細(xì)胞外囊泡的單顆粒分析技術(shù)

胡蕓蕓，底浩楠，賴輝燕，李雨柔，陳 晨，田 野，顏曉梅

（廈門大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院 化學(xué)生物學(xué)系，譜學(xué)分析與儀器教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，化學(xué)生物學(xué)福建省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361005）

細(xì)胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs）是自然界中各種細(xì)胞均能分泌的具有磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)的納米尺度膜泡，普遍存在于各種體液中。根據(jù)分泌途徑的不同，EVs主要分為多泡體與細(xì)胞膜融合釋放的外泌體（Exosomes，Exos，40~160 nm）及細(xì)胞膜直接出芽脫落的微囊泡（Microvesicles，MVs，50~1 000 nm）［1］。EVs攜帶有豐富的活性生物分子如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等，是細(xì)胞間溝通交流的信使，在臨床診療中顯示出廣闊的應(yīng)用前景［1-2］。EVs不僅個(gè)體極其微小，攜載的生物分子含量極低，而且因細(xì)胞來源、細(xì)胞狀態(tài)以及分泌途徑等不同，使得EVs在粒徑、分子組成及生物學(xué)功能上具有高度的個(gè)體差異性和多樣性。然而，傳統(tǒng)的生化檢測方法如蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等均是對(duì)眾多的EVs進(jìn)行集權(quán)平均分析，掩蓋了EVs的個(gè)體差異，無法分辨EVs的亞群信息。因此，在單顆粒水平對(duì)EVs進(jìn)行精準(zhǔn)分析成為亟待解決的科學(xué)難題。為此，研究者們相繼開發(fā)出一系列可對(duì)EVs的形貌、粒徑等生物物理性質(zhì)以及蛋白、核酸、脂質(zhì)等生物化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征的單顆粒分析（Single vesicle analysis，SVA）技術(shù)，為EVs的分泌、運(yùn)輸和調(diào)控機(jī)制的研究以及疾病診斷和治療方法的開發(fā)提供了重要的技術(shù)支撐［3-4］。本文針對(duì)EVs的SVA技術(shù)進(jìn)行綜述，分析并討論了電子和原子力顯微成像技術(shù)、納米顆粒跟蹤分析技術(shù)（Nanoparticle tracking analysis，NTA）、可調(diào)式電阻脈沖傳感技術(shù)（Tunable resistive pulse sensing，TRPS）、拉曼光譜技術(shù)（Raman spectroscopy，RS）、表面等離子體共振技術(shù)（Surface plasmon resonance，SPR）、干涉相關(guān)顯微成像技術(shù)（Interference microscopy，IM）、單分子熒光顯微成像技術(shù)（Single molecular fluorescence microscopy，SMFM）、數(shù)字化方法（Digital methods，DM）和流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）等的性能及應(yīng)用進(jìn)展，并對(duì)SVA技術(shù)的未來發(fā)展趨勢進(jìn)行了展望。

1 EVs形貌、粒徑、顆粒濃度的表征技術(shù)

1.1 電子及原子力顯微成像技術(shù)

所謂“眼見為實(shí)”，顯微成像技術(shù)被廣泛應(yīng)用于EVs形貌、粒徑等生物物理性質(zhì)的表征。其中，透射電子顯微鏡（Transmission electron microscopy，TEM）［5］和掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscopy，SEM）［6］是對(duì)EVs形貌和粒徑進(jìn)行表征的經(jīng)典方法，但這些技術(shù)在樣本制備過程中必須經(jīng)過固定、脫水等步驟，無法反映EVs的天然形貌特征。冷凍透射電鏡（Cryogenic transmission electron microscopy，Cryo-TEM）是將樣本中的溶劑進(jìn)行快速冷凍固定后，在低溫環(huán)境下使用TEM對(duì)生物樣本進(jìn)行分析的技術(shù)，規(guī)避了干燥、脫水等步驟，可以保證EVs膜結(jié)構(gòu)的完整性［7］。而原子力顯微鏡（Atomic force microscopy，AFM）［8］基于探針與樣品之間的力學(xué)反饋信號(hào)，不僅可以獲得單個(gè)EVs的形貌、粒徑信息，也可獲得其粘度、硬度等物理信息。然而昂貴的儀器設(shè)備、嚴(yán)苛的技術(shù)要求限制了Cryo-TEM和AFM在單個(gè)EVs表征中的應(yīng)用。此外，這些顯微成像技術(shù)均存在所需樣本濃度高、樣品制作復(fù)雜、分析速度慢、粒徑分布缺乏統(tǒng)計(jì)代表性等缺點(diǎn)，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)EVs粒徑、顆粒濃度及生化組成的快速表征。

