快速現(xiàn)場評價在肺癌患者舌診中的應用

郁東偉 馮月娟 施 凱 劉英君 李 力 王 劍

肺癌目前是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，除靶向治療、化療、免疫治療等現(xiàn)代醫(yī)學治療手段外，中醫(yī)依據(jù)辨證論治在肺癌診治中發(fā)揮其獨有的特色。其中舌診是辨證論治的重要手段?？焖佻F(xiàn)場評價（rapid on-site evaluation，ROSE）是利用快速染色技術，對穿刺的標本在現(xiàn)場進行制片、染色，進而在顯微鏡下對細胞學或微生物學進行判讀，評價是否取到了所需要的標本、標本是否充足、質量是否滿足診斷要求[1]。其目的是保證穿刺診斷的準確率，減少不必要的穿刺操作，從而節(jié)省時間，減少患者的痛苦和風險[2]。本研究擬將ROSE 結合到中醫(yī)舌診中，對肺癌患者的舌苔脫落細胞形態(tài)學及微生態(tài)進行分析，為肺癌舌診提供客觀理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2020 年9 月至2021 年6 月杭州師范大學附屬醫(yī)院收治的58 例肺癌患者，根據(jù)分期不同，分為Ⅰ～Ⅱ期肺癌組26 例、Ⅲ～Ⅳ期肺癌組32 例。對照組28 例為杭州師范大學附屬醫(yī)院健康體檢人員或健康職工，中醫(yī)辨證無明顯的寒熱虛實證候。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 納入標準（1）所有患者經病理學診斷為肺癌，依據(jù)美國聯(lián)合癌癥分類委員會（AJCC）和國際抗癌聯(lián)盟（UICC）2018 年制定的TNM 分期[3]，由兩名主治醫(yī)師以上職稱的呼吸內科中醫(yī)師共同辨證；患者舌象的辨別參照《中醫(yī)診斷學》[4]；舌苔脫落細胞分類標準參照《中醫(yī)診斷實驗方法學》[5]。（2）年齡18～75 歲；（3）簽署知情同意書。

1.3 排除標準（1）嚴重凝血功能障礙；（2）出血傾向；（3）有口腔疾病者。

1.4 檢查方法 均在晨起時采集標本，采集標本前不進食及飲水。采集前清水漱口1 次。一次性棉簽用生理鹽水沾濕后，在被檢者舌面中后1/3 處刮涂5次，然后在玻片涂抹直徑約1 cm 的圓形，厚薄適中，所有標本一式兩份。

1.5 標本處理 迪夫快速染色法[6-7]：將所制的玻片先于迪夫A 液中浸泡約20 s；再于磷酸鹽緩沖液中輕輕洗滌5 s，甩干緩沖液；再把玻片完全浸于迪夫B液15 s；最后清水染缸中水洗5 s，擦干玻片底部后于普通顯微鏡下觀察。

1.6 評價標準 由2 名經驗豐富的細胞學或檢驗學醫(yī)師觀察細胞或細菌成分及形態(tài)，進行綜合分析。鏡下觀察并記錄各層舌苔脫落細胞的百分比，分別計算各層細胞數(shù)、成熟指數(shù)（maturity index，MI）、成熟價值（maturity value，MV）。MI：即底層/中層/表層的細胞數(shù)分別與觀察中的100 個細胞比值，體現(xiàn)了舌苔各層細胞組成及成熟情況；MV=底層細胞數(shù)×0+中層細胞數(shù)×0.5+表層細胞數(shù)×1，體現(xiàn)了舌苔脫落細胞成熟的趨勢[8]。

