shí)ABA處理組可溶性蛋白含量低于對(duì)照組，12 d時(shí)ABA和氟啶酮處理組蛋白含量低于對(duì)照組，其余處理蛋白含量均高于對(duì)照組。

2.3.4 聚類分析

不同激素處理組以12 d的8種生理指標(biāo)進(jìn)行層次聚類分析表明（圖6），ICA處理組的生理指標(biāo)成分含量與CK接近；多效唑與氟啶酮處理組可聚為一類；GA7處理組與其他處理組成分含量有較大差異。

3 結(jié)論與討論

葡萄冬芽的萌發(fā)是一個(gè)漸進(jìn)的過程，通過觀察各處理組冬芽的外部特征和內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征變化，可以判斷冬芽發(fā)育情況。在試驗(yàn)中，TIBA處理組冬芽的萌芽率高，多效唑、氟啶酮和ICA處理組的萌芽率與對(duì)照組基本一致，ABA和GA7處理組萌芽率低于對(duì)照組，且GA7處理組萌芽率最低。體視鏡觀察發(fā)現(xiàn)，TIBA處理組冬芽結(jié)構(gòu)變化最大，萌發(fā)旺盛，而GA7處理組冬芽結(jié)構(gòu)變化最小，內(nèi)部生長(zhǎng)緩慢，各結(jié)構(gòu)雖發(fā)育但未成形。

葡萄冬芽?jī)?nèi)的生理指標(biāo)變化與冬芽休眠的促進(jìn)和解除有關(guān)，該類指標(biāo)可在一定程度上表征葡萄冬芽的休眠進(jìn)程。植物組織在自然休眠和休眠解除過程中的活性氧主要有H2O2和OFR等，抗氧化酶主要有SOD。試驗(yàn)中冬芽萌發(fā)時(shí)，TIBA處理提高了H2O2含量，GA7處理降低了H2O2含量。TIBA處理使OFR含量顯著降低，其余處理OFR含量顯著升高。冬芽的發(fā)育使植物體中產(chǎn)生并積累了活性氧，SOD酶活性呈上升趨勢(shì)，以保護(hù)膜質(zhì)過氧化損害細(xì)胞。GA7處理顯著降低了SOD酶活性，而其余處理組SOD酶活性升高。MDA含量反映了植物體脂質(zhì)過氧化的程度。葡萄冬芽MDA含量呈下降趨勢(shì)，說明植物體內(nèi)膜脂過氧化程度減小。

糖類物質(zhì)在植物體內(nèi)既是碳源，也是能量的主要來源，也可作為影響芽生長(zhǎng)的信號(hào)分子[16]。因此，可以從碳水化合物變化的角度來描述休眠釋放和芽萌發(fā)過程。葡萄冬芽在休眠解除的過程中，淀粉含量下降，這與鄭鵬華[17]的研究結(jié)果一致。與對(duì)照相比，6種激素處理均提高了冬芽的淀粉含量，其中GA7處理組淀粉含量顯著增加。果糖含量先下降后上升，其中ABA處理組果糖含量最高，這與Khalil-Ur-Rehman等[18]的研究結(jié)果一致；TIBA和GA7處理降低了果糖含量。孫凌俊等[19]發(fā)現(xiàn)，‘巨峰’葡萄枝條的可溶性糖含量在休眠解除過程中逐漸降低。本試驗(yàn)中冬芽可溶性糖含量隨著休眠的解除而下降，可溶性糖的快速消耗，表明芽的代謝活性已經(jīng)增強(qiáng)，6種激素處理均可提高冬芽的可溶性糖含量。試驗(yàn)中可溶性蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)出先降低再升高的過程，前期的降低可為冬芽打破休眠開始萌發(fā)做物質(zhì)準(zhǔn)備，隨著休眠的解除，可溶性蛋白積累以滿足冬芽萌發(fā)的營(yíng)養(yǎng)需求。試驗(yàn)中ABA和氟啶酮處理組可溶性蛋白含量降低，其余處理組可溶性蛋白含量增加。

植物激素是調(diào)控植物芽休眠過程的重要內(nèi)部因素。TIBA通過與生長(zhǎng)素結(jié)合受體抑制生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸，以降低生長(zhǎng)素的作用效力，是一種具有微弱生長(zhǎng)素作用的抗生長(zhǎng)素。本研究中，外源TIBA處理提高了葡萄冬芽的萌芽率，冬芽?jī)?nèi)部結(jié)構(gòu)變化大，冬芽中H2O2含量上升，超氧陰離子含量降低，SOD酶活性升高，植物淀粉含量升高，果糖含量下降，說明在葡萄冬芽生長(zhǎng)發(fā)育過程中，外源TIBA處理可以促進(jìn)葡萄冬芽的生長(zhǎng)和發(fā)育。但外源ICA處理對(duì)冬芽休眠的解除沒有顯著影響。GA7在葡萄冬芽上的作用則與TIBA正好相反，GA7處理下葡萄冬芽萌芽率降低，冬芽?jī)?nèi)部結(jié)構(gòu)特征變化小，H2O2含量顯著低于其他處理組，超氧陰離子含量上升，SOD酶活性降低。岳海英等[20]在‘紅地球’葡萄上施用赤霉素未發(fā)現(xiàn)有促進(jìn)冬芽萌發(fā)的作用。Zheng等[11]推測(cè)赤霉素在葡萄上的作用是促進(jìn)芽萌發(fā)后的生長(zhǎng)發(fā)育，但對(duì)萌芽前休眠的打破存在負(fù)面效應(yīng)。

以上結(jié)果表明，葡萄冬芽萌發(fā)過程中其活性氧、保護(hù)酶活性和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的變化具有一定的規(guī)律性。植物激素參與調(diào)控‘赤霞珠’葡萄冬芽的萌發(fā)，其中，TIBA處理促進(jìn)葡萄冬芽的萌發(fā)，而GA7處理對(duì)冬芽的萌發(fā)表現(xiàn)出抑制作用。