影響‘41B’葡萄體細(xì)胞胚誘導(dǎo)因素的研究

張凱，袁昀章，常欣玉，馬靖，劉慧，陳文婷，譚君，楊國(guó)順，白描*

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128）

葡萄中體細(xì)胞胚（somatic embryo，SE）的誘導(dǎo)是最適宜的轉(zhuǎn)基因途徑之一[1]，也是誘導(dǎo)體細(xì)胞無(wú)性系變異的重要策略。體細(xì)胞胚可超低溫保存，用于研究胚胎發(fā)育以及獲得無(wú)病毒植株[2-4]。體細(xì)胞胚發(fā)生包括胚性細(xì)胞（embryonic cell，EC）的獲得、體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)（somatic embryo induction，SEI）和胚性細(xì)胞的維持（embryonic cells maintenance，ECM）等過(guò)程。Mullins等[5]于1976年首次報(bào)道了‘赤霞珠’采用液體培養(yǎng)進(jìn)行體細(xì)胞胚發(fā)生再生植株的方法。Krul等[6]在固體瓊脂培養(yǎng)基條件下，從雜交葡萄‘Seyval’的愈傷組織中獲得了體細(xì)胞胚。隨后，其他品種也被證明能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性細(xì)胞，不同的外植體如葉片、花藥、合子胚、子房和種子等被用于胚性細(xì)胞的獲得，并進(jìn)行體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)[1,7-8]。在液體培養(yǎng)基中，可以獲得大量體細(xì)胞胚，但大多數(shù)胚胎表現(xiàn)異常，很難恢復(fù)為正常的植株[9-10]。

在葡萄屬植物中，未成熟的花藥是應(yīng)用最廣泛的外植體，子房和全花也被證明適合體細(xì)胞胚發(fā)生，而其他外植體很少被使用[11-12]。近年來(lái)已經(jīng)發(fā)布了一些體細(xì)胞胚發(fā)生的方案，其中‘41B’葡萄是早期發(fā)現(xiàn)具有很強(qiáng)再生能力的品種?！?1B’為歐美雜交種（Vitis viniferaChasselas×Vitis berlandieri），用其花藥可培養(yǎng)出二倍體細(xì)胞。該細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)中容易形成均勻的細(xì)胞團(tuán)，擴(kuò)繁培養(yǎng)方便，同時(shí)顯示出良好的產(chǎn)生球形和心形胚胎的能力。但隨后胚胎的進(jìn)一步發(fā)育受阻，大部分成為畸形苗，只有少數(shù)能發(fā)育成正常苗[13]。

為明確‘41B’細(xì)胞再生能力的發(fā)生條件和作用機(jī)理，為其他品種的體細(xì)胞胚發(fā)生提供參考。本研究比較了不同物質(zhì)或處理對(duì)‘41B’細(xì)胞的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的影響，對(duì)處理后體細(xì)胞誘導(dǎo)效率和同步性等進(jìn)行了檢測(cè)，研究結(jié)果可加深對(duì)限制葡萄體細(xì)胞發(fā)生因素的認(rèn)識(shí)，也可為葡萄體細(xì)胞胚誘導(dǎo)相關(guān)研究試驗(yàn)處理的設(shè)置提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究材料

‘41B’胚性細(xì)胞分離自其花藥，來(lái)自中科院北京植物園代占武實(shí)驗(yàn)室。GM固體基本培養(yǎng)基（GMS）配方和配制方法參考文獻(xiàn)[14]，所用試劑均購(gòu)自Sigma或索萊寶等公司。其中，植物瓊脂（P1001）、1/2MS大量購(gòu)自Duchefa；反式玉米素核苷（ZR，Z3541）、6-芐基腺嘌呤（6-BA，B3408）、噻苯?。═DZ，P6186）、甘油（G5516）、生物素（B4639）、煙酸（N0761）、硫胺素（T4625）、鹽酸吡哆醇（P9755）、肌醇（I7508）均購(gòu)買(mǎi)自Sigma?；钚蕴浚╝ctivated charcoal，AC）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D，D8100）、萘氧乙酸（NOA，B8400）、透析膜（dialysis membranes，DM，Y1071）、脫落酸（ABA，A8060）、丁酸鈉（NaB，IS0190）、麥芽糖（D8110）和蔗糖均購(gòu)自索萊寶公司。

