強(qiáng)骨合劑通過Wnt3a/β-catenin/VEGF信號通路促進(jìn)血管生成改善圍絕經(jīng)期大鼠骨質(zhì)疏松的研究

王雨辰,芮立寧,賈川,俞偉忠

(南京中醫(yī)藥大學(xué)武進(jìn)附屬醫(yī)院,江蘇 常州 213161)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(Postmenopausal osteoporosis,PMOP)是圍絕經(jīng)期婦女常見的一種與年齡相關(guān)的代謝性骨病,表現(xiàn)為絕經(jīng)后骨密度極度降低,在我國50歲以上人群的患病率為20.7%[1-2]。PMOP患者會出現(xiàn)腰腿酸痛、四肢無力、駝背、易骨折等癥狀。近年來,PMOP的發(fā)病率逐年上升,具有高發(fā)病率、高致殘率、高病死率等特點(diǎn),嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)療法和臨床藥物治療PMOP均有效。然而,激素替代療法(HRT)、非激素藥物療法等針對PMOP的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)療法存在諸多缺陷,如副作用多、費(fèi)用高、癌癥風(fēng)險(xiǎn)、藥物依賴等[4]。雙膦酸鹽類、降鈣素類等藥物也存在腎損害風(fēng)險(xiǎn)、依從性低、不良反應(yīng)多等不足。臨床上仍缺乏安全、有效、成本低且可耐受的PMOP治療方法。因此,探究PMOP發(fā)病機(jī)制、尋求有效的治療措施已成為醫(yī)療關(guān)注的重點(diǎn)之一。

盡管對PMOP的研究備受關(guān)注,但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。研究表明,PMOP發(fā)病主要與絕經(jīng)后女性卵巢功能、雌激素水平下降有關(guān)。卵巢功能與雌激素水平的下降會導(dǎo)致下丘腦-垂體-卵巢軸功能障礙,進(jìn)而影響骨代謝。骨代謝過程涉及信號傳導(dǎo)、基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、激素等調(diào)控。其中Wnt/β-catenin信號通路在骨代謝以及成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成中發(fā)揮重要作用[5]。此外,充足的血液是骨再生的關(guān)鍵,因此血管生成對于骨發(fā)育和生長等生理過程極為重要。利用沖擊波刺激成骨細(xì)胞促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá),可以刺激血管生成,進(jìn)而促進(jìn)骨再生[6]。最新研究表明,Wnt/β-catenin通路可通過調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞中VEGF表達(dá),促進(jìn)其成血管分化及血管新生能力[7]。

中醫(yī)藥可辨證論治PMOP，具有療效佳、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)逐漸被廣大患者所認(rèn)可。PMOP屬中醫(yī)“骨痿”范疇。中醫(yī)認(rèn)為腎虛血瘀是PMOP的主要病機(jī),治療應(yīng)以補(bǔ)腎為主,兼以活血化瘀、通絡(luò)止痛。強(qiáng)骨合劑是臨床經(jīng)驗(yàn)方,以補(bǔ)腎活血中藥為主,主要含龜甲、補(bǔ)骨脂、骨碎補(bǔ)、枸杞子、肉蓯蓉、川牛膝、淫羊霍、杜仲、黃芪、山藥、熟地、當(dāng)歸、丹參、煅龍骨、煅牡蠣、炙甘草等,可有效緩解骨質(zhì)疏松癥患者癥狀,但其在PMOP防治中的作用及其機(jī)制尚未見報(bào)道。本研究擬通過去卵巢法建立PMOP大鼠模型,灌胃給予強(qiáng)骨合劑進(jìn)行干預(yù),通過觀察其子宮指數(shù)、骨密度、骨力學(xué)性能指標(biāo)、股骨病理形態(tài)改變及股骨組織中VEGF、CD31以及Wnt3a/β-catenin信號通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)變化,探究強(qiáng)骨合劑對PMOP的治療作用機(jī)制,以期為PMOP臨床治療提供理論依據(jù)和有益參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