1.2 納米顆粒跟蹤分析技術(shù)、可調(diào)式電阻脈沖傳感技術(shù)

NTA是一種可對(duì)EVs粒徑分布和顆粒濃度進(jìn)行快速、實(shí)時(shí)、可視化分析的單顆粒表征技術(shù)［9-10］。該技術(shù)采用激光照射基底上的EVs懸浮液，通過高速相機(jī)對(duì)視野中顆粒的散射光點(diǎn)進(jìn)行拍照，進(jìn)而追蹤分析每個(gè)顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)軌跡以獲得擴(kuò)散系數(shù)，再根據(jù)Stockes-Einstein方程計(jì)算EVs的水合粒徑。與此同時(shí)，根據(jù)視野中的顆粒數(shù)量可以計(jì)算出顆粒的濃度。除此之外，NTA技術(shù)還可通過引入膜染料、免疫熒光抗體等熒光標(biāo)記策略，在熒光模式下對(duì)攜載特定蛋白［11-12］、核酸［13］的EVs濃度進(jìn)行定量分析。例如，Baldwin等［13］利用脂質(zhì)體將Cy3標(biāo)記的分子信標(biāo)運(yùn)載入EVs，實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)EVs內(nèi)miR-21的實(shí)時(shí)檢測，并計(jì)算出miR-21的平均拷貝數(shù)為44。近期，Kashkanova等［14］發(fā)展的iNTA（Interferometric NTA）技術(shù)將NTA與激光干涉散射成像技術(shù)（Interferometric scattering microscopy，iSCAT）聯(lián)用，使Au納米顆粒的散射檢測限推進(jìn)至10 nm，且可對(duì)多分散性樣品中的不同組分進(jìn)行精準(zhǔn)檢測與區(qū)分。研究人員通過顆粒的粒徑和干涉信號(hào)值可直接計(jì)算出單個(gè)納米顆粒的折射率。但由于NTA是將納米顆粒在三維空間的布朗運(yùn)動(dòng)投射到一個(gè)二維的平面，擴(kuò)散路徑小于真實(shí)值，導(dǎo)致測定的粒徑結(jié)果偏大；此外所測得的顆粒粒徑包括顆粒的水化層，這些因素導(dǎo)致NTA的粒徑測定值往往比真實(shí)值偏大，粒徑分布相比于真實(shí)分布更寬。隨著其他新型SVA技術(shù)的發(fā)展，NTA技術(shù)逐漸局限于EVs粒徑分布和顆粒濃度的表征分析［3］。

TRPS是一種利用納米孔技術(shù)對(duì)溶液中納米顆粒的粒徑分布和濃度在單顆粒水平進(jìn)行快速測定的技術(shù)［15-16］。當(dāng)EVs通過聚氨酯膜納米孔時(shí)，孔隙阻力增加，納米孔兩端的電流發(fā)生瞬時(shí)下降，其下降幅度與EVs的粒徑呈現(xiàn)相關(guān)關(guān)系，據(jù)此可推導(dǎo)出單個(gè)EVs的粒徑。然而，由于EVs的粒徑分布廣，粒徑較大的EVs往往導(dǎo)致納米孔的堵塞并阻礙進(jìn)一步測量。

