不同來源生物炭浸提液對辣椒種子萌發(fā)與幼苗生長的毒理效應

李 瑩，劉蘭英，何肖云，邱胤輝，黃銳敏，傅建煒*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所/福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，福建 福州 350003； 2. 福建三明市農(nóng)業(yè)科學研究院， 福建 三明 365000)

生物炭是由生物質(zhì)在高溫限氧條件下，經(jīng)熱解炭化所形成的含碳量較高且高度芳香化的固體產(chǎn)物[1]。前期諸多研究證實，通過將生物炭還田不僅可以加強碳固存，緩解溫室效應，而且能夠改善土壤質(zhì)量[2]，提高作物產(chǎn)量[3]；同時，生物炭具有豐富的孔隙結(jié)構(gòu)和較強的吸附能力，也常被用于污染土壤的修復[4]。因此，近年來生物炭在土壤中的應用日益受到重視，現(xiàn)已成為環(huán)境和農(nóng)業(yè)科學領(lǐng)域的研究熱點之一。然而，目前使用的生物炭多由農(nóng)業(yè)和林業(yè)的殘留物[2]、污泥[5]等物質(zhì)熱解而成，可能含有潛在的濃縮有毒成分，特別是重金屬、多環(huán)芳烴(PAHs)和揮發(fā)性有機物等毒性化合物[6-7]，會對植物產(chǎn)生毒性效應[7-8]。由于土壤施用是一個不可逆過程，生物炭中有毒成分的存在可能會對土壤環(huán)境帶來潛在的威脅，或被植物吸收而進入農(nóng)產(chǎn)品，最終危及人類健康。因此，在利用生物炭進行大規(guī)模的土壤優(yōu)化和修復前，有必要對生物炭的安全性進行評估。

種子的萌發(fā)率和幼苗早期生長對植物后期生長發(fā)育至關(guān)重要，也很大程度決定著作物的產(chǎn)量[9]，基于此，本研究通過測定不同生物炭浸提液處理下辣椒種子萌發(fā)和幼苗生長情況，探討生物炭對辣椒植株抗氧化酶活性和MDA含量的影響，以闡明生物炭對辣椒植株的潛在危害，客觀地評估辣椒幼苗對生物炭應用的反應，為后期進一步利用生物炭對低產(chǎn)辣椒連作土壤改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物辣椒CapsicumannuumL.品種為明椒8號，種子購買于福建省三明市農(nóng)興種苗有限公司；供試生物炭由水稻秸稈、木質(zhì)、牛糞和污泥在500℃快速熱解產(chǎn)生(過100目篩，分別標記為JGBC、MZBC、NFBC和WNBC)，購買于由廣州翠林公司；將制備所得的生物炭分別與高純水按固液比為1∶30的比例混合，在30℃條件下振蕩24 h后，抽濾所得的生物炭浸提液備用[9]。

1.2 生物炭理化性質(zhì)測定

利用元素分析儀(Vario MICRO, Elementar)測定C、N、H元素質(zhì)量分數(shù)，O的質(zhì)量分數(shù)通過差減法得到；灰分的測定參照標準方法ASTME870-82.4[9]，結(jié)果見表1。

表1 不同生物炭灰分含量及元素分析

1.3 生物炭浸提液理化性質(zhì)測定

生物炭浸提液pH和EC分別用pH計和電導儀進行測定；參考《水和廢水監(jiān)測分析方法》[10]，采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICPMS-2030，島津，日本)分析浸提液中金屬元素含量；分別采用總有機碳分析儀(TOC-V，島津，日本)和連續(xù)流動分析儀(AA3，水爾，德國)測定DOC、DON、NO3--N和NH4+-N含量；采用氣相色譜-質(zhì)譜儀(GC QumMS，賽默飛爾，美國)對生物炭中的PAHs的含量進行分析[11]。結(jié)果見表2和表3。

表2 不同生物炭浸提液的部分理化性質(zhì)分析

表3 不同生物炭浸提液中多環(huán)芳烴(PAHs)含量

1.4 試驗處理

選取20粒籽粒飽滿、大小均一的辣椒種子置于鋪有2層紗布的11 cm培養(yǎng)皿中，分別加入10 mL的不同生物炭浸提液，以添加超純水為對照(CK處理)，每個處理重復6次。培養(yǎng)皿置于28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照時間為12 h·d-1，光照強度為3 000 lx；每日補充浸提液或超純水1.5～3.0 mL(具體量依據(jù)種子干濕度確定，且各處理每日添加量保持一致)。以胚根突破種皮1 mm 即視為萌發(fā)標準，每天記錄發(fā)芽種子數(shù)量，整個試驗共持續(xù)20 d。結(jié)束后對辣椒幼苗根長、苗高及鮮重、干重、根系活力和部分生理指標進行測定。