1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 23.0 版軟件分析。符合正態(tài)分布的連續(xù)變量采用參數(shù)檢驗，并以均數(shù)±標準差（）表示；不符合正態(tài)分布的連續(xù)變量采用非參數(shù)檢驗，并以中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示。對于分類變量，計算每個類別中患者的百分比，以例（%）表示。組間比較通過卡方檢驗、Fisher's 檢驗或非參數(shù)檢驗。診斷符合率采用Kappa檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組一般資料比較 三組性別、年齡分布比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。Ⅰ～Ⅱ期肺癌組與Ⅲ～Ⅳ期肺癌組病理結果比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 健康人群與肺癌人群基本資料比較

2.2 不同分期肺癌患者和對照組舌象比較 對照組和Ⅰ～Ⅱ期肺癌組患者舌質以淡紅舌、紅舌多見，舌苔以淡薄苔多見，Ⅲ～Ⅳ期肺癌組舌質以趨向紅舌、絳舌多見，舌苔以趨向腐膩苔、白厚苔、光剝苔多見，統(tǒng)計結果表明Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者更容易出現(xiàn)紅舌、厚膩苔，見表2-3。

表2 不同分期肺癌患者和對照組舌質比較[例（%）]

表3 不同分期肺癌患者和對照組舌苔比較[例（%）]

2.3 不同分期肺癌患者和對照組舌苔菌落比較 使用Fisher 精確概率法計算P 值，結果表明Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者容易出現(xiàn)桿菌及真菌菌落（P＜0.05），球菌為所有病例均可見，考慮為正?？谇欢ㄖ簿姳?。

表4 不同分期肺癌患者和對照組菌落比較（例）

2.4 肺癌患者和對照組舌苔及鏡下表現(xiàn) 對照組舌質以淡紅舌、紅舌常見，舌苔淡薄，鏡下背景潔凈，細胞數(shù)量豐富，成熟度高，可見少量散在球菌；而肺癌組患者舌質以紅舌、絳舌多見，舌苔常厚膩或光剝，鏡下背景較臟或者污穢，細胞數(shù)量豐富或較少，較極端，成熟度偏低，可見大量成團球菌、桿菌，部分患者可見真菌，見圖1-4。

圖1 健康人群舌象（迪夫染色，×200）

圖2 肺癌患者舌象（迪夫染色，×200）

圖3 肺癌患者舌象（迪夫染色，×200）

2.5 不同分期肺癌患者和對照組舌苔脫落細胞MI、MV 比較 使用單因素方差分析計算不同組間脫落細胞的MV，結果表明，肺癌分期越晚，表層脫落細胞越多，中層脫落細胞越少，MV 越低，組間對比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表5。

表5 不同分期肺癌患者和對照組舌苔脫落細胞MI、MV比較（）

表5 不同分期肺癌患者和對照組舌苔脫落細胞MI、MV比較（）

注：MI 為成熟指數(shù)；MV 為成熟價值；“-”表示無法計算

3 討論

圖4 肺癌患者舌象（迪夫染色，×200）

舌診是中醫(yī)學四診中望診的重要組成部分。舌乃脾之外候，苔乃胃氣之熏蒸，舌苔的厚、薄、黃、白等特征能反映疾病的不同發(fā)展，舌苔的厚薄變化、干燥濕潤反映了機體正邪的消長、津液的盈虧和輸布、臟腑運機變化[9]。研究表明，舌苔是由脫落的角化上皮細胞、唾液、細菌、食物碎屑及滲出的白細胞等多種成分組成[10]。舌上皮細胞的分化、成熟、脫落過程與舌苔的厚薄密切相關，如人體代謝正常，舌上皮細胞成熟、脫落順利，舌苔表現(xiàn)為淡薄適中；如人體代謝障礙，舌上皮細胞脫落困難，則形成厚膩苔[8]。此外，舌苔菌群的種類、數(shù)量變化可能與疾病的發(fā)展密切相關。周俊琴和魯琴[3]對140 例不同證型中晚期原發(fā)性支氣管肺癌患者舌苔脫落細胞形態(tài)進行分析，不同TNM 分期的肺癌患者中醫(yī)證型分布有差別，舌苔脫落細胞的改變與肺癌所表現(xiàn)的中醫(yī)證型有關。肖飛等[11]對肺癌患者的舌苔菌群進行研究檢測，結果發(fā)現(xiàn)相同舌苔類型的不同樣本之間有較高的相似性，舌苔質地及顏色相同者其菌群構成相似，提示舌苔類型與菌群結構相關。

