基于功效成分群的中成藥全過程質(zhì)量控制體系探索

肖偉,張新莊,曹亮,王振中

(1.中藥制藥過程新技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 連云港 222000;2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司,江蘇 連云港 222000)

中藥產(chǎn)業(yè)傳承與創(chuàng)新發(fā)展是國家重大戰(zhàn)略需求,但面臨著傳承不足,創(chuàng)新不夠,作用發(fā)揮不充分的困境。習(xí)近平總書記明確提出了繼承和創(chuàng)新相結(jié)合的發(fā)展方向,只有落實(shí)好繼承與創(chuàng)新,才能將中醫(yī)藥這一祖先留給我們的寶貴財(cái)富繼承好、發(fā)展好、利用好。中成藥可工業(yè)化生產(chǎn)、普適性應(yīng)用,具有很強(qiáng)的可持續(xù)發(fā)展特征,既繼承了中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論,又可運(yùn)用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)解析其特征,功能主治與化學(xué)藥藥理作用及適應(yīng)癥相接近,利于中醫(yī)藥學(xué)傳統(tǒng)理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論的融通,也有利于中醫(yī)藥的學(xué)術(shù)傳承與推廣應(yīng)用。然而,如何將傳統(tǒng)中醫(yī)藥的宏觀調(diào)節(jié)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的微觀治療(靶蛋白和通路)統(tǒng)一起來,在繼承的基礎(chǔ)上闡明中藥科學(xué)內(nèi)涵,是中成藥發(fā)展的關(guān)鍵科學(xué)問題,也是最基礎(chǔ)的問題。中醫(yī)藥與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論的差異需要以中成藥為載體進(jìn)行解析,從而促進(jìn)兩個(gè)體系互通與融合。

首先,中成藥源于中醫(yī)藥理論,需繼承功能主治內(nèi)涵,即“功效”特點(diǎn),用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)解讀后,讓現(xiàn)代醫(yī)學(xué)聽得懂、看得清。其次,需要解析清楚中藥多成分-多靶點(diǎn)-多途徑作用特征中“中藥復(fù)雜體系-功效成分群”“機(jī)體復(fù)雜體系-功效相關(guān)靶點(diǎn)群”之間的相互作用關(guān)系和特點(diǎn)。解析的功效成分群應(yīng)能轉(zhuǎn)化至實(shí)際生產(chǎn),保證可實(shí)現(xiàn)、可控制;功效相關(guān)靶點(diǎn)群能從多維度的體內(nèi)外藥效試驗(yàn)和循證臨床研究中得到印證。以上研究將能形成現(xiàn)代中藥安全、有效、質(zhì)量可控的系統(tǒng)證據(jù)鏈,從而構(gòu)成可被中西醫(yī)都認(rèn)同的中藥創(chuàng)新發(fā)展的基石。為此,圍繞中成藥功效成分群發(fā)現(xiàn)及其如何應(yīng)用于生產(chǎn)全過程質(zhì)量控制開展了一些探索研究工作,現(xiàn)整理如下。

1 中成藥功效成分群發(fā)現(xiàn)

藥物有效性的內(nèi)涵是“物質(zhì)清晰、機(jī)制明確、量效精準(zhǔn)”。中成藥是源于中藥復(fù)方的多組分組合藥物,既有中醫(yī)整體觀用藥規(guī)則,又有多重療效的療效關(guān)系,如何賦予其量效特點(diǎn)準(zhǔn)確依據(jù)?功能主治的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)核又是什么?因此解析其物質(zhì)基礎(chǔ)功效機(jī)制和量效范圍是體現(xiàn)中成藥原創(chuàng)優(yōu)勢的核心,亟需建立中成藥復(fù)雜體系整體功效成分群的研究方法。為此我們從“中成藥是什么在起作用、怎么起作用、在什么劑量范圍更有效”為出發(fā)點(diǎn),以“中成藥功效成分群”為核心(圖1),嘗試探索解析中成藥效應(yīng)特點(diǎn)和整合效應(yīng)機(jī)制、配伍配比和劑量-效應(yīng)關(guān)系,使中成藥具備“安全、有效”的藥物基本屬性,同時(shí),又能回歸宏觀的傳統(tǒng)理論。

圖1 中藥功效成分群

1.1 基于疾病靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)擾動(dòng)的中藥功效成分群發(fā)現(xiàn)技術(shù)