1.2 研究方法

‘41B’胚性細(xì)胞的維持和擴(kuò)繁采用GMS+1 mg·L-1NOA（pH=6.8）培養(yǎng)基，置于25 ℃培養(yǎng)箱，黑暗條件下培養(yǎng)。體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)條件：將細(xì)胞置于25 ℃，光強(qiáng)4000 Lux的培養(yǎng)箱中，光周期為16 h/8 h（光照/黑暗）。

‘41B’細(xì)胞在GMS基礎(chǔ)培養(yǎng)基上進(jìn)行體細(xì)胞胚誘導(dǎo)。GMS基礎(chǔ)培養(yǎng)基為：1/2MS＋微量（0.05 mg·L-1生物素＋0.5 mg·L-1硫胺素＋5 mg·L-1煙酸＋0.5 mg·L-1鹽酸吡哆醇＋100 mg·L-1肌醇）＋4.6 g·L-1甘油＋18 g·L-1麥芽糖＋7 g·L-1瓊脂。以GMS為基本培養(yǎng)基，在其基礎(chǔ)上進(jìn)行設(shè)置（表1），化合物濃度（標(biāo)注）如下：1 g·L-1PVP（P1）；3 g·L-1（AC3）或6 g·L-1（AC6）活性炭；1 mg·L-1或2 mg·L-1的三種不同類型的細(xì)胞分裂素（分別標(biāo)注為ZR1、ZR2；TDZ1、TDZ2；6-BA1、6-BA2）；透析膜（DM）；0.05 g·L-1（NaB0.05）和0.5g·L-1（NaB0.5）的丁酸鈉；0.1 mg·L-1（ABA0.1）或1 mg·L-1（ABA1）脫落酸；添加20 g·L-1蔗糖（S20）或?qū)⒏视秃望溠刻翘鎿Q為20 g·L-1（GMS(-G/M)＋S20）或60 g·L-1（GMS(-G/M)＋S60）蔗糖。

表1 所采用的培養(yǎng)基Table 1 Media used in this study

在超凈工作臺(tái)上，接種‘41B’細(xì)胞。接種量為每個(gè)平板（9 cm×2 cm）接種100 μL細(xì)胞（在1 g離心率下沉降），用勺子攤平，直徑約為5 cm。接種細(xì)胞后，每天用體視顯微鏡（OLYMPUS，SZX7）進(jìn)行觀察，并記錄生長(zhǎng)狀態(tài)。不同類型的細(xì)胞狀態(tài)不同：‘41B’胚性細(xì)胞整體上呈黃色疏散狀，非胚性細(xì)胞/愈傷呈現(xiàn)白色透明松軟狀，體細(xì)胞胚（球形胚）呈現(xiàn)白色致密球狀。

由于原接種細(xì)胞和形成球形胚的數(shù)目很難定量，為表征SEI速度和同步性，將形成球形胚占接種細(xì)胞面積的百分比來(lái)進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)。每天觀察記錄，重復(fù)3次。文中FD：表示開(kāi)始發(fā)現(xiàn)有球形胚時(shí)所經(jīng)歷的天數(shù)；FD＞10%：表示當(dāng)細(xì)胞中球形胚達(dá)到總體細(xì)胞團(tuán)面積的10%左右時(shí)所經(jīng)歷的天數(shù)；FD＞50%：表示當(dāng)細(xì)胞中球形胚達(dá)到總體細(xì)胞團(tuán)面積的50%左右時(shí)所經(jīng)歷的天數(shù)；RSE/30 d：指培養(yǎng)30 d后球形胚占胚性細(xì)胞總體細(xì)胞團(tuán)面積的比率。同時(shí)對(duì)‘41B’細(xì)胞褐化程度進(jìn)行排序：0代表該細(xì)胞狀態(tài)良好，所有細(xì)胞呈現(xiàn)淡黃色，幾乎沒(méi)有褐化；1代表細(xì)胞有褐化出現(xiàn)；5代表有一定程度（0～10%）褐化；7代表中度（10.01%～15%）褐化和9代表出現(xiàn)嚴(yán)重（＞25%）褐化。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄體細(xì)胞胚形成的各個(gè)階段

