廣西9個釀酒葡萄品種果實糖酸組分特征解析

謝林君，張勁，吳代東，李洪艷，曹慕明，周思泓，張瑛，龐麗婷，成果*

（廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所，廣西南寧 530007）

廣西地處亞洲東南部，屬亞熱帶氣候，山巒縱橫，具有典型的喀斯特巖溶山區(qū)地形地貌，是世界葡萄家族東亞種群葡萄屬最主要的起源地之一。廣西擁有世界上最大的毛葡萄種植基地，毛葡萄栽培與加工產(chǎn)業(yè)在當(dāng)?shù)剞r(nóng)民脫貧致富中發(fā)揮了重要作用。截止2020年，野生和人工栽培的毛葡萄面積超過7986 hm2，人工栽培品種以‘野釀2 號’（Vitis heyneanaRoem. & Schult，Yeniang No. 2）為主。腺枝葡萄（V. adenocladaHand.-Mazz）是一種中國特有的野生葡萄種類，廣泛分布于長江以南的湖南、福建和廣西等地，在分類上屬于東亞種群毛葡萄組[1-2]。本團(tuán)隊自2011年起在廣西河池市羅城縣水源野生葡萄基地開展腺枝葡萄選育工作，迄今為止已獲得‘桂黑珍珠4號’為代表的一系列腺枝葡萄優(yōu)系，命名為‘桂黑珍珠’系列[3]?！鹌?號’是源于廣西本地收集的野生資源，2015年由本研究所牽頭通過品種審定，目前圍繞該品種已形成一年兩收栽培、綠色食品生產(chǎn)、病蟲害防控及釀造工藝4套相關(guān)技術(shù)規(guī)程[4-7]。

葡萄糖酸的種類及含量不僅影響葡萄果實的口感與風(fēng)味，同時影響葡萄酒的酒體結(jié)構(gòu)與感官品質(zhì)[8]。不同葡萄品種糖酸種類及含量不同，其差異性決定了不同葡萄品種釀制的葡萄酒具有其獨特的品種風(fēng)格[9-10]。國內(nèi)外學(xué)者圍繞葡萄與葡萄酒糖酸組分開展了相關(guān)研究，Silva等[11]研究發(fā)現(xiàn)，蘋果酸、酒石酸和檸檬酸等有機(jī)酸是葡萄和葡萄酒的主要成分；Liu等[12]研究表明，葡萄漿果中糖酸含量和組成很大程度上取決于葡萄的基因型，且釀酒葡萄品種的特點是高糖和高酒石酸含量；張曉利等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在不同葡萄種群中，東亞種群葡萄的總酸含量最高，其次是北美種群，歐亞種群最低；江雨等[14]研究發(fā)現(xiàn)，中國野生葡萄屬于低糖高酸類型，且不同種野生葡萄有機(jī)酸的組成差異較大，而糖的組成基本一致。

目前，有關(guān)葡萄糖酸組分特征及含量變化規(guī)律的研究多集中于果實成熟期，圍繞廣西特色釀酒葡萄品種資源，系統(tǒng)分析果實發(fā)育過程中糖酸組分含量以及糖酸比例動態(tài)變化的研究鮮見報道。本研究以廣西地區(qū)栽植的9個釀酒葡萄為試材，采用高效液相色譜（HPLC）法測定葡萄果實各發(fā)育階段樣品中的糖和有機(jī)酸組成及含量，重點解析廣西特色釀酒葡萄資源糖酸組分特征及發(fā)育期變化規(guī)律。旨在完善廣西特色釀酒葡萄資源品質(zhì)評價體系，對進(jìn)一步開發(fā)和利用我國東亞種葡萄資源，優(yōu)化廣西地方特色加工型葡萄品種結(jié)構(gòu)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料采自廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所科研基地（22°50′59′′N，108°14′35′′E）。供試葡萄品種為：赤霞珠（V. vinifera，Cabernet Sauvignon，CS）、馬瑟蘭（V. vinifera，Marselan，Mar）、小味兒多（V. vinifera，Petit Verdot，PV）、北玫（V. vinifera×V. amurensis，Beimei，BM）、北紅（V.vinifera×V. amurensis，Beihong，BH）、桂葡6號（V.sp.cv，Guipu No. 6，GP6）、NW196（V. heyneanaRoem.& Schult×V. vinifera）、野釀2號（V. heyneanaRoem.& Schult，Yeniang No.2，YN2）、桂黑珍珠4號（V.adenocladaHand.-Mazz. Gui Heizhenzhu No. 4，GH4）共9個釀酒葡萄品種。株行距1.5 m×2.5 m，南北行向，滴灌，樹勢中等，管理水平良好。