1.5 樣品分析和指標測定

(1)用直尺分別測量辣椒幼苗的主根長度和胚軸到葉尖端長度，即根長和苗高；將幼苗的地上和地下部分分別在75℃下烘至恒重后稱量，即為干重；同時，地下部分干重(g)和地上部分干重(g)的比值為根冠比。

(2)計算種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)[12]。其中，發(fā)芽勢(GE)為萌發(fā)第6 d時發(fā)芽種子占比；發(fā)芽率(GR)為萌發(fā)第14 d時種子萌發(fā)比例；同時計算發(fā)芽指數(shù)(GI)和活力指數(shù)(VI)，其中，GI=Σ(Gt/Dt)，Gt為在td的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應的發(fā)芽日數(shù)；VI=S×GI，S為整株幼苗鮮重(g)。統(tǒng)計萌發(fā)時滯、萌發(fā)高峰期和萌發(fā)持續(xù)時間，其中，萌發(fā)時滯為試驗開始到第1粒種子萌發(fā)的間隔期；萌發(fā)高峰期為試驗開始到當日種子萌發(fā)數(shù)量最多的間隔期；萌發(fā)持續(xù)時間為萌發(fā)開始至萌發(fā)結(jié)束的時間間隔。

(3)對幼苗生理指標進行測定，主要包括辣椒幼苗根與葉的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活力以及丙二醛(MDA)含量。用硫代巴比妥酸法測定葉片丙二醛含量[12]；用氮藍四唑法測定SOD活性，用愈創(chuàng)木酚法測定POD活性，用氯化三苯基四氮唑(TTC)法測定幼苗根系活力[12]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，并利用LSD法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物炭浸提液對辣椒種子萌發(fā)的影響

由表4可知，MZBC和JGBC處理下辣椒種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率較CK處理均無顯著性差異；而WNBC和NFBC處理較CK處理種子發(fā)芽勢分別降低了13.99%、7.80%，發(fā)芽率降低了12.62%、11.4%，均呈顯著性差異(P<0.05)。

MZBC和JGBC處理下種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)較CK處理均無顯著性差異。但WNBC處理下種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)較CK處理分別降低了15.93%和37.84%，NFBC處理下種子活力指數(shù)較CK處理降低了42.8%，均呈顯著差異(P<0.05)。

與CK處理相比，MZBC處理下辣椒種子萌發(fā)時滯縮短了約0.2 d，萌發(fā)高峰期提前約0.4 d，萌發(fā)持續(xù)時間延長了約0.4 d；JGBC處理后，種子萌發(fā)時滯縮短了0.34 d，萌發(fā)高峰期推遲了0.66 d；而WNBC處理下種子萌發(fā)時滯與CK處理無差異，但萌發(fā)高峰期推遲了0.66 d，萌發(fā)持續(xù)時間縮短了0.33 d；而NFBC處理下種子萌發(fā)時滯延遲了0.5 d，萌發(fā)高峰期推遲了0.33d，但萌發(fā)持續(xù)時間縮短了0.83 d。

表4 不同生物炭浸提液對辣椒種子萌發(fā)的影響

2.2 生物炭浸提液對辣椒幼苗生長的影響

由圖1a可知，MZBC處理下辣椒幼苗平均根長和苗高較CK處理分別增加了6.9%和13.29%，但差異不顯著；相反的，WNBC和NFBC處理較CK處理辣椒幼苗平均根長分別降低了22.49%、20.24%，株高分別降低了 27.55%、11.78%，差異顯著(P<0.05)；而JGBC處理與CK處理間幼苗的平均根長和株高均無顯著性差異。

與CK相比，MZBC處理下辣椒的根鮮重和苗鮮重分別增加了18.18%和15.79%(圖1b)；NFBC和WNBC處理下辣椒的根鮮重分別下降了36.36%、21.05%(P<0.05)，苗鮮重分別下降了18.18%、32.37%(P<0.05)；而JGBC處理下辣椒幼苗根鮮重較CK處理增加18.18%，苗鮮重較CK處理降低5.26%。