首先以疾病不同癥狀、臨床指標(biāo)為出發(fā)點(diǎn)構(gòu)建生物子網(wǎng)絡(luò),進(jìn)而搭建疾病相關(guān)分子網(wǎng)絡(luò),利用現(xiàn)代色譜、質(zhì)譜等波譜技術(shù)進(jìn)行中成藥全成分譜檢識;其次通過文本挖掘、ADME預(yù)測、分子對接、網(wǎng)絡(luò)擾動(dòng)分析等預(yù)測中成藥主要活性成分群和潛在靶點(diǎn)群;然后對潛在靶點(diǎn)群進(jìn)行基因注釋(GO)和生物通路富集等生物信息分析,綜合解析靶點(diǎn)-生物通路-臨床指標(biāo)/癥狀的機(jī)制,進(jìn)而揭示中成藥的作用機(jī)理,闡釋科學(xué)內(nèi)涵[1-2](圖2)?；谏鲜鏊悸?聯(lián)合北京大學(xué)等多個(gè)高校團(tuán)隊(duì)搭建了天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫、中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析系統(tǒng)、中醫(yī)藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)等多個(gè)數(shù)據(jù)庫[3],構(gòu)建了中藥多成分的ADME、靶點(diǎn)預(yù)測等模型,實(shí)現(xiàn)了從中藥成分ADME分析,到靶點(diǎn)預(yù)測、通路分析和整合功效分析。

圖2 基于疾病靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)擾動(dòng)的中成藥功效成分發(fā)現(xiàn)

1.2 基于組分譜效的中藥功效成分群發(fā)現(xiàn)技術(shù)

借助化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對指紋圖譜化學(xué)信息與藥效指標(biāo)信息進(jìn)行相關(guān)性分析,將“可視”的“譜”成分與“可測”的“效”作用聯(lián)系起來,從而解析中成藥潛在的功效成分群。采用硅膠柱色譜、制備色譜等方法將中成藥分離成多個(gè)流分,根據(jù)色譜檢識結(jié)果合并類似組分,獲得化學(xué)成分差異較大的不同部分,采用正交試驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法設(shè)計(jì)制備得到化學(xué)成分有明顯交叉但含量均不一樣的組分,一方面用UPLC-MS采集這些組分總離子流圖,與前期建立的中成藥化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,獲得組分的共有峰;另一方面在靶點(diǎn)、細(xì)胞、離體組織、整體動(dòng)物模型上評價(jià)組分的活性;最后采用灰色關(guān)聯(lián)度和偏最小二乘法(PLS)分析共有峰相對峰面積和不同藥理活性數(shù)據(jù)相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)功效成分群[4]。

1.3 基于活性導(dǎo)向下的中藥功效成分群發(fā)現(xiàn)技術(shù)

利用HPLC/UPLC-Q-TOF/MS/MS對中成藥化學(xué)成分全面檢識的基礎(chǔ)上,以色譜圖為檢測手段,采用大孔樹脂、溶劑萃取等方式將提取物分離為化學(xué)成分基本不交叉的不同餾分,通過細(xì)胞、離體組織、整體動(dòng)物的活性評價(jià),確定主要活性部位;進(jìn)一步采用硅膠柱色譜、反相色譜、凝膠柱色譜以及制備液相等分離技術(shù)對活性部位進(jìn)行化學(xué)成分的分離鑒定,經(jīng)體外酶學(xué)、細(xì)胞試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證和體內(nèi)藥效確證,最終明確中成藥的主要活性成分群[5]?？紤]到中藥有效成分含量低、多種結(jié)構(gòu)類似物共存、種類繁多、化學(xué)穩(wěn)定性差、理化性質(zhì)跨度大,經(jīng)典柱色譜法效率低、成本高、重現(xiàn)性差且難以規(guī)?；苽?聯(lián)合科研院所的化學(xué)團(tuán)隊(duì)從連續(xù)色譜分離技術(shù)、真空色譜技術(shù)和二維色譜分離技術(shù)入手,研發(fā)了多通道邏輯控制閥控制的工業(yè)級動(dòng)態(tài)軸向壓縮色譜系統(tǒng)與連續(xù)分離裝備[6],搭建可高效、規(guī)模化制備中藥組分/成分色譜平臺,實(shí)現(xiàn)中藥化學(xué)成分連續(xù)性、自動(dòng)化、質(zhì)量可控、收率穩(wěn)定的制備,為中藥活性成分群體內(nèi)藥效驗(yàn)證和體外活性篩選提供有力支撐。

1.4 基于“高通量轉(zhuǎn)錄組-高內(nèi)涵-整體驗(yàn)證”的中藥功效成分篩選技術(shù)