SPF級3月齡雌性SD大鼠50只(230～270 g),購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2019-0010。動物分籠飼養(yǎng),自由進(jìn)食、飲水,室溫為20～25 ℃,每日光照12 h。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、雌二醇組(100 μg·kg-1)、強(qiáng)骨合劑低劑量組(6 g·kg-1)、強(qiáng)骨合劑高劑量組(12 g·kg-1),每組10只大鼠。

1.2 藥材提取

取龜甲15 g,枸杞子15 g,骨碎補(bǔ)15 g,補(bǔ)骨脂15 g,肉蓯蓉15 g,川牛膝12 g,淫羊霍15 g,杜仲15 g,黃芪12 g,山藥12 g,熟地12 g,當(dāng)歸12 g,丹參12 g,煅龍骨20 g,煅牡蠣20 g,炙甘草6 g,加入10倍量的水煎煮1 h,煎煮2次,紗布濾過,水提液濃縮至生藥量1 g·mL-1。

1.3 色譜條件

取強(qiáng)骨合劑提取液5 mL,用2倍水稀釋,加入10 mL乙酸乙酯萃取,取上清用蒸發(fā)皿揮發(fā)后加入2 mL甲醇復(fù)溶用于指紋圖譜分析。

HPLC分析采用Waters 2695 Alliance HPLC系統(tǒng),配備2998 DAD檢測器和Empower軟件數(shù)據(jù)處理軟件。所有分析均采用Waters C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),進(jìn)樣量為10 μL,柱溫30 ℃,DAD檢測波長為300 nm。流動相由A(乙腈)和B(0.5%乙酸水溶液,v/v)組成,梯度洗脫條件如下:0～30 min,5%～24%A,30～31 min,24%～35%A,31～43 min,35%～50%A,43～45 min,50%～100%A,流動相流速1.0 mL·min-1。采用專業(yè)軟件《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2004年A版),提取10批次被測樣品的HPLC-DAD色譜數(shù)據(jù)并分析,評價相似度。

1.4 PMOP大鼠模型的建立

采用雙側(cè)卵巢切除法制備大鼠PMOP模型[8-9]。大鼠經(jīng)氯胺酮肌肉注射麻醉后固定,皮膚消毒,從腰背部脊柱兩側(cè)切開皮膚及肌肉,切口長度約1 cm,打開腹腔,找到卵巢。假手術(shù)組大鼠僅切除雙側(cè)卵巢皮下脂肪,實(shí)驗(yàn)各組行雙側(cè)卵巢切除術(shù), 縫合并消毒。術(shù)后肌肉注射青霉素(80萬 U，4 mL 生理鹽水,1.6 mL·kg-1),連續(xù)注射3 d。術(shù)后7 d開始給藥,假手術(shù)組和模型組以等量的生理鹽水灌胃,實(shí)驗(yàn)組分別灌胃給予雌二醇(100 μg·kg-1)、低劑量強(qiáng)骨合劑(6 g·kg-1)和高劑量強(qiáng)骨合劑(12 g·kg-1),連續(xù)給藥30 d。各組于最后1次給藥24 h后取血,處死大鼠取骨組織和子宮組織。實(shí)驗(yàn)期間,每周記錄各組大鼠體質(zhì)量,并根據(jù)變化相應(yīng)調(diào)整給藥量。

1.5 子宮指數(shù)的測定

取材時用電子天平測定各組大鼠子宮濕質(zhì)量,計(jì)算子宮指數(shù)。子宮指數(shù)=子宮質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.6 大鼠骨密度測定

處死大鼠后取出完整股骨。各組大鼠離體股骨骨密度采用雙能X線骨密度分析儀(美國Lunar公司)測定。骨密度值以單位面積骨礦物質(zhì)含量表示(g·cm-2)。

1.7 骨生物力學(xué)檢測

采用MTS Acumen3型生物力學(xué)測試系統(tǒng)檢測各組大鼠離體股骨生物力學(xué)性能,繪制載荷-變形曲線,計(jì)算出最大載荷、彈性模量、屈服載荷。