2016年，Akers等［17］分別采用NTA和TRPS技術(shù)對(duì)腦脊液來源的EVs濃度、粒徑進(jìn)行測定，并對(duì)比其表征結(jié)果。該研究指出，相比于TRPS，NTA在小于150 nm的粒徑范圍內(nèi)能檢測到更多的EVs顆粒；而針對(duì)粒徑大于150 nm的EVs，檢測結(jié)果正好相反。近期，Bachurski等［9］對(duì)比了NanoSight NS300和ZetaView兩款不同生產(chǎn)廠家的NTA儀器在EVs粒徑分布和濃度表征方面的優(yōu)劣。其中，NanoSight NS300使用更高倍數(shù)的物鏡對(duì)EVs進(jìn)行示蹤分析，測得的顆粒粒徑分布具有更高的分辨率；而ZetaView可以對(duì)樣品池內(nèi)11個(gè)不同平面的顆粒進(jìn)行偵測，能夠獲得更準(zhǔn)確的EVs濃度信息。

2 EVs蛋白、核酸、脂質(zhì)等生物分子的表征技術(shù)

2.1 拉曼光譜技術(shù)

激光光鑷?yán)庾V技術(shù)（Laser tweezers Raman spectroscopy，LTRS）在拉曼散射光譜的基礎(chǔ)上引入激光光鑷技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)單個(gè)EVs的光學(xué)捕獲并對(duì)其蛋白、核酸、脂質(zhì)等生物分子進(jìn)行無標(biāo)記的定性或定量表征［18-20］。2015年，Smith等［19］使用LTRS對(duì)肺癌細(xì)胞上清來源的EVs進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)EVs的異質(zhì)性主要源于磷脂和膽固醇的相對(duì)含量及總蛋白含量的差異，并根據(jù)磷脂和膽固醇的相對(duì)含量成功區(qū)分出正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的EVs。但是，LTRS技術(shù)存在檢測通量低、靈敏度不足等缺點(diǎn)。為此，Penders等［21］開發(fā)了單顆粒拉曼光譜自動(dòng)化分析平臺(tái)（Single particle automated Raman trapping analysis，SPARTA）（圖1），顯著提升了檢測通量，并成功區(qū)分了11種乳腺癌細(xì)胞系的EVs，其靈敏度與特異度均高于95%［22］。而Stremersch等［23］則將表面增強(qiáng)拉曼光譜（Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）應(yīng)用于EVs的檢測，通過靜電吸附作用將金納米顆粒包覆在EVs表面來增強(qiáng)單個(gè)EVs的拉曼散射信號(hào)，可將混合樣品中黑色素瘤來源的EVs與紅細(xì)胞分泌的EVs區(qū)分開來。但拉曼散射光譜技術(shù)存在所需EVs用量高的缺點(diǎn)，限制了其在臨床上的應(yīng)用。

圖1 單顆粒拉曼光譜自動(dòng)化分析平臺(tái)（SPARTA）原理圖［21］Fig．1 The scheme of SPARTA［21］

2.2 表面等離子體共振技術(shù)

SPR技術(shù)可對(duì)生物分子間的相互作用進(jìn)行無標(biāo)記實(shí)時(shí)檢測，近年來逐漸應(yīng)用于EVs蛋白［24-28］、核酸［29］等的分析表征中。2017年，Liang等［25］開發(fā)的納米等離子體增強(qiáng)散射平臺(tái)（Nanoplasmon-enhanced scattering，nPES）在單顆粒水平實(shí)現(xiàn)了對(duì)血漿EVs的蛋白表征。研究人員分別使用金納米棒和金納米球修飾的CD63和EphA2抗體標(biāo)記EVs，當(dāng)EVs同時(shí)存在這兩種蛋白時(shí)，金納米顆粒的相互靠近會(huì)造成散射光譜的位移及強(qiáng)度變化，由此實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)EVs表面CD63和EphA2蛋白分子的定量檢測。該平臺(tái)只需使用1 μL的血漿樣本便可實(shí)現(xiàn)健康人、胰腺癌病人與胰腺炎病人的良好區(qū)分，大大拓展了SPR技術(shù)在臨床診斷上的應(yīng)用。