‘41B’體細(xì)胞胚誘導(dǎo)過(guò)程中不同階段細(xì)胞狀態(tài)如圖1所示?！?1B’葡萄胚性細(xì)胞維持在培養(yǎng)基M1（GMS＋P1＋NOA1）中（圖1A）。在轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基T1（GMS）后，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)經(jīng)歷了球形胚（圖1B）、心形胚、魚(yú)雷胚和子葉胚（圖1C）以及胚萌發(fā)和成苗過(guò)程。球形胚為白色致密球狀；體細(xì)胞胚發(fā)育速度不一致，心形胚、魚(yú)雷胚和子葉胚可能同時(shí)出現(xiàn)（圖1D）。而在T1培養(yǎng)基上，幾乎所有體細(xì)胞胚萌發(fā)后都為畸形（圖1E和1F）。

2.2 活性炭和生長(zhǎng)素對(duì)胚性細(xì)胞維持的影響

本研究對(duì)影響胚性細(xì)胞維持的條件進(jìn)行了調(diào)查，在不同培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)30 d后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）活性炭（AC）除了顯著抑制褐化外，其非選擇性吸附作用對(duì)激素濃度的影響顯著。胚性細(xì)胞（EC）可以在含生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中維持（M2：GMS＋P1＋NOA1或M4：GMS＋P1＋2,4-D1）；但當(dāng)有3 g·L-1AC存在時(shí)，即使含有NOA（1 mg·L-1或4 mg·L-1），EC也極易誘導(dǎo)為SE；而1 mg·L-12,4-D對(duì)胚性細(xì)胞維持的作用不能被AC抑制（圖2A）。（2）胚性細(xì)胞維持過(guò)程中不同生長(zhǎng)素對(duì)后續(xù)體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)影響不同。相對(duì)于NOA，2,4-D處理會(huì)抑制后續(xù)成胚能力（圖2B），這可能與2,4-D在細(xì)胞中穩(wěn)定而難以去除有關(guān)。

2.3 不同化合物對(duì)‘41B’體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的影響

在不同處理后，每天記錄各個(gè)處理球形胚所占的比例和褐化狀態(tài)，持續(xù)觀察30 d，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2。

2.3.1 活性炭和PVP對(duì)葡萄體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的影響

‘41B’細(xì)胞在T1培養(yǎng)基（GMS）中，細(xì)胞褐化較嚴(yán)重（圖3A）；在添加PVP（T2）后對(duì)減輕細(xì)胞褐化有一定程度的改善，但不明顯（圖3B）；而添加3 g·L-1（T3）和6 g·L-1（T4）AC，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，幾乎無(wú)褐化現(xiàn)象，且相對(duì)T2發(fā)育速度加快（圖3C和3D）。AC對(duì)SEI速度有一定程度的提高（表2）：T2（GMS＋P1）和T3（GMS＋P1＋AC3）處理第12天左右開(kāi)始成胚，分別培育18 d和21 d后成胚比例達(dá)到50%（表2），而T4（GMS+P1+AC6）處理第8天開(kāi)始成胚，18 d后成胚比例達(dá)到50%。

表2 不同化合物或處理對(duì)葡萄體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的影響Table 2 Effects of different compounds or treatments on grape somatic embryo induction

2.3.2 細(xì)胞分裂素對(duì)葡萄體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的影響

‘41B’胚性細(xì)胞在含有1 mg·L-1或2 mg·L-1三種不同類型的細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞分裂素顯著抑制了SEI，且不同類型細(xì)胞分裂素具有一定差異（圖3E-J）。ZR對(duì)SEI的抑制作用相對(duì)弱于6-BA和TDZ。兩個(gè)濃度下6-BA和TDZ以及2 mg·L-1的ZR顯著促進(jìn)非胚性愈傷的形成。