1.8 股骨組織病理形態(tài)檢測

各組大鼠左股骨組織用多聚甲醛固定,經(jīng)10%EDTA溶液脫鈣、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后,行股骨石蠟切片和HE染色。光鏡下觀察各組大鼠股骨組織病理形態(tài)。

1.9 大鼠骨組織VEGFR-2、CD31蛋白表達(dá)檢測

免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測股骨組織內(nèi)皮細(xì)胞的分子標(biāo)記CD31以及血管內(nèi)皮生長因子受體VEGFR-2表達(dá)情況。骨組織用4%多聚甲醛固定,經(jīng)通透化處理、封閉、1% BSA稀釋的CD31和VEGFR-2抗體孵育過夜、二抗避光孵育30 min、DAPI染核、封片劑封片后熒光顯微鏡觀察。采用ImageJ進(jìn)行熒光共定位分析,并對CD31+VEGFR-2+細(xì)胞熒光強(qiáng)度進(jìn)行量化和統(tǒng)計(jì)。

1.10 qPCR檢測

采用TRIzol試劑盒提取各組股骨組織總RNA,使用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)行qPCR擴(kuò)增,GAPDH作為內(nèi)參。引物序列:Wnt3a F為5'-CGGGTTCTTCTCTGGTCCTTG-3',R為5'-CTGACAGTGGTGCAGTTCCA-3';β-catenin F為5'-ATCATTCTGGCCAGTGGTGG-3',R為5'-GACAGCACCTTCAGCACTCT-3';VEGF F為5'-CAGAAGGGGAGCAGAAAGCC-3',R為5'-CTTCATCATTGCAGCAGCCC-3';OPG F為5'-CACAACCGAGTGTGCGAATG-3',R為5'-AAGTGAGCTGCAGTTGGTGT-3';GAPDH F為5'-TGGTGCTGAGTATGTCGTGG-3',R為5'-GGTTCACACCCATCACAAAC-3'。反應(yīng)條件:95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,共39個循環(huán)。2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

1.11 Western blot檢測

用RIPA裂解液提取股骨組織總蛋白。蛋白經(jīng)BCA法定量后,取20 μg上樣,10% SDS-PAGE分離蛋白,半干法電轉(zhuǎn)膜,然后用5%脫脂奶粉封閉。分別加入抗體VEGF(1∶1 000,Abcam)、Wnt3a(1∶1 000,Abcam)、GSK3β(1∶800,Abcam)、p-GSK3β(1∶800,Abcam)、β-catenin(1∶5 000,Abcam)、Lamin(1∶800,Abcam)、β-actin(1∶5 000,Abcam)孵育過夜。PBST洗滌后,加入二抗室溫下孵育2 h。PBST洗滌后,加入化學(xué)發(fā)光試劑,化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影成像,Image J軟件對各檢測蛋白的條帶灰度值進(jìn)行分析,計(jì)算相對表達(dá)量。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 強(qiáng)骨合劑HPLC指紋圖譜分析

使用10批次樣本建立強(qiáng)骨合劑指紋圖譜,采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》軟件進(jìn)行峰匹配,得到對照譜圖。所有10個樣品中出現(xiàn)的峰被定義為“共有峰”,共有10個共有峰。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品定性,指認(rèn)9號峰為丹酚酸B(圖1)。10批次提取的復(fù)方指紋圖譜分析結(jié)果相似度均大于0.9,表明10批樣品質(zhì)量穩(wěn)定、相似。

圖1 10批強(qiáng)骨合劑樣品(S1～S10)的HPLC指紋圖譜(A)及其共有模式(B)

2.2 強(qiáng)骨合劑對PMOP大鼠體質(zhì)量和子宮指數(shù)的影響

由圖2A～B可知,與假手術(shù)組相比,大鼠行卵巢切除術(shù)后,體質(zhì)量顯著增加,子宮指數(shù)明顯下降(P<0.01)。給予雌二醇和強(qiáng)骨合劑干預(yù)后,與模型組比較,各用藥組大鼠體質(zhì)量均顯著下降(P<0.01),子宮指數(shù)顯著增加(P<0.05,P<0.01)。