2.3 干涉相關(guān)顯微成像技術(shù)

干涉相關(guān)顯微成像技術(shù)是基于光的干涉原理對(duì)納米顆粒進(jìn)行成像的技術(shù)，包括基于激光的干涉散射顯微成像技術(shù)（Interferometric scattering microscopy，iSCAT）［14］和干涉反射成像技術(shù)（Interferometric reflectance imaging sensing，IRIS）。其中，iSCAT通過采集激光光源與納米顆粒瑞利散射光的干涉信號(hào)進(jìn)行成像，需要精良的光學(xué)元件和嚴(yán)苛的實(shí)驗(yàn)條件。而IRIS則是基于基底與納米顆粒來源的兩束反射光的干涉信號(hào)實(shí)現(xiàn)納米顆粒的實(shí)時(shí)成像，易于實(shí)施，更常應(yīng)用于生物領(lǐng)域的研究中。

Daaboul等發(fā)展的單顆粒干涉反射成像傳感技術(shù)（Single particle interferometric reflectance imaging sensing，SP-IRIS）已成功應(yīng)用于單個(gè)病毒［30］、EVs［31］等納米顆粒的粒徑和濃度表征分析（圖2A）。2018年，美國NanoView Biosciences推出了全自動(dòng)化外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)——ExoView，其利用熒光模式的SP-IRIS平臺(tái)實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)EVs上多種蛋白的熒光共定位分析（圖2B）［32-38］。Jiang等［36］對(duì)細(xì)菌進(jìn)行工程化改造，在細(xì)菌外膜囊泡（Outer membrane vesicles，OMVs）表面修飾上D001、D003或MM43三種新冠病毒S蛋白，利用ExoView對(duì)OMVs進(jìn)行蛋白表征和濃度定量分析，為新冠疫苗的開發(fā)與研制提供了全新的研究思路。近期，Gebara等［37］將ExoView和超分辨熒光顯微鏡技術(shù)聯(lián)用，對(duì)羊水來源EVs的分析結(jié)果表明CD105+EVs可作為先兆子癇疾病的標(biāo)志物。盡管如此，Arab等［35］通過對(duì)比ExoView、NTA、TRPS和納米流式檢測技術(shù)（Nanoflow cytometry，NFCM）4種單顆粒表征技術(shù)在EVs濃度、粒徑和蛋白含量方面的表征能力，指出SP-IRIS并無法對(duì)EVs濃度進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。

圖2 單顆粒干涉反射成像傳感技術(shù)（SP-IRIS）原理圖［31］（A）；ExoView平臺(tái)對(duì)單個(gè)EVs上CD63、CD81和CD9蛋白的分析流程圖［38］（B）Fig．2 The scheme of SP-IRIS system［31］（A）；the scheme of ExoView platform for single-EV phenotyping［38］（B）

2.4 單分子熒光顯微成像技術(shù)

