p100Rb和p80Rb過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響

李 強(qiáng)，李彩紅，周 恒，喬 兵，劉建軍，范禮斌

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma,RB)是一種早發(fā)的兒童惡性腫瘤，是由基因突變導(dǎo)致的[1]，基因分析表明RB的發(fā)生與RB1基因的突變有關(guān)[2]。RB1基因由27個(gè)外顯子和26個(gè)內(nèi)含子組成，定位于13q14上，全長(zhǎng)178 143 bp， 編碼序列(coding sequence，CDS)全長(zhǎng)2 787 bp，編碼928個(gè)氨基酸[3]。RB1基因編碼的Rb蛋白含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，即N端結(jié)構(gòu)域、A/B口袋結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域[4]。Rb蛋白在細(xì)胞內(nèi)磷酸化的程度與其生物學(xué)功能密切相關(guān)，例如低磷酸化或非磷酸化狀態(tài)的Rb可與E2F1結(jié)合形成復(fù)合物，阻止E2F1轉(zhuǎn)錄因子的釋放，使得E2F1介導(dǎo)的進(jìn)入S期所必需的基因無(wú)法表達(dá)；而當(dāng)Rb蛋白被CDK與周期蛋白復(fù)合物作用轉(zhuǎn)變?yōu)槌姿峄癄顟B(tài)時(shí)，Rb-E2F1復(fù)合物解離，釋放的E2F1作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游靶基因的表達(dá)[5]。此外，Rb蛋白在細(xì)胞的凋亡、染色質(zhì)重塑等方面也有重要的作用[6]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在依托泊苷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Rb被caspase裂解，去除掉C端的42個(gè)氨基酸殘基，產(chǎn)生一個(gè)100 ku的蛋白p100Rb[7]。在人骨肉瘤細(xì)胞Saos-2中也發(fā)現(xiàn)了一種突變的Rb蛋白p80Rb，其轉(zhuǎn)錄本與野生型Rb相比缺失了編碼C端的21～27外顯子[8]。目前尚無(wú)p100Rb和p80Rb相關(guān)生理功能的報(bào)道。為此，該研究構(gòu)建了pcDNA3.1-p100Rb-FLAG和pcDNA3.1-p80Rb-FLAG真核表達(dá)載體，并過(guò)表達(dá)于HEK 293T細(xì)胞中，擬確定它們對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1質(zhì)粒、菌株與細(xì)胞 pcDNA3.1-RB1-FLAG和pcDNA3.1真核表達(dá)載體、TG1菌株、HEK 293T細(xì)胞均為安徽醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院范禮斌實(shí)驗(yàn)室自存，U2OS細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2主要儀器 Gelx-1620凝膠成像分析系統(tǒng)(上海歐翔科學(xué)儀器有限公司)；Axio Observer倒置熒光顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)；PTC-1148小型梯度PCR儀(上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)；BSC-Ⅱ級(jí)生物安全柜(美國(guó)Thermo公司)；光吸收酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)；CytoFlex流式細(xì)胞儀、Microfuge 20R高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)。

1.1.3主要試劑 胎牛血清(美國(guó)Clark公司)；DMEM培養(yǎng)基(澳洲Hyclone公司)；Opti-MEM低血清培養(yǎng)基、McCoy′s5a培養(yǎng)基(美國(guó)Thermo Fischer Scientific公司)；胰酶細(xì)胞消化液(含EDTA)、Western細(xì)胞裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、一抗稀釋液、Lipofectamine 8000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；改良型Bradford法蛋白濃度測(cè)定試劑盒、BamHⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、T4連接酶(上海生工生物有限公司)；DNA聚合酶(日本Takara公司)；膠回收、質(zhì)粒小抽試劑盒(美國(guó)Axygen公司)； 0.2 μm PVDF膜(美國(guó)BIO-RAD 公司)；FLAG抗體F1804(美國(guó)Sigma公司)；辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG(北京中杉金橋生物有限公司)；Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒(上海貝博生物科技有限公司)；細(xì)胞周期PI染液(美國(guó)BD公司)。

1.2 方法

1.2.1質(zhì)粒構(gòu)建 實(shí)驗(yàn)所用PCR引物由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成，序列見(jiàn)表1。以pcDNA3.1-RB1-FLAG真核表達(dá)質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增出含有FLAG標(biāo)簽的p80Rb和p100Rb的CDS序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，利用膠回收試劑盒獲得純化的PCR產(chǎn)物。純化的PCR產(chǎn)物或pcDNA3.1載體用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ限制性內(nèi)切酶雙酶切，酶切后的PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1載體用T4連接酶連接，并用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞置于含氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)約10 h，分別挑取數(shù)個(gè)單克隆至含有氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)約12 h，質(zhì)粒抽提后，用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，最后測(cè)序酶切正確的重組質(zhì)粒。