圍繞疾病病理過程建立系列相關(guān)細(xì)胞模型,通過藥物處理和轉(zhuǎn)錄組測序,并結(jié)合生物信息學(xué)分析技術(shù),篩選差異表達(dá)基因及轉(zhuǎn)錄本,利用差異基因進(jìn)一步富集到差異顯著的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、代謝通路和疾病通路。在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建基于靶點(diǎn)和通路的高通量-高內(nèi)涵篩選模型篩選中成藥的活性成分群,結(jié)合入血成分分析和體內(nèi)動(dòng)物藥效評價(jià),從而解析中成藥的功效成分群[7]。

1.5 基于配伍配比的中成藥功效成分發(fā)現(xiàn)技術(shù)

多成分組合是控制復(fù)雜疾病的一種有效的治療策略,而組合成分?jǐn)?shù)增加引起的組合可能性幾何倍數(shù)增加使得高通量辨識出協(xié)同組合藥對十分困難,計(jì)算預(yù)測模型為多成分組合藥物的研究提供了可能。中藥復(fù)方是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下遵照君臣佐使和七情和合配伍形成的臨床有效方劑,是多靶點(diǎn)組合藥物典型代表?？梢?中藥中成分間的相互作用是其起效的物質(zhì)基礎(chǔ),由此嘗試對功效成分的配伍配比進(jìn)行探索。建立臨床組合藥物數(shù)據(jù)庫(PreDC)中藥物組合標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)集,提取化學(xué)結(jié)構(gòu)、藥理學(xué)、基因組學(xué)、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)等特征,利用貝葉斯網(wǎng)絡(luò)整合多維參數(shù)形成綜合特征,采用最大熵原理構(gòu)建多成分互作關(guān)系預(yù)測模型[2]和信息流原理構(gòu)建基于生物網(wǎng)絡(luò)的多線程藥物協(xié)同定量計(jì)算模型[8],預(yù)測中藥多成分協(xié)同配比,隨后采用分子印跡技術(shù)結(jié)合體內(nèi)外藥理模型解析中成藥的功效成分群[9]。

綜上,中成藥功效成分發(fā)現(xiàn)群研究建立了兩個(gè)技術(shù)體系(圖3),通過功效成分辨識、制備、集成、聚集,確定了中成藥功效成分群;通過功效成分量效范圍評價(jià)、確認(rèn),確證了中成藥功效成分群的量效關(guān)系,從而發(fā)現(xiàn)中成藥代表功效的成分群,解析成分群整合作用機(jī)制。

圖3 中藥功效成分群發(fā)現(xiàn)技術(shù)

2 基于功效成分群的中成藥生產(chǎn)全過程質(zhì)量控制策略

在“藥品質(zhì)量是設(shè)計(jì)、生產(chǎn)出來的,不是檢驗(yàn)出來的”這一理念下,對中成藥產(chǎn)品整個(gè)生命周期內(nèi)功效成分群傳遞過程進(jìn)行質(zhì)量管理和全產(chǎn)業(yè)鏈質(zhì)量追溯體系探索研究,以期建立從藥材采集、加工、投料、提取到成品的中成藥全過程質(zhì)量控制體系(圖4)。

圖4 中成藥生產(chǎn)全過程質(zhì)量控制策略

2.1 藥材到飲片的質(zhì)量控制體系

建立藥材的全時(shí)段多波長融合指紋圖譜和功效成分群定量測定方法,結(jié)合收率等指標(biāo),利用偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)等統(tǒng)計(jì)方法建立分析模型,考察產(chǎn)地,確定最佳采收期、加工方法和炮制工藝參數(shù),對藥材生產(chǎn)中產(chǎn)地適宜性、種植、田間管理、病蟲害綜合防治、包裝貯藏、運(yùn)輸進(jìn)行生產(chǎn)調(diào)查,制定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程,建立中藥材生產(chǎn)管理規(guī)范的技術(shù)要求。采集離線藥材紅外光譜圖,進(jìn)行異常點(diǎn)剔除處理后,優(yōu)化功效成分近紅外原始光譜數(shù)據(jù)的預(yù)處理方法和建模最佳光譜波段,運(yùn)用主成分回歸分析法(PCA)、PLS等統(tǒng)計(jì)分析方法建立功效成分的最佳校正定量分析模型,結(jié)合藥材功效成分群一測多評的定量測定方法、定性指紋圖譜,制定藥材的質(zhì)量評價(jià)體系[10]。