2.4.1 全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)熒光顯微成像技術(shù)是探索EVs分泌途徑、轉(zhuǎn)運(yùn)過程和攝取機(jī)制最常用的研究工具之一，該技術(shù)常與微流控芯片聯(lián)用以實(shí)現(xiàn)EVs的高通量檢測［39-41］。其中，全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)（Total internal reflection fluorescence microscopy，TIRF）是最常應(yīng)用于EVs蛋白［27，42-43］和核酸［27，44］表征的單分子熒光成像技術(shù)。在蛋白表征方面，東南大學(xué)崔一平教授團(tuán)隊(duì)［43］聯(lián)合TIRF平臺(tái)和DNA點(diǎn)積累納米級(jí)拓?fù)涑上窦夹g(shù)（DNA points accumulation for imaging in nanoscale topography，DNAPAINT）實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)EVs上HER2、GPC-1、EpCAM和EGFR的同時(shí)檢測（圖3A）。在該技術(shù)中，成像鏈和對(duì)接鏈瞬時(shí)雜交和解離過程伴隨著熒光“閃爍”現(xiàn)象。鑒于方程N(yùn)umber of proteins=（kon×ci×τd）-1中解離常數(shù)kon與成像鏈的濃度ci為固定值，因此單個(gè)EVs上蛋白的數(shù)量與TIRF成像儀記錄下的熒光壽命的倒數(shù)τd-1呈現(xiàn)正相關(guān)，據(jù)此可計(jì)算出單個(gè)EVs特定蛋白的拷貝數(shù)。結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)算法，研究人員進(jìn)一步將該技術(shù)應(yīng)用于胰腺癌和乳腺癌樣本的分型檢測，其準(zhǔn)確度高達(dá)100%。在核酸表征方面，He等［44］利用TIRF實(shí)現(xiàn)了單個(gè)EVs中miR-21的原位表征。如圖3B所示，其檢測原理為：miR-21分子信標(biāo)上的DNAzyme序列（D1、D2）在Mg2+激活下發(fā)揮酶切割功能，將分子信標(biāo)切割并釋放出熒光基團(tuán)，從而被TIRF檢測。此研究揭示癌癥病人血清EVs的miR-21水平可用于腫瘤檢測和治療預(yù)后分析。最近，Zhou等［45］開發(fā)的高通量納米生物芯片集成系統(tǒng)液體活檢技術(shù)（High-throughput nano-bio chip integrated system for liquid biopsy，HNCIB）則在TIRF成像平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)了EVs表面蛋白和內(nèi)部mRNA/miRNA的同時(shí)表征。在臨床樣本分析中，通過對(duì)血漿EVs的PD-L1、PD-L1 mRNA和miR-21進(jìn)行檢測，實(shí)現(xiàn)了肺癌患者與健康人的良好區(qū)分。該技術(shù)有望在臨床應(yīng)用中提供更全面的EVs表型信息，提高疾病診斷和治療預(yù)后的準(zhǔn)確性。

圖3 DNA-PAINT對(duì)EVs膜蛋白的表征原理圖［43］（A）；基于TIRF成像技術(shù)對(duì)單個(gè)EVs內(nèi)miRNA的定量檢測［44］（B）Fig．3 The principle of DNA-PAINT for exosomal surface biomarker profiling［43］（A）；the scheme of miRNA analysis in single EVs based on TIRF imaging system［44］（B）

2.4.2 其他超分辨熒光顯微技術(shù)除了TIRF技術(shù)，直接隨機(jī)光學(xué)重組顯微技術(shù)（Direct stochastic optical reconstruction microscopy，d-STORM）［46-47］、光激活定位顯微鏡技術(shù)（Photoactivation localization microscopy，PALM）［47］和熒光壽命成像技術(shù)（Fluorescence lifetime imaging microscopy，F(xiàn)LIM）［48］均已成功實(shí)現(xiàn)了EVs的單分子熒光成像。近期，McNamara等［49］利用d-STORM成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)EVs的三維立體表征，為探究單個(gè)EVs的蛋白微結(jié)構(gòu)域等精細(xì)結(jié)構(gòu)提供了重要的技術(shù)保障。Wong等［50］則基于FLIM和熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理（F?rster resonance energy transfer，F(xiàn)RET）對(duì)肺癌細(xì)胞EVs上人表皮生長因子受體（Human epidermal growth factor receptor，HER）的二聚化進(jìn)行表征，認(rèn)為HER受體的二聚狀態(tài)比其本底表達(dá)水平可能提供更有價(jià)值的診斷與預(yù)后信息。盡管上述超分辨熒光顯微技術(shù)對(duì)EVs分泌與攝取機(jī)制的探索和EVs精細(xì)蛋白結(jié)構(gòu)的表征起到了重要推動(dòng)作用，但是它們往往需要配備精良的儀器設(shè)備和強(qiáng)大的數(shù)據(jù)處理軟件，且無法實(shí)現(xiàn)對(duì)EVs濃度、粒徑等的快速表征。