注：與假手術(shù)組比較，##P<0.01;與模型組比較，

2.3 強(qiáng)骨合劑對PMOP大鼠離體股骨頭骨密度和生物力學(xué)指標(biāo)的影響

各組大鼠股骨頭骨密度檢測結(jié)果(圖2C)表明,與正常組相比,模型組大鼠骨密度顯著降低(P<0.01)。與模型組比較,雌二醇和強(qiáng)骨合劑組骨密度均升高(P<0.01)。此外,本研究對PMOP大鼠股骨的生物力學(xué)性能進(jìn)行了觀察。與假手術(shù)組相比,模型組大鼠彈性模量、最大載荷、屈服載荷均明顯下降(P<0.01),與模型組相比,雌二醇組和強(qiáng)骨合劑組大鼠彈性模量、最大載荷、屈服載荷升高(P<0.01)。該結(jié)果說明去除卵巢可明顯降低大鼠股骨的生物力學(xué)性能,強(qiáng)骨合劑干預(yù)可有效提高股骨的力學(xué)強(qiáng)度,改善股骨的生物力學(xué)性能(圖2D～F)。

2.4 強(qiáng)骨合劑對PMOP大鼠股骨組織病理形態(tài)的影響

由圖3所示,假手術(shù)組大鼠骨小梁基本結(jié)構(gòu)正常,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)清晰、排列有序;模型組大鼠骨小梁斷裂、不完整、間距擴(kuò)大,骨小梁數(shù)量明顯減少。與模型組比較,強(qiáng)骨合劑低、高劑量組骨小梁結(jié)構(gòu)完整、排列較規(guī)則有序,接近正常。該結(jié)果表明強(qiáng)骨合劑可明顯改善摘除卵巢所致的股骨組織病理變化。

圖3 各組大鼠股骨組織病理形態(tài)(HE,×20)

2.5 強(qiáng)骨合劑對血管生成相關(guān)蛋白VEGFR-2和CD31表達(dá)的影響

VEGF作用于內(nèi)皮細(xì)胞,具有促進(jìn)新生血管生長的作用。本研究通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)研究了VEGFR-2和內(nèi)皮標(biāo)記蛋白CD31的共定位變化。結(jié)果顯示,PMOP模型大鼠CD31和VEGFR-2蛋白熒光強(qiáng)度較假手術(shù)組均明顯減弱(P<0.01),而強(qiáng)骨合劑則可顯著促進(jìn)股骨組織CD31和VEGFR-2蛋白表達(dá)(P<0.01)(圖4)。

注：與假手術(shù)組比較，##P<0.01;與模型組比較，

2.6 強(qiáng)骨合劑對骨組織Wnt3a、β-catenin、VEGF、OPG mRNA水平的影響

qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與假手術(shù)組相比,模型組大鼠股骨組織中的Wnt3a、β-catenin、VEGF、OPG的mRNA水平明顯降低(P<0.01);與模型組比較,雌二醇和強(qiáng)骨合劑高劑量組Wnt3a、β-catenin、VEGF、OPG的mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01),提示強(qiáng)骨合劑激活骨細(xì)胞Wnt3a/β-catenin信號通路,促進(jìn)VEGF表達(dá)和血管生成(圖5)。

注：與假手術(shù)組比較，##P<0.01;與模型組比較，

2.7 強(qiáng)骨合劑對骨組織VEGF、Wnt3a、p-GSK3β、GSK3β、β-catenin蛋白表達(dá)水平的影響

為明確強(qiáng)骨合劑對血管生成以及股骨組織中Wnt3a/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白VEGF、Wnt3a、p-GSK3β、GSK3β、β-catenin表達(dá)的影響,我們采用Western blot法對各組相關(guān)蛋白水平進(jìn)行檢測。如圖6所示,模型對照組大鼠股骨組織中VEGF、Wnt3a、p-GSK3β/GSK3β、β-catenin/Lamin蛋白表達(dá)含量較假手術(shù)組均顯著降低(P<0.01);雌二醇組、強(qiáng)骨合劑高、低劑量組股骨組織中VEGF、Wnt3a、p-GSK3β/GSK3β、β-catenin/Lamin蛋白表達(dá)含量均較模型組顯著升高(P<0.05,P<0.01),強(qiáng)骨合劑高劑量組與陽性藥雌二醇組蛋白表達(dá)量升高最為顯著。