根冠比能反映植物地上部分與地下部分的生長情況。結(jié)果表明(圖1c)，4個生物炭浸提液處理下辣椒幼苗根冠比均顯著低于CK處理(P<0.05)，其中，MZBC處理下的幼苗根冠比較CK處理降低了35.51%，顯著低于其余3個生物炭處理；同時，對比根系活力發(fā)現(xiàn)(圖1d)，JGBC處理下幼苗根系活力顯著高于CK處理(P<0.05)，MZBC處理較CK處理提高了9.77%，但差異不顯著，而WNBC和NFBC處理較CK處理分別降低了14.29%和18.05%，均達顯著差異(P<0.05)。

注：a為幼苗平均根長和株高，b為幼苗平均根、苗鮮重，c為幼苗根冠比，d為幼苗根系活力；不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)圖1 生物炭浸提液對幼苗生長的影響Fig.1 Effect of biochar extract solutions on the seedling growth

注：不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)圖2 生物炭浸提液對辣椒幼苗根系和葉片丙二醛含量的影響Fig.2 Effect of biochar extract solutions on the content of malondialdehyde in the roots and leaves of pepper seedlings

2.3 生物炭浸提液對辣椒幼苗丙二醛(MDA)含量的影響

由圖2可知，NFBC處理下辣椒幼苗根系MDA含量顯著高于CK處理(P<0.05)，而其余生物炭處理與CK處理間無顯著差異，對比幼苗葉片MDA含量，除JGBC處理顯著低于CK處理外，其余3個生物炭處理均與CK處理無顯著差異。

2.4 生物炭浸提液對辣椒幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖3a可知，NFBC和WNBC處理下幼苗根系SOD活性較CK處理分別增加了20.13%和26.99%，而JGBC處理下幼苗葉片SOD活性較CK處理增加了13.35%，均呈顯著性差異(P<0.05)。同時，對比根系和葉片的POD活性發(fā)現(xiàn)(圖3b)，NFBC和WNBC處理下根系POD活性較CK處理分別提高了30.32%和21.41%(P<0.05)，NFBC處理下葉片POD含量較CK提高了13.8%(P<0.05)。如圖3c所示，4個生物炭處理中，僅NFBC處理下辣椒根系和葉片CAT活性顯著高于CK處理(P<0.05)，分別為51.35%和16.07%。其余處理均與CK處理無顯著差異或低于CK處理。

注：(a)SOD活性；(b)POD活性；(c) CAT活性；不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)圖3 生物炭浸提液對辣椒幼苗根系和葉片SOD、POD和CAT活性的影響 Fig.3 Effect of biochar extract solutions on the activities of SOD, POD and CAT in the roots and leaves of pepper seedlings

3 討論與結(jié)論

3.1 生物炭浸提液對辣椒種子萌發(fā)和幼苗生長差異影響分析

種子萌發(fā)和幼苗生長是植物生命周期中關(guān)鍵的時期，對植物的形態(tài)建成也至關(guān)重要，也是對外界逆境較為敏感的時期之一[13]。本試驗結(jié)果表明，不同生物炭浸提液對辣椒種子萌發(fā)影響差異較大，其中，MZBC處理在促進了辣椒種子的萌發(fā)，縮短了萌發(fā)時滯，提前萌發(fā)高峰期；相反的，WNBC和NFBC處理下辣椒種子萌發(fā)率顯著降低，萌發(fā)時滯和萌發(fā)高峰期推遲，對辣椒種子的萌發(fā)具有抑制效應。這可能是由于不同原料制備的生物炭所含的物質(zhì)種類、含量、性質(zhì)以及正效應因子存在差異所致。

此前，有研究發(fā)現(xiàn)，由于生物炭浸提液存在的重金屬、PAHs等潛在污染物，對黃瓜、番茄、油菜和小麥種子的萌發(fā)均具有抑制效應[7,14-15]。本研究中WNBC和NFBC浸提液中的部分重金屬含量顯著高于MZBC和JGBC，尤其是Cd含量，高于GB15618-2008《土壤環(huán)境質(zhì)量標準》中二級土壤農(nóng)用類標準；此前有研究發(fā)現(xiàn)[17]，低濃度的重金屬脅迫在一定程度上抑制了種子的萌發(fā)，因此，基于WNBC和NFBC浸提液處理后辣椒萌發(fā)率明顯降低，推測這可能主要是由于以上兩類生物炭浸提液中重金屬含量較高的緣故。同時，本研究中使用的4種生物炭浸提液中PAHs總量均未高于二級土壤農(nóng)用類標準，且除NFBC顯著降低外，其他3個生物炭浸提液之間并無顯著性差異。但有研究發(fā)現(xiàn)，低分子量的PAHs(<3 環(huán))會對種子的萌發(fā)產(chǎn)生強烈的抑制作用[16]。因此，污泥和牛糞生物炭對種子萌發(fā)產(chǎn)生抑制的切實原因仍有待進一步研究。前期，李陽等[7]發(fā)現(xiàn)，玉米生物炭中存在高含量的PAHs，其浸提液對小麥種子萌發(fā)并無明顯影響，但對小麥幼苗根、芽生長則呈現(xiàn)低濃度促進而高濃度抑制的 Hormesis效應。這可能是由于小麥種子萌發(fā)早期營養(yǎng)源主要為胚內(nèi)物質(zhì)，但萌發(fā)后期，根、芽生長所需營養(yǎng)主要來源于生長介質(zhì)的原因。