在果實發(fā)育的5個階段，綠果期（E-L33）、漿果開始變軟（E-L34）、轉(zhuǎn)色初期（E-L35）、轉(zhuǎn)色結(jié)束（EL37）和采收期（E-L38）進(jìn)行采樣，發(fā)育期編號采用E-L系統(tǒng)[15]，具體采集時間見表1。選擇樹體生長狀況相對一致的9株葡萄樹作為采樣株，每3株為一個生物學(xué)重復(fù)。從每個生物學(xué)重復(fù)的試驗樹上隨機(jī)剪下50粒漿果（每個樣品即150粒），兼顧果穗的各個部位，采樣后立即用冰盒保存帶回實驗室。將樣品壓榨取汁，于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 2020年9個葡萄品種樣品采集信息表Table 1 Sampling information of nine grape varieties in 2020

1.2 試驗方法

1.2.1 試劑與儀器

乙腈（色譜純）：美國Fisher公司；果糖、葡萄糖、蔗糖、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)品及磷酸二氫鉀（KH2PO4）：Sigma 公司。所用標(biāo)準(zhǔn)品均為色譜純。

島津LC-20AD高效液相色譜儀：島津公司；湘儀TGL-16M高速冷凍離心機(jī)：長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2.2 糖酸測定

糖酸測定參考謝林君等[16]的方法并加以改進(jìn)。糖的測定采用檢測器RID-20A示差檢測器，Inertsil NH2氨基柱（4.6 mm×250 mm），柱溫25 ℃。流動相為80%乙腈水溶液，流速0.8 mL·min-1，進(jìn)樣量：20 μL。有機(jī)酸的測定采用檢測器SPD-20A紫外檢測器，檢測波長為210 nm。Inertsil ODS-3色譜柱（4.6 mm×250 mm），柱溫30 ℃。流動相為0.02 mol·L-1KH2PO4溶液，并調(diào)制pH值為2.5，流速為0.8 mL·min-1，進(jìn)樣量為20 μL。均采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003進(jìn)行統(tǒng)計分析，以Prism 8.0作圖。聚類分析和判別分析采用MetaboAnalyst 3.0進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同葡萄品種發(fā)育進(jìn)程

從表1可以看出，本研究中9個供試釀酒葡萄品種的物候期不同，最早熟的是山歐雜種（BM和BH）和野生資源（GP6），東亞種毛葡萄（YN2）和腺枝葡萄（GH4）最晚熟。BM、BH和GP6三個品種從綠果期到漿果開始變軟較其它6個品種更快，所有供試品種從轉(zhuǎn)色初期至轉(zhuǎn)色結(jié)束均需14 d，而YN2和GH4從轉(zhuǎn)色結(jié)束至采收所需時間較其它品種長。這說明不同種和品種葡萄果實的發(fā)育進(jìn)程存在差異?？傮w來說，廣西地區(qū)栽植的東亞種群葡萄果實發(fā)育周期更長，成熟進(jìn)程較其它品種更為緩慢。