2.3.3 丁酸鈉對(duì)葡萄體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的影響

低濃度NaB（0.05 g·L-1）的處理加速了SE的形成，但對(duì)體細(xì)胞胚比例無(wú)明顯影響（圖3K，表2）。高濃度NaB（0.5 g·L-1）對(duì)細(xì)胞具有殺傷作用，致使‘41B’細(xì)胞死亡（圖3L）。另外，還嘗試了在NaB（0.5 g·L-1）基礎(chǔ)上添加AC（3 g·L-1），發(fā)現(xiàn)NaB沒(méi)有完全致死細(xì)胞，但促進(jìn)了非胚性細(xì)胞的增殖，進(jìn)而抑制SEI。

2.3.4 透析膜對(duì)葡萄體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的影響

將細(xì)胞置于透析膜（DM）上（T11：GMS＋P1＋DM）進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞胚出現(xiàn)速度加快，在第8天就有出現(xiàn)；但是在培養(yǎng)10 d后，開(kāi)始干燥泛白、褐化嚴(yán)重，后期體細(xì)胞胚無(wú)法正常發(fā)育（表2，圖3M）；DM外和DM上的胚性細(xì)胞有明顯的區(qū)別，DM外或其邊緣胚性細(xì)胞通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基上營(yíng)養(yǎng)和水分的吸收，在21 d后開(kāi)始出現(xiàn)體細(xì)胞胚，且部分體細(xì)胞胚提前萌發(fā)（圖3N），而在DM上的細(xì)胞出現(xiàn)脫水現(xiàn)象，這可能與透析膜兩邊，細(xì)胞和培養(yǎng)基之間的滲透壓差太大有關(guān)。

2.3.5 ABA對(duì)葡萄體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的影響

本研究調(diào)查了ABA對(duì)SEI的影響。發(fā)現(xiàn)隨著濃度提高，ABA對(duì)SEI的抑制作用加劇，0.1 mg·L-1和1 mg·L-1ABA可顯著抑制體細(xì)胞胚的形成，且抑制后續(xù)的萌發(fā)（圖3O和3P）；但當(dāng)有3 g·L-1AC存在時(shí)，1 mg·L-1ABA卻加速了部分體細(xì)胞胚的萌發(fā)（圖3Q）。由于不能確定AC濃度與吸附效率的關(guān)系，加上其吸附作用可能沒(méi)有選擇性，因此很難判斷ABA的有效濃度。與未加ABA的對(duì)照（T2，圖3B）比較，低濃度的ABA可能促進(jìn)體細(xì)胞胚的萌發(fā)。

2.3.6 不同碳源及濃度對(duì)葡萄體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的影響

GMS中碳源為麥芽糖和甘油，本研究以20 g·L-1蔗糖替換該碳源（T17：GMS(-G/M)＋S20＋P1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)SEI起始沒(méi)有明顯加快，但后期速度加快，體細(xì)胞胚出現(xiàn)更加同步；不過(guò)有部分體細(xì)胞胚發(fā)育加快，且有明顯的褐化（表2，圖3R）。在T17基礎(chǔ)上添加AC后（T18），形成體細(xì)胞胚速度減慢，體細(xì)胞胚形成的同步性變差，且伴隨部分非胚性細(xì)胞的增殖（表2，圖3S）；而當(dāng)蔗糖提高到60 g·L-1，SEI速度加快，且體細(xì)胞胚形成的同步性顯著提高，SE呈乳白色，后續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)萌發(fā)速度顯著減慢（表2，圖3T）。

3 討論與結(jié)論

在SEI過(guò)程中，各種培養(yǎng)條件和化合物的使用被提及。首先，生長(zhǎng)素被證明是胚性細(xì)胞維持的關(guān)鍵，而外源生長(zhǎng)素去除是SEI的關(guān)鍵。在高濃度的生長(zhǎng)素處理下，一些特定的細(xì)胞有機(jī)會(huì)獲得再生能力，隨后降低生長(zhǎng)素濃度有利于胚性細(xì)胞誘導(dǎo)為體細(xì)胞胚[15-16]?！?1B’主要使用NOA進(jìn)行胚性細(xì)胞的維持，而我們使用2,4-D進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，2,4-D處理會(huì)使細(xì)胞（團(tuán)）形態(tài)發(fā)生變化，后續(xù)成胚能力受到嚴(yán)重抑制，這可能與2,4-D穩(wěn)定不易遷移難以去除有關(guān)，也可能與不同類型生長(zhǎng)素的作用機(jī)制差異有關(guān)。