本研究中WNBC和NFBC處理下辣椒幼苗其根長、苗高和幼苗鮮重與此前種子活力指數(shù)所反映的變化趨勢基本一致[18]，表明進入幼苗階段，兩種生物炭的抑制效應一定程度仍在持續(xù)。同時，生物炭處理下的辣椒幼苗其根冠比均顯著低于CK處理，這可能是由于CK組中的生長介質(zhì)只有水，缺乏必需的營養(yǎng)，因此，幼苗在生長過程中，營養(yǎng)成分優(yōu)先滿足根系生長，較少到達冠部，而生物炭浸提液中含有大量的營養(yǎng)元素[9, 19]可以供幼苗用于根系組織發(fā)育和地上部分形態(tài)建成，有效降低了根冠比。

3.2 生物炭浸提液對辣椒幼苗抗氧化酶系統(tǒng)影響分析

此前，丙二醛(MDA)含量和抗氧化酶活性被廣泛用作為污染土壤或逆境脅迫下植物損傷的敏感生物標志物[20]。逆境脅迫下，植物通過提高SOD、CAT、POD 活性維持活性氧代謝平衡，以減少脂質(zhì)過氧化，維持MDA含量在相對較低的水平，確保植物的正常生長[21]。故MDA含量與抗氧化酶活力密切相關(guān)[22]。

本研究中NFBC和WNBC處理下幼苗根系SOD、CAT和POD 活性均顯著高于CK處理，這可能是脅迫環(huán)境下，根系通過開啟抗氧化酶系統(tǒng)以減少活性氧的累積。但NFBC處理下的根系MDA含量顯著高于其余處理，這可能是NFBC處理下，根系抗氧化酶的調(diào)節(jié)能力有限，ROS累積導致細胞膜完整性被破壞，加劇了細胞膜脂質(zhì)過氧化反應，導致根系出現(xiàn)生理損傷[7,15,18]。相較于根系，不同處理下辣椒葉片的抗氧化酶活性變化趨勢并不一致，其中，NFBC處理下葉片POD和CAT活性顯著高于CK處理，但4個生物炭浸提液處理下葉片MDA含量均未高于CK處理，表明相較于根系，葉中的ROS能被抗氧化酶有效清除，未引起明顯的膜脂質(zhì)過氧化反應。這一結(jié)果與李陽等[7]一致，他發(fā)現(xiàn)，盡管高劑量生物炭浸提液處理下的小麥幼苗根葉均存在氧化損傷，但由于胚根與處理液直接接觸，且敏感性高于胚軸[9]，故根系損傷更為嚴重。

本研究綜合分析了不同來源生物炭浸提液對辣椒種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，結(jié)果表明，污泥生物炭和牛糞生物炭浸提液對辣椒種子萌發(fā)呈現(xiàn)出較為明顯的抑制效應，且在辣椒幼苗生長過程中均存在氧化應激。這可能與以上生物炭中含過量的重金屬有關(guān)，但也有文獻認為生物炭中的部分多環(huán)芳烴是導致其對幼苗早期生長產(chǎn)生明顯的毒性效應的誘因[7]。無論如何，在生物炭被廣泛應用于農(nóng)田優(yōu)化的當下，其對植物的毒理效應及存在的潛在生態(tài)環(huán)境風險當引起足夠重視，生物炭對種子萌發(fā)和幼苗生長受生物炭性質(zhì)和植物特性的多方影響，因此，有必要在大范圍推廣應用前期，針對性地對生物炭的性質(zhì)和植物響應進行分析研究，以確保其科學合理使用。