表1 PCR引物序列表

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) U2OS細(xì)胞使用含有10% FBS的McCoy′s5a培養(yǎng)基(100 U/ml青霉素+100 μg/ml鏈霉素)在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；HEK 293T細(xì)胞使用含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基(100 U/ml青霉素+100 μg/ml鏈霉素)。37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 將1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到約70%～80%時(shí)，更換新鮮完全培養(yǎng)液。在無(wú)菌離心管中依次加入125 μl Opti-MEM?Medium、2.5 μg質(zhì)粒DNA、4 μl Lipo8000TM轉(zhuǎn)染試劑，充分混勻后分別均勻滴入上述細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)，輕輕混勻。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后用于蛋白表達(dá)和流式細(xì)胞術(shù)分析，培養(yǎng)24 h后用于免疫熒光觀察。

1.2.4間接免疫熒光顯微術(shù) 取出有U2OS細(xì)胞蓋玻片，用預(yù)冷的PBS溶液清洗，-20 ℃預(yù)冷的甲醇固定10 min，封閉液(1%脫脂奶粉的TBST溶液)室溫封閉30 min，一抗溶液(1 ∶100)室溫孵育2 h，TRITC標(biāo)記的二抗溶液(1 ∶100)室溫孵育1 h，DAPI染細(xì)胞核5 min，最后將蓋玻片固定至載玻片上，4 ℃保存過(guò)夜后，熒光顯微鏡觀察。

1.2.5Western blot檢測(cè) 收集細(xì)胞沉淀并置于冰上裂解，20 min后收集蛋白裂解液，14 000 r/min離心20 min，收集上清液并測(cè)定蛋白含量，取適量蛋白上清液加入5×SDS上樣緩沖液，100 ℃變性7 min、冰浴3 min后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，252 mA恒流電轉(zhuǎn)1.5 h將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)移后的PVDF膜用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉1.5 h，加入相應(yīng)的一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1.5 h，最后用ECL試劑盒顯色并在化學(xué)發(fā)光儀(Gelx-1620)上進(jìn)行顯影。

1.2.6細(xì)胞周期 離心收集的細(xì)胞沉淀用預(yù)冷的PBS溶液清洗，逐滴加入500 μl預(yù)冷的70%乙醇 -20 ℃ 固定過(guò)夜，離心收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS溶液清洗，加入500 μl PI染液，4 ℃避光孵育15 min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，不同時(shí)相的細(xì)胞百分比用FlowJo軟件分析。

1.2.7細(xì)胞凋亡 離心收集的細(xì)胞沉淀用預(yù)冷的PBS溶液清洗，再用400 μl AnnexinV溶液與密度為106個(gè)/ml的懸浮細(xì)胞孵育，再加入5 μl Annexin V-FITC 染色液，4 ℃避光孵育15 min后，加入10 μl PI染色液4℃避光孵育5 min，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，用FlowJo軟件分析凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 p100Rb和p80Rb真核表達(dá)載體的構(gòu)建利用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ限制性內(nèi)切酶對(duì)構(gòu)建的pcDNA3.1-p100Rb-FLAG和pcDNA3.1-p80Rb-FLAG質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖1A。圖中可見(jiàn)，構(gòu)建的質(zhì)粒含有插入片段，而對(duì)照載體沒(méi)有。酶切鑒定正確的質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序，證明構(gòu)建質(zhì)粒的插入片段是正確的，見(jiàn)圖1B、C。

圖1 pcDNA3.1-p100Rb-FLAG和pcDNA3.1-p80Rb-FLAG重組質(zhì)粒的酶切鑒定與測(cè)序結(jié)果

2.2 p100Rb和p80Rb在U2OS細(xì)胞中的熒光定位分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-p80Rb-FLAG和pcDNA3.1-p100Rb-FLAG至U2OS細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24 h將蓋玻片取出并進(jìn)行免疫熒光制片，熒光顯微鏡下觀察p100Rb和p80Rb在U2OS細(xì)胞中的分布。結(jié)果表明p100Rb均主要分布在細(xì)胞核中，而p80Rb分布細(xì)胞質(zhì)且聚集在核膜側(cè)，見(jiàn)圖2。

圖2 p100Rb和p80Rb在U2OS細(xì)胞中的熒光定位圖 ×400

2.3 p100Rb和p80Rb在HEK 293T細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)將pcDNA3.1-RB1-FLAG，pcDNA3.1-p100Rb-FLAG和pcDNA3.1-p80Rb-FLAG真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至HEK 293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞并裂解，進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果可見(jiàn)Rb、p100Rb和p80Rb分子量相應(yīng)的條帶，而對(duì)照組(未處理和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1載體的細(xì)胞裂解液)未見(jiàn)任何條帶，表明Rb、p100Rb和p80Rb在HEK 293T細(xì)胞中可以表達(dá)，見(jiàn)圖3。

圖3 p100Rb和p80Rb在HEK 293T細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)