2.2 各品種發(fā)育期總糖、總有機(jī)酸含量變化

9個釀酒葡萄品種總糖和總酸含量隨發(fā)育期變化情況如圖1所示。果糖、葡萄糖和蔗糖3種主要可溶性糖總量隨果實發(fā)育進(jìn)程的推移不斷積累（圖1A）。在綠果期（E-L33）和漿果開始變軟（E-L34）兩個階段，9個品種果實總糖含量較低，約4.98～18.10 mg·mL-1，品種間差異較小。進(jìn)入轉(zhuǎn)色期（E-L35）后，果實總糖含量急劇升高，各品種間差異逐漸變大，直至采收（E-L 38）。在整個轉(zhuǎn)色階段（E-L35至E-L37），CS總糖含量最高。進(jìn)入采收階段，8個品種總糖含量都達(dá)到峰值，CS總糖含量略有降低?？傮w來說，采收階段3個歐亞種葡萄的總糖含量高于其它品種，其中PV最高，達(dá)165.23 mg·mL-1；2個歐山雜種（BM和BH）及GP6總糖含量居中，分別為141.27、160.77、148.85 mg·mL-1；東亞種群的YN2和GH4含量最低，分別為110.81 mg·mL-1和84.39 mg·mL-1。

9個葡萄品種果實總有機(jī)酸的含量隨發(fā)育期推移呈波動下降的趨勢（圖1B）。從E-L33至E-L34時期，各品種果實總有機(jī)酸含量上升。從E-L34至E-L38，總有機(jī)酸含量不斷下降，但9個品種的下降速率存在差異，GP6及YN2下降速度最快。至采收期，各品種總有機(jī)酸含量降至最低值。不同品種間總有機(jī)酸含量差異較大，其中總有機(jī)酸含量最高的是PV和NW196，分別是13.64 mg·mL-1和12.71 mg·mL-1；含量最低的是BM，為5.40 mg·mL-1。

2.3 各品種發(fā)育期糖酸組分含量及糖酸比分析

為探明不同釀酒葡萄品種糖酸組分特征，對不同種類的糖（葡萄糖、果糖和蔗糖）和有機(jī)酸（酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸）含量和比例在品種間的差異情況進(jìn)行分析。如圖2A所示，9個釀酒葡萄品種各糖組分含量隨發(fā)育期均呈持續(xù)上升趨勢，特別是果糖和葡萄糖含量，積累速度較蔗糖更快。在采收期，各糖組分含量達(dá)最大值，歐亞種葡萄果糖和葡萄糖相對含量較高；東亞種群（YN2和GH4）葡萄糖和果糖含量顯著低于其他品種，但蔗糖含量在9個品種中較高（表2）。采收期時，葡萄果實中的糖分以葡萄糖和果糖為主。3個歐亞種品種中葡萄糖略高于果糖，與其它6個品種相反。東亞種群（YN2和GH4）果糖與葡萄糖含量差異最大（表2）。酒石酸含量在進(jìn)入轉(zhuǎn)色期后不斷下降；蘋果酸含量整體呈先上升后下降趨勢；檸檬酸含量在不同葡萄品種中變化不一致，且差異較大（圖2A）。東亞種群（YN2和GH4）檸檬酸含量最高，毛歐雜種NW196次之。琥珀酸在CS果實中含量高于其它品種，且在轉(zhuǎn)色結(jié)束時達(dá)到峰值。在采收期，不同品種果實中的酸組分仍以酒石酸和蘋果酸為主，檸檬酸次之，琥珀酸最低（表2）。采收期時，BH果實中酒石酸含量顯著高于其它品種，PV和NW196果實中的蘋果酸含量顯著高于其它品種。對于檸檬酸和琥珀酸則是在東亞種群（YN2和GH4）中最高。

表2 采收期不同釀酒葡萄品種糖酸組分含量比較Table 2 Comparison of sugar and acid components in different wine grape varieties at harvest time mg·mL-1