然而上述研究存在一定不足，例如使用常規(guī)病理染色方法耗時較長，需等待24 h，不能及時將信息反饋給中醫(yī)師和患者；病理結果需專業(yè)病理科醫(yī)師判讀，但不能同時對微生物進行判讀，需檢驗科醫(yī)師協(xié)助；常規(guī)病理染色通常不能對微生物進行固定染色，玻片上沒有微生物存在，忽視了微生物的重要性。國內舌苔菌群的研究手段通常使用基因測序技術，價格昂貴，另外由于是基因測序，靈敏度高，微量污染后混入的基因可能造成結果失真。此外，基因測序失去了第一手資料的掌握，不能現(xiàn)場對菌落的形態(tài)、數(shù)量進行統(tǒng)計。

ROSE 是一種快速染色技術，目前在呼吸內科介入操作中應用較多，結合不同染料，可對細胞及微生物（包括細菌、真菌、結核）進行快速染色，從而實現(xiàn)現(xiàn)場快速判讀，耗時1～2 min。研究表明，肺科醫(yī)師經過3 個月的細胞病理學知識培訓后，ROSE 判讀的準確率可達80%，與病理科醫(yī)師相比（準確率92%）無統(tǒng)計學差異[12-13]。而舌苔脫落細胞、菌群相較肺部而言種類單一，經過一定時間培訓應能較快掌握對舌苔脫落細胞和菌群的識別。課題組前期已開展肺部ROSE 研究，積累了豐富的ROSE 經驗，嘗試將ROSE 應用于中醫(yī)舌診，期望將其用于現(xiàn)場判讀，床旁協(xié)助中醫(yī)師診斷。我們的研究結果顯示，90 個病例的標本經迪夫染色法固定、染色均可獲得滿意圖像結果，細胞和細菌均可很好地保存在玻片上，表明這一方法應用于中醫(yī)舌診是可行的。進一步深入研究發(fā)現(xiàn)，健康體檢者和Ⅰ～Ⅱ期肺癌患者舌質以紅舌、淡紅舌、淡薄苔為主，Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者以紅舌或絳舌常見，以淡薄苔、白厚苔甚至膩腐苔為主，部分為光剝苔。鏡下結果顯示，健康體檢者和Ⅰ～Ⅱ期肺癌患者細胞成熟度較高，細胞數(shù)量豐富，背景干凈，細菌分散，數(shù)量偏少。Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者細胞數(shù)量較多或極少，細胞成熟度較低，背景污穢，細菌極多、成團，部分患者可見真菌菌絲及真菌孢子。這或可解釋為肺癌患者機體津液虧虛，生氣不足，氣機不暢，故舌苔厚膩或光剝，脫落細胞難以成熟脫落，邪氣滋生，故菌群紊亂，甚至出現(xiàn)真菌情況，提示機體免疫力低下。這些結果凸顯了機體正邪消長、津液盈虧和輸布、臟腑運機與舌苔密切相關，體現(xiàn)了中醫(yī)理論的正確性。本研究也存在一些不足，如研究病例少，單一迪夫染色不能區(qū)別菌群種類，我們將在今后結合更多染色技術，進一步探索舌苔菌群與肺癌的相關性，彌補單一迪夫染色的不足。

綜上所述，Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者的舌苔脫落細胞、舌苔菌群與健康者、Ⅰ～Ⅱ期肺癌患者不同，具有特征性。ROSE 操作簡單、快速，可用于中醫(yī)舌診，為今后中醫(yī)診斷標準化、精準化提供理論依據(jù)。