在SEI過(guò)程中細(xì)胞褐化的抑制很重要。添加PVP和AC是細(xì)胞培養(yǎng)中防止褐化的重要手段[17]。但本研究發(fā)現(xiàn)，PVP對(duì)于‘41B’細(xì)胞褐化抑制效果并不明顯，而AC效果顯著。另外，AC也顯著提高了SEI的速度和一致性，暗示AC可能吸附了一些抑制SEI的物質(zhì)。在SEI過(guò)程中，眾多研究都有添加AC的習(xí)慣，反而導(dǎo)致AC對(duì)SEI的關(guān)鍵作用被忽略[13,18]。本研究再次強(qiáng)調(diào)了AC在SEI中的重要性，同時(shí)需要注意由于AC的非選擇性吸附，培養(yǎng)基中激素等添加物的有效濃度可能與無(wú)AC添加的培養(yǎng)基不同，其具體影響程度需要進(jìn)一步研究。

前人研究發(fā)現(xiàn)，添加細(xì)胞分裂素有利于細(xì)胞再生[19]，甲基化的去除可調(diào)控眾多再生相關(guān)的基因。研究顯示，采用組蛋白去乙?；福℉DAC）抑制劑NaB，對(duì)葡萄體細(xì)胞胚形成具有積極作用[20]。另外，水分的有效性對(duì)誘導(dǎo)體細(xì)胞胚很關(guān)鍵。體細(xì)胞胚的成熟與其儲(chǔ)備產(chǎn)物的積累和干燥度有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，透析膜的使用可以減少水分的可用性，顯著提高柑橘和葡萄等體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)率[21]；高濃度蔗糖和ABA的使用也可能調(diào)節(jié)水分的利用，從而促進(jìn)體細(xì)胞胚的形成，而且ABA被證明能減輕體細(xì)胞胚的畸形率[22]。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，不同類型細(xì)胞分裂素都對(duì)‘41B’細(xì)胞的再生沒(méi)有積極作用，還會(huì)促進(jìn)非胚性細(xì)胞的增殖。這提示，由基因型決定的具有高再生能力的葡萄類型或品種，無(wú)需細(xì)胞分裂素進(jìn)行體細(xì)胞胚誘導(dǎo)。這可能與內(nèi)源細(xì)胞分裂素濃度有關(guān)，但具體原因還有待證實(shí)。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度NaB可能促進(jìn)體細(xì)胞胚的形成，但高濃度NaB可使細(xì)胞白化死亡。這暗示對(duì)組蛋白去乙?；傅膹?qiáng)烈抑制，可能對(duì)細(xì)胞造成不可逆的損傷，在對(duì)其他種類或品種葡萄使用時(shí)應(yīng)注意其濃度。另外，‘41B’葡萄的SE萌發(fā)后幾乎都是畸形。這與前人研究結(jié)果不同[22]，ABA對(duì)降低‘41B’葡萄SE的畸形率沒(méi)有明顯作用。

在SEI過(guò)程中，高濃度ABA抑制體細(xì)胞胚的形成和萌發(fā)，但在AC存在情況下，低濃度ABA則可能促進(jìn)體細(xì)胞胚的萌發(fā)。AC對(duì)各類化合物可能具有非選擇性吸附，從而降低其有效利用率，這對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成不可預(yù)測(cè)的影響，需引起重視。

最后，本研究發(fā)現(xiàn)，水分的利用對(duì)體細(xì)胞胚的形成影響顯著，DM或高濃度的蔗糖都可能影響了水分的利用。但是，持續(xù)處于DM上的細(xì)胞容易過(guò)度失水，進(jìn)而影響體細(xì)胞胚的發(fā)育；而高濃度的蔗糖可提高體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)效率和其生長(zhǎng)的同步性。綜上，活性炭和蔗糖的利用有利于葡萄體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)，具有進(jìn)一步深入研究的價(jià)值。