9個釀酒葡萄中各糖組分占總糖比例、各有機(jī)酸組分占總有機(jī)酸比例如圖2B所示。結(jié)果表明，在果實發(fā)育初期，果糖、葡萄糖占比較低，蔗糖占比較高，約達(dá)50%。進(jìn)入轉(zhuǎn)色期后，果糖、葡萄糖占比逐漸增加，蔗糖占比減少。采收期時，果糖和葡萄糖占比高達(dá)89.63%～95.48%，蔗糖僅為4.52%～10.37%（表3）。果糖、葡萄糖和蔗糖占比最高的品種分別是GP6、Mar和GH4。在葡萄綠果期，酒石酸占比最高，隨著果實發(fā)育進(jìn)程推移，蘋果酸和檸檬酸占比逐漸升高（圖2B）。在采收期，酒石酸和蘋果酸仍是果實中占比最高的兩種酸組分，但在品種間差異較大，比例分別為26.15%～69.05%和17.41%～58.48%（表3）。歐山雜種（BM和BH）及GP6果實中酒石酸比例高于其它品種，其中GP6最高，而NW196和PV中的蘋果酸較高。采收期時，檸檬酸和琥珀酸在總酸中的占比分別為7.29%～27.2%和1.37%～5.99%（表3）。東亞種群（YN2和GH4）和歐毛雜種NW196果實中檸檬酸比例高于其它品種，其中YN2最高。琥珀酸則在東亞種群（YN2和GH4）和BM占比較高，其中BM最高。

表3 采收期不同釀酒葡萄品種糖酸比例比較Table 3 Comparison of sugar and acid ratio in different wine grape varieties at harvest time%

2.4 不同發(fā)育期果實糖酸含量及比例的判別分析

為了更加直觀清晰地反映不同釀酒葡萄品種中糖酸組分含量及比例的差異，對其進(jìn)行判別分析。首先對9個品種發(fā)育期糖酸含量進(jìn)行判別分析（圖3），主成分1占比是57.4%，主成分2占比18.9%，累積達(dá)76.3%（圖3A）。各品種糖酸含量隨發(fā)育期變化的聚類趨勢明顯，X軸由負(fù)值到正值的過渡展現(xiàn)了果實由綠果期到轉(zhuǎn)色期再到采收期的變化過程。對發(fā)育期糖酸含量造成的差異貢獻(xiàn)進(jìn)行排序（圖3B）：果糖＞葡萄糖＞蔗糖＞酒石酸＞蘋果酸＞檸檬酸＞琥珀酸；其中果糖、葡萄糖、蔗糖隨果實發(fā)育含量不斷增加，酒石酸、蘋果酸含量隨果實發(fā)育不斷減少。

不同品種果實糖酸比例的判別分析如圖4所示。主成分1是39.6%，主成分2是21.3%，總判別成分達(dá)60.9%（圖4A）。對發(fā)育期糖酸比例貢獻(xiàn)進(jìn)行排名比較（圖4B），蔗糖＞果糖＞檸檬酸＞葡萄糖＞琥珀酸＞蘋果酸＞酒石酸；蔗糖、蘋果酸和酒石酸比例隨果實發(fā)育期推移不斷減少；果糖、檸檬酸、葡萄糖和琥珀酸比例隨果實發(fā)育不斷增加。

在不同品種釀酒葡萄發(fā)育期糖酸組分含量判別分析中，糖組分相較于有機(jī)酸組分的影響更大，表明在葡萄果實發(fā)育過程中，糖組分含量的變化幅度較大。與糖酸比例的判別分析相比，在葡萄果實發(fā)育過程中，糖酸比例變化幅度較小。在糖酸比例的判別分析中，排名前三的判別因子分別是蔗糖、果糖和檸檬酸比例，表明這3種組分在果實發(fā)育過程中變化幅度較大。

2.5 采收期糖酸組分含量及比例主成分分析

為了更加直觀地分析采收期不同釀酒葡萄品種糖酸組分含量及糖酸比例的差異，對樣品進(jìn)行主成分分析。圖5所示為利用9個品種采收期糖酸含量進(jìn)行的主成分分析。圖5A中，PC1 和 PC2的貢獻(xiàn)解釋了總變異的 71.8%，整體區(qū)分度較好。PC1將東亞種（YN2和GH4）、PV和NW196三個品種（第一和第二象限）與歐亞種（CS和Mar）、歐山雜種（BM和BH）及GP6（第三和第四象限）區(qū)分開來。PC2又進(jìn)一步區(qū)分了東亞種（YN2和GH4）與PV和NW196。東亞種與其它品種區(qū)分開來的重要標(biāo)志是其檸檬酸含量較高。而PV和NW196聚在一起與蘋果酸含量均較高密切相關(guān)。CS和Mar位于第四象限，以果糖和葡萄糖含量在兩個品種中較高為主要特征；歐山雜種（BM和BH）與GP6位于第三象限，這與酒石酸含量較高密切相關(guān)。