注：與假手術(shù)組比較，##P<0.01;與模型組比較，

3 討論

PMOP是以骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征的致使骨的脆性增加,以及易于發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病,多見于絕經(jīng)后的婦女[10]。隨著社會老齡化,PMOP的發(fā)病率逐年上升,已成為全球關(guān)注的重要健康問題[11]。雌激素水平下降,引發(fā)了破骨細(xì)胞的激活與分化,從而進(jìn)一步引起骨吸收亢進(jìn)[8]。骨吸收亢進(jìn)目前被認(rèn)為是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥骨量丟失的最重要病因[9]。由于雌激素匱乏在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中的核心作用,雌激素和雙膦酸鹽等抗骨吸收藥物作為首選治療藥物,臨床療效已被證實(shí)[12-13]。但多種副作用限制這些藥物的推廣應(yīng)用[14-15]。雌激素作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥防治一線藥物,長期服用可增加雌激素依賴性腫瘤和心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)[16];雙膦酸鹽是迄今為止最有效骨吸收抑制劑之一,但大樣本臨床研究發(fā)現(xiàn),此類藥物長期使用導(dǎo)致成骨不全、不典型骨折[17]。由于缺乏安全有效的治療方法,探索PMOP的機(jī)制和尋找新的治療策略尤為重要。

PMOP屬中醫(yī)“骨痿”范疇。《醫(yī)經(jīng)精義》中論述“腎藏精,精生髓,髓生骨”,表明腎與骨密切相關(guān)。腎氣充足,則骨質(zhì)緊密;腎氣不足,則髓枯骨痿,即骨質(zhì)疏松。同時,絕經(jīng)后婦女氣血虛少,血液瘀滯,臟腑濡養(yǎng)不足,骨骼失養(yǎng),發(fā)為“骨痿”。因此,中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“腎虛”是PMOP的根本病機(jī),血瘀是發(fā)病的關(guān)鍵機(jī)制,因而確立了以補(bǔ)腎活血化瘀為PMOP的根本治療法則。強(qiáng)骨合劑是南京中醫(yī)藥大學(xué)武進(jìn)附屬醫(yī)院骨傷科名中醫(yī)李云峰教授根據(jù)家傳驗(yàn)方進(jìn)行改進(jìn)的復(fù)方制劑,具有10余年臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn),患者反應(yīng)療效顯著。此方是基于“本痿標(biāo)痹”的病機(jī)本質(zhì)深入認(rèn)識擬定的臨床驗(yàn)方,主要由川杜仲、骨碎補(bǔ)、補(bǔ)骨脂、淫羊霍、肉蓯蓉、龜甲、地黃、枸杞等中藥組成。其中主要藥物組成來源于《婦人大全良方》中的“三痹湯”,主要取三痹湯溫腎除痹之力。原方用于婦人血?dú)饽郎?手足拘攣，其適應(yīng)癥與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的下肢無力和腰背疼痛甚為類似。腎氣為督脈之本,強(qiáng)骨合劑中又融合了宋代《太平惠民和劑局方》仙靈脾散,取其淫羊藿與骨碎補(bǔ)藥對,增強(qiáng)補(bǔ)益腎氣,活血通痹之功。該方總體立意以骨碎補(bǔ)、淫羊藿等補(bǔ)腎壯骨,配伍丹參、牛膝等中藥活血通絡(luò)。前期臨床研究顯示[18-19],該方藥物安全性良好,且能顯著改善老年骨質(zhì)疏松癥患者腰膝酸軟無力、站立行走不便、頭暈?zāi)垦５取肮丘簟弊C候,也能明顯緩解長期反復(fù)骨痛的“骨痹”癥狀。前期臨床研究初步證實(shí)[20-22],本方可調(diào)節(jié)腎虛血瘀型老年骨質(zhì)疏松患者骨代謝生化指標(biāo),抑制骨吸收速率,明顯提高骨密度。雖然強(qiáng)骨合劑作為治療骨質(zhì)疏松癥安全有效的臨床復(fù)方,其抑制骨質(zhì)疏松骨吸收亢進(jìn)的機(jī)制仍不明確。