2.4 p100Rb和p80Rb對(duì)HEK 293T細(xì)胞周期的影響分別將pcDNA3.1-RB1-FLAG，pcDNA3.1-p100Rb-FLAG，pcDNA3.1-p80Rb-FLAG和pcDNA3.1轉(zhuǎn)染至HEK 293T細(xì)胞中，約48 h后收集細(xì)胞，分別進(jìn)行PI單染，然后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期(表2)。與pcDNA3.1載體對(duì)照組比較，Rb和p100Rb過(guò)表達(dá)組G1期百分比升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；p80Rb過(guò)表達(dá)G1期百分比無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明過(guò)表達(dá)的Rb和p100Rb使HEK 293T細(xì)胞周期阻滯在G1期，而過(guò)表達(dá)的p80Rb對(duì)HEK 293T細(xì)胞周期無(wú)影響，見(jiàn)圖4。

表2 p100Rb和p80Rb對(duì)HEK 293T細(xì)胞周期的影響

圖4 p100Rb和p80Rb過(guò)表達(dá)后HEK 293T細(xì)胞的細(xì)胞周期圖

2.5 p100Rb和p80Rb對(duì)HEK 293T細(xì)胞凋亡的影響分別將pcDNA3.1-RB1-FLAG，pcDNA3.1-p100Rb-FLAG，pcDNA3.1-p80Rb-FLAG和pcDNA3.1轉(zhuǎn)染至HEK 293T細(xì)胞中，約48 h后收集細(xì)胞，分別進(jìn)行Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染，然后流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡(表3)。結(jié)果表明，與pcDNA3.1載體對(duì)照組比較，Rb、p100Rb和p80Rb過(guò)表達(dá)組細(xì)胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明Rb、p100Rb和p80Rb能夠有效抑制HEK 293T細(xì)胞的凋亡，見(jiàn)圖5。

圖5 p100Rb和p80Rb過(guò)表達(dá)后HEK 293T細(xì)胞的凋亡圖

表3 Rb截短體對(duì)細(xì)胞的影響

3 討論

現(xiàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Rb蛋白不僅在細(xì)胞周期調(diào)控方面起關(guān)鍵的作用，而且在染色質(zhì)重塑、凋亡、衰老以及分化等方面也具有重要的作用[9]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的過(guò)程，可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)水解和DNA斷裂[10]。用凋亡誘導(dǎo)劑依托泊苷處理后，Rb的C端 42個(gè)氨基酸被caspase切割產(chǎn)生p100Rb的截短體[7]。另外，早期的研究[8]表明Saos-2細(xì)胞中沒(méi)有全長(zhǎng)的Rb蛋白，但是含有一個(gè)Rb蛋白的缺失突變體p80Rb(缺失21～27外顯子)。Rb蛋白定位于細(xì)胞核，其核定位信號(hào)為羧端的860KRSAEGSNPP KPLKKLR876[11]。p100Rb含有這個(gè)核定位序列，但p80Rb缺失這個(gè)序列，本研究結(jié)果也表明p100Rb定位在細(xì)胞核，而p80Rb定位在細(xì)胞質(zhì)。Rb蛋白的口袋結(jié)構(gòu)域可與E2F1結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程[12]?？诖Y(jié)構(gòu)域中的T373和S608/S612的磷酸化可導(dǎo)致與Rb蛋白結(jié)合的E2F1釋放出來(lái)，E2F1刺激進(jìn)入S期的相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S 期[12]。p100Rb含有完整Rb口袋結(jié)構(gòu)域，能與E2F1結(jié)合；而p80Rb不含有完整的口袋結(jié)構(gòu)域，不能與E2F1結(jié)合[7-8]。本研究結(jié)果表明p100Rb阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，而p80Rb對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程沒(méi)有影響，原因可能是前者能結(jié)合E2F1，而后者不能結(jié)合E2F1。

E2F1不僅能夠與Rb蛋白結(jié)合調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程，還具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能[13]。研究發(fā)現(xiàn)E2F1不僅與口袋結(jié)構(gòu)域結(jié)合，還可與Rb的C末端825～860氨基酸區(qū)域結(jié)合，該部位與E2F1誘導(dǎo)的凋亡反應(yīng)有關(guān)[14]。本研究結(jié)果表明p80Rb和p100Rb抑制凋亡，而兩個(gè)截短體C端均缺失了E2F1的結(jié)合部位，提示它們的抗凋亡作用并不是通過(guò)E2F1進(jìn)行的。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)Rb也可定位于線粒體，并通過(guò)與凋亡蛋白Bax的結(jié)合，直接誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的凋亡[15]。p80Rb和p100Rb抑制凋亡表明這兩個(gè)蛋白可能并不與Bax結(jié)合。

綜上所述，過(guò)表達(dá)p100Rb阻滯HEK 293T細(xì)胞周期且抑制凋亡；過(guò)表達(dá)p80Rb對(duì)HEK 293T細(xì)胞周期無(wú)影響但可抑制凋亡。