不同葡萄品種采收期糖酸比例主成分分析如圖5B所示，PC1和PC2的總貢獻(xiàn)率87.9%。與糖酸組分含量主成分分析相比，PC1更好的將東亞種兩個品種與其他品種區(qū)分開，前者以蔗糖和檸檬酸占比較高相關(guān)。歐山雜種（BM和BH）和GP6酒石酸占比高于其它品種，PC2能將其很好的區(qū)分，歐亞種的3個品種中PV與NW196的距離更近，這與它們中的蘋果酸比例均較高有關(guān)。

2.6 各葡萄品種發(fā)育期糖酸含量及比例相關(guān)性分析

為探明葡萄發(fā)育過程中各糖酸組分間的關(guān)系，對9個品種發(fā)育期各糖酸組分的含量和比例分別進(jìn)行相關(guān)性分析（圖6）。結(jié)果表明，果糖、葡萄糖、蔗糖、總糖四者之間兩兩呈顯著正相關(guān)，果糖、葡萄糖、總糖三者之間相關(guān)性更強(qiáng)，表明果糖與葡萄糖是葡萄果實中最主要的糖組分（圖6A）。酒石酸、蘋果酸含量與總有機(jī)酸含量呈顯著正相關(guān)，說明葡萄果實中總有機(jī)酸主要由酒石酸和蘋果酸組成。3種糖組分和總糖與酒石酸、蘋果酸和總有機(jī)酸呈顯著負(fù)相關(guān)。葡萄果實中糖酸比例相關(guān)性分析如圖6B所示，果糖和葡萄糖比例分別與蔗糖比例之間呈顯著負(fù)相關(guān)；酒石酸比例與蘋果酸比例呈顯著負(fù)相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

糖分的含量和構(gòu)成對葡萄果實的風(fēng)味、色澤及其他營養(yǎng)成分有著重要的影響，是葡萄果實中重要的營養(yǎng)物質(zhì)和酒精發(fā)酵的基質(zhì)，也是葡萄成熟與否的重要標(biāo)志之一[17]。在漿果生長初期，漿果內(nèi)糖分含量低，此時蔗糖的相對含量較高，占比約50%。至葡萄成熟初期，葡萄糖和果糖含量迅速增加并逐漸趨于一致，蔗糖占比降低[18]，這與本研究結(jié)果一致。江雨等[19]關(guān)于中國野生葡萄品質(zhì)的研究表明，毛葡萄和腺枝葡萄等中國野生葡萄的總糖、葡萄糖和果糖含量顯著低于‘赤霞珠’。本研究結(jié)果顯示，葡萄果實總糖含量在不同品種間表現(xiàn)出歐亞種＞歐山雜種＞東亞種的總體規(guī)律，其中歐亞種‘小味兒多’最高，‘桂黑珍珠4號’最低。Liu等[12]對98個葡萄品種的果實糖酸研究結(jié)果表明，歐美雜種果實中的總糖和果糖含量顯著高于歐亞種。馬艷莉等[20]對8種葡萄品種檢測出的糖類物質(zhì)主要是果糖和葡萄糖，未檢出蔗糖。本研究結(jié)果顯示，采收期果實中果糖和葡萄糖是最重要的糖組分，占比高達(dá)89.63%～95.48%，蔗糖僅為4.52%～10.37%，且采收期東亞種葡萄果實中果糖含量高于歐亞種和歐山雜種。