2.5 數(shù)字化方法

2.5.1 微液滴數(shù)字化方法微液滴數(shù)字化方法（Droplet digital analysis，DDS）是新近發(fā)展起來的可在單顆粒水平對(duì)EVs蛋白、核酸進(jìn)行絕對(duì)定量的表征技術(shù)。其原理是利用液滴微流控技術(shù)將EVs隨機(jī)分配到大量相互獨(dú)立的微液滴中，每個(gè)液滴中最多包含一個(gè)EVs，相當(dāng)于一個(gè)獨(dú)立的微型反應(yīng)器。例如，南方醫(yī)科大學(xué)鄭磊教授課題組與合作者［51］開發(fā)的微液滴數(shù)字化檢測平臺(tái)ExoELISA，基于ELISA原理實(shí)現(xiàn)了對(duì)微液滴中單個(gè)EVs的GPC1的表征，通過對(duì)GPC1+EVs濃度的絕對(duì)定量，實(shí)現(xiàn)了乳腺癌的早期診斷。廈門大學(xué)楊朝勇教授課題組［52］發(fā)展的雙適體近距離誘導(dǎo)微液滴數(shù)字PCR技術(shù)（A dual-target-specific aptamer recognition activated in situ connection system on exosome membrane combined with droplet digital PCR，TRACER）實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤來源（EpCAM+）的PD-L1+EVs的絕對(duì)定量分析。只有當(dāng)EVs上同時(shí)具有EpCAM與PD-L1時(shí)，兩條適體探針才能與同一條連接探針雜交并顯示熒光。TRACER相比單一靶標(biāo)識(shí)別策略具有更高的特異性，可實(shí)現(xiàn)胰腺癌癥患者和健康志愿者的100%區(qū)分。近期，Yang等［53］發(fā)展的集微液滴的產(chǎn)生、處理和分析于一體的液滴光流控平臺(tái)（A droplet-based optifluidic platform）將檢測通量提升至傳統(tǒng)液滴微流控技術(shù)的100倍以上，每分鐘約生成2 000萬個(gè)微液滴，將EVs的檢測限推進(jìn)至9 EVs/μL。該技術(shù)有望對(duì)復(fù)雜環(huán)境中的稀有EVs亞群進(jìn)行準(zhǔn)確定量，展現(xiàn)了其在疾病診斷和預(yù)后上的臨床應(yīng)用潛力。

2.5.2 鄰近編碼技術(shù)除此之外，鄰近編碼技術(shù)（Proximity barcoding assay，PBA）［54］是新近發(fā)展的可實(shí)現(xiàn)單個(gè)EVs上多種蛋白同時(shí)表征的數(shù)字化方法。其原理如圖4所示，該技術(shù)首先在每種抗體上偶連上不同的DNA編碼標(biāo)簽（proteinTags）（圖4A），在與EVs孵育后，加入粒徑與EVs接近、具有隨機(jī)重復(fù)序列（complexTags）的RCA（Rolling circle amplification）產(chǎn)物（圖4B）。RCA產(chǎn)物與EVs單一匹配，經(jīng)過酶聯(lián)雜交反應(yīng)與PCR擴(kuò)增后，利用新一代測序技術(shù)解析DNA序列中包含的蛋白信息（圖4C）。因?yàn)槊總€(gè)EVs均有其獨(dú)特的complexTags，再結(jié)合proteinTags序列信息便可轉(zhuǎn)化為單個(gè)EVs的蛋白信息。該方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)EVs上超過30種蛋白分子的同時(shí)表征，具有十分重要的臨床應(yīng)用前景。