2.2 飲片到中間體的質(zhì)量控制體系

建立飲片、中間體的多波長多維融合指紋圖譜和多功效成分定量測定方法。確定不同生產(chǎn)工段的關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQAs),如功效成分群含量或轉(zhuǎn)移率、浸膏質(zhì)量等,經(jīng)數(shù)據(jù)地圖、數(shù)據(jù)整理、數(shù)據(jù)清洗后、提取特征,結(jié)合CQAs,采用Pearson相關(guān)分析與灰色關(guān)聯(lián)分析相結(jié)合的方法,篩選潛在關(guān)鍵工藝參數(shù)(CPPs),再利用提取的物料屬性(CMAs),采用PLS算法結(jié)合變量重要性投影(VIP)、方差膨脹因子(VIF)和回歸系數(shù),篩選潛在關(guān)鍵物料屬性,以關(guān)鍵工藝參數(shù)/物料屬性為輸入變量,建立CQAs的PLS模型,辨識工段的關(guān)鍵工藝參數(shù),通過對工段的工藝參數(shù)和質(zhì)量參數(shù)的關(guān)聯(lián)分析,明確生產(chǎn)過程中工藝參數(shù)對質(zhì)量屬性的影響,為工段關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQAs)在線監(jiān)控、預(yù)測性調(diào)控和質(zhì)量持續(xù)改進(jìn)提供支撐[11-12]。

在線采集工段過程中樣品的近紅外光譜圖和離線檢測功效成分群含量后,對近紅外光譜圖,分別采用三維空間分布值和線性相關(guān)性統(tǒng)計(jì)量或杠桿值(Leverage)和學(xué)生化殘差(Studentized residual)及馬氏距離(Mahalanobis distance)等方法進(jìn)行異常點(diǎn)的剔除處理,以校正集及交叉驗(yàn)證集模型相關(guān)系數(shù)(R2)、校正集及交互驗(yàn)證集均方根驗(yàn)證誤差(RMSEC,RMSEP)為指標(biāo),對功效成分近紅外原始光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理方法和建模最佳光譜波段篩選,之后運(yùn)用PLS或最小二乘支持向量機(jī)法(LS-SVM)或人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法(ANN)等方法優(yōu)化建立功效成分的最佳校正定量分析模型,快速準(zhǔn)確得到工段過程中未知樣品的功效成分含量,進(jìn)而達(dá)到實(shí)時(shí)監(jiān)測的目的[13-15]。

2.3 中間體到成品的質(zhì)量控制體系

建立離線的成品指紋圖譜、藥材-中間體-成品的全過程融合指紋圖譜和多功效成分的定量測定方法,制定相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)合大數(shù)據(jù)分析思路和生產(chǎn)操作,綜合采用數(shù)據(jù)地圖、數(shù)據(jù)整理、數(shù)據(jù)清洗、特征提取以及過程建模等方法,從生產(chǎn)大數(shù)據(jù)中辨識制劑成型工段中關(guān)鍵工藝參數(shù)。引入近紅外光譜分析技術(shù),建立基于近紅外光譜的在線定量分析模型,實(shí)時(shí)檢測功效成分群含量;結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)過程控制(MSPC)技術(shù)建立統(tǒng)計(jì)模型,形成工序過程/成品的主成分得分、HotellingT2和DmodX軌跡圖,監(jiān)控過程操作參數(shù)的異常波動(dòng),制定工藝過程批放行定量和定性標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)現(xiàn)過程操作參數(shù)的全程監(jiān)控,觀測過程中的質(zhì)量變化[16-18]。

3 討論

“功效成分群”是中成藥成分群與靶點(diǎn)群多維關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)化的效應(yīng)物質(zhì)總和,可轉(zhuǎn)化為中成藥生產(chǎn)過程控制的質(zhì)量標(biāo)志物,對中成藥現(xiàn)代化生產(chǎn)具有重要意義。本團(tuán)隊(duì)多年來圍繞功效成分群發(fā)現(xiàn)及其在全過程質(zhì)量控制方面做的工作,以保障中成藥質(zhì)量均一性,提升其有效性,滿足現(xiàn)代社會(huì)對其需求。盡管在功效成分群研究方面建立了多種研究策略,但其中仍有諸多限制,需要融合更多領(lǐng)域的技術(shù)方法,多尺度評價(jià)豐富功效成分群研究策略,將藥物作用與中醫(yī)病證相對應(yīng),更加系統(tǒng)地闡明中成藥的功效成分群。