葡萄果實中有機(jī)酸主要包括酒石酸和蘋果酸，以及少量檸檬酸和琥珀酸，它們的含量與組分是葡萄果實風(fēng)味和品質(zhì)形成的重要基礎(chǔ)物質(zhì)[21-22]。在漿果生長初期，漿果內(nèi)總有機(jī)酸含量較高，其中酒石酸占比最高。隨著果實發(fā)育，總有機(jī)酸含量不斷下降，酒石酸占比升高，蘋果酸占比減少[18]。本研究中9個釀酒葡萄品種主要有機(jī)酸組分是酒石酸和蘋果酸，其次是檸檬酸，琥珀酸含量最低，這與張曉利等[13]研究結(jié)果一致。本研究中‘小味兒多’不僅總糖含量在所有品種中最高，總酸含量也顯著高于其它8個品種，符合前人關(guān)于歐亞種釀酒葡萄品種具備高糖高酸的特征[12]。本研究中東亞種群葡萄果實總有機(jī)酸含量中等，這與李記明等[23]研究結(jié)果一致。東亞種毛葡萄和腺枝葡萄中檸檬酸相對含量及其占比較高，較高含量的檸檬酸具有清爽宜人的味道，能給人一種持續(xù)的味覺刺激[24]。因此，廣西毛葡萄漿果釀造的山野葡萄酒，具有獨特的酒質(zhì)、風(fēng)味和風(fēng)格[25]。

果實成熟過程中糖類物質(zhì)充分積累，而有機(jī)酸合成受到抑制，并不斷降解和轉(zhuǎn)化，同時果實體積增加對其帶來稀釋作用[26]。這是9個釀酒葡萄品種果實總糖含量隨發(fā)育期推移不斷升高，而酸含量逐漸降低的原因。李佳秀等[27]對17個鮮食葡萄品種開展的可溶性糖和有機(jī)酸差異分析發(fā)現(xiàn)，不同品種葡萄汁糖酸含量差異較大，但其基本組成特征較為一致。本研究對9個釀酒葡萄糖酸組分含量判別分析發(fā)現(xiàn)，葡萄發(fā)育期造成的差異大于品種，且含量的差異性較糖酸比例的影響更顯著?？梢婋m然同一產(chǎn)地不同品種的糖酸積累規(guī)律存在差異[28]，但果實從未成熟走向成熟帶來一系列成分變化更加顯著。糖酸含量排名前三的判別因子依次是果糖、葡萄糖、蔗糖；糖酸比例排名前三的判別因子依次是蔗糖、果糖、檸檬酸。由此可見，糖組分對多品種判別的影響力大于有機(jī)酸。

采收期糖酸含量及比例的主成分分析中，東亞種群的毛葡萄和腺枝葡萄能顯著區(qū)別于其它品種。這與東亞種葡萄檸檬酸含量和比例，以及蔗糖比例高于其它品種密切相關(guān)。檸檬酸雖然在葡萄中含量不高，口感的強(qiáng)勁度和尖銳度弱于酒石酸，但其對果實風(fēng)味特征具有重要貢獻(xiàn)[29-30]。有報道指出，酒石酸與蘋果酸比例差異是種質(zhì)特異性的表現(xiàn)，主要由遺傳背景決定[13]。本研究中歐山雜種及野生資源‘桂葡6號’酒石酸含量及比例高于其它品種，而歐亞種‘小味兒多’和毛歐雜種‘NW196’蘋果酸含量及比例較高。前人研究表明，酒石酸在葡萄果實成熟過程中較蘋果酸具有更好的代謝穩(wěn)定性[31]。對9個釀酒葡萄品種不同發(fā)育期糖酸組分相關(guān)性研究表明，酒石酸和蘋果酸比例呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。由此可見，不同品種糖酸組分特征明顯，可以作為區(qū)分種/種群的重要指標(biāo)。

綜上所述，廣西不同釀酒葡萄果實的糖酸組分差異顯著。低糖高酸是廣西特色品種中東亞種資源的重要特點，較高的檸檬酸含量和比例可以作為區(qū)分毛葡萄和腺枝葡萄與其它品種的重要特征。另外，不同品種生長周期和成熟進(jìn)程也存在差異。因此，闡明不同品種糖酸組分特征對生產(chǎn)中漿果成熟度的準(zhǔn)確判斷，進(jìn)而有針對性提高釀酒原料品質(zhì)具有重要意義。