Wnt/β-catenin通路是重要的骨形成調(diào)控通路,在骨骼穩(wěn)態(tài)和骨修復(fù)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。人類Wnt的功能獲得性突變會導(dǎo)致高骨量表型,例如van Buchem病。相比之下,功能喪失性突變會導(dǎo)致骨質(zhì)減少性疾病,例如骨質(zhì)疏松性假神經(jīng)膠質(zhì)瘤綜合征[23]。研究表明,Wnt信號通過維持干細(xì)胞的自我更新和增殖、誘導(dǎo)分化和減少骨祖細(xì)胞的凋亡來調(diào)節(jié)骨量[24-25]。此外,β-catenin干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨細(xì)胞形成,通過直接刺激Runx2基因表達(dá)減少成熟成骨細(xì)胞的凋亡[25-26]。在骨質(zhì)疏松癥患者中,低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(LRP5)的功能喪失突變[27]。去卵巢大鼠雌二醇、LRP5、Runx2和β-catenin水平降低,提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路可能參與了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病[28]。此外,經(jīng)典的Wnt/β-catenin軸是一種進(jìn)化上保守的信號通路,它被Wnt配體激活,在血管生成的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用[29]。當(dāng)Wnt/β-catenin通路被激活時,β-catenin會從N末端的GSK3β的絲氨酸和蘇氨酸磷酸化中逃脫,破壞復(fù)合物的穩(wěn)定性[30-31]。因此,β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中,調(diào)節(jié)Wnt靶基因的表達(dá)[32-33]。多種促血管生成介質(zhì)如VEGF是已知的Wnt靶點(diǎn),其啟動子包含β-catenin反應(yīng)元件。研究發(fā)現(xiàn),在VEGF啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游805 bp處的T細(xì)胞因子4(TCF-4)結(jié)合元件是這種效應(yīng)的重要介質(zhì)[34-35]。眾多文獻(xiàn)已表明,通過Wnt/β-catenin通路可調(diào)節(jié)VEGF和血管形成[36]。

本研究結(jié)果顯示,強(qiáng)骨合劑組、雌二醇對照組大鼠的子宮指數(shù)、骨密度和骨生物力學(xué)性能均顯著高于模型組。強(qiáng)骨合劑明顯改善去卵巢模型大鼠股骨組織病理形態(tài)變化,顯著提高股骨組織中Wnt3a、β-catenin、VEGF、OPG mRNA水平,以及VEGF、CD31、Wnt3a、p-GSK3β、β-catenin蛋白表達(dá)水平。這些結(jié)果表明強(qiáng)骨合劑可有效改善圍絕經(jīng)期大鼠骨質(zhì)疏松癥狀,改善骨生物力學(xué),其具體的機(jī)制可能是通過調(diào)控Wnt3a/β-catenin/VEGF通路促進(jìn)血管生成實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述,強(qiáng)骨合劑可能通過正向調(diào)控Wnt3a/β-catenin信號通路,促進(jìn)VEGF生成,促進(jìn)血管生成,提高骨密度,改善骨組織形態(tài),從而發(fā)揮對骨質(zhì)疏松癥的治療效果,但具體的分子機(jī)制還需進(jìn)一步的深入研究。此外,中藥復(fù)方具有多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，除了Wnt3a/β-catenin/VEGF信號通路外,是否還有其他信號通路參與到強(qiáng)骨合劑的藥理效應(yīng)中?這亦需通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。