圖4 鄰近編碼技術(shù)（PBA）檢測原理圖［54］：PBA探針的制備過程（A）；RCA產(chǎn)物的制備過程（B）；EVs膜蛋白的表征流程（C）Fig．4 Scheme of PBA on single EV analysis［54］：preparation of PBA probes（A）；preparation of RCA products（B）；the profiling processes of surface proteins on single EVs by PBA（C）

2.6 流式細(xì)胞術(shù)

前文所述的EVs單顆粒分析技術(shù)或?qū)Vs的生物物理性狀進(jìn)行表征，或?qū)ζ渖锘瘜W(xué)性狀進(jìn)行檢測，均難以實(shí)現(xiàn)單個(gè)EVs多種物理、生化性狀的同時(shí)、快速分析。FCM是一種可以對(duì)懸液中的細(xì)胞或細(xì)胞大小的顆粒進(jìn)行快速定性、定量分析或分選的先進(jìn)技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于EVs的單顆粒多參數(shù)定量檢測［46，55-58］。其中，散射光反映了EVs的粒徑或顆粒度信息，而多色熒光標(biāo)記則可實(shí)現(xiàn)EVs蛋白、核酸、脂質(zhì)等生物分子的檢測。Cryo-TEM、TEM和AFM的表征結(jié)果均表明絕大部分的EVs粒徑分布在300 nm以下［59］。van der Pol等［60］對(duì)各種商品化流式細(xì)胞儀可檢測到的EVs粒徑范圍進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明僅有少數(shù)高靈敏度的流式細(xì)胞儀（Apogee A50-Micro、BD Calibur、BD LSRII和BD influx）可實(shí)現(xiàn)粒徑小于300~600 nm的EVs的檢測。這說明，使用流式細(xì)胞儀對(duì)EVs進(jìn)行分析時(shí)，占絕大多數(shù)的小粒徑EVs的散射光信號(hào)會(huì)淹沒在背景信號(hào)中。

2.6.1 基于熒光標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)在流式檢測中，熒光背景常常低于散射光背景，熒光觸發(fā)相較于散射觸發(fā)具有更高的信噪比。因此，研究者們常常利用脂膜染料或免疫熒光抗體對(duì)EVs進(jìn)行標(biāo)記，以熒光信號(hào)作為觸發(fā)信號(hào)，將EVs與背景信號(hào)區(qū)分開來。van der Vlist等［55］對(duì)高端流式細(xì)胞儀（BD influx flow cytometer）進(jìn)行改造以提升儀器靈敏度，利用PKH67脂膜探針或偶聯(lián)藻紅蛋白（Phycoerythrin，PE）的抗體標(biāo)記EVs，實(shí)現(xiàn)了對(duì)粒徑約為100 nm的單個(gè)EVs的蛋白檢測。2016年，Higginbotham等［46］將分選型流式細(xì)胞儀（BD FACSAria IIIu）與STORM成像技術(shù)聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)粒徑低至100 nm的EVs的分析表征，指出表達(dá)EGFR及其配體AREG的EVs有望成為結(jié)直腸癌早期診斷的有效標(biāo)志物。2019年，Ricklefs等［61］開發(fā)的成像型流式細(xì)胞檢測技術(shù)（Imaging flow cytometry，IFCM）則將流式細(xì)胞術(shù)與熒光顯微鏡相結(jié)合，不僅具有FCM快速、多參數(shù)定量的優(yōu)勢，也具有熒光顯微鏡的可視化檢測功能，實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)EVs上CD9、CD63和CD81的多參數(shù)定量表征。

2.6.2 基于信號(hào)放大的流式細(xì)胞術(shù)盡管基于熒光觸發(fā)的流式檢測方案提高了FCM對(duì)EVs的檢測能力，但目前研究者們尚未發(fā)現(xiàn)一種可以實(shí)現(xiàn)樣本中所有EVs選擇性標(biāo)記的普適性熒光探針。其次，隨著EVs粒徑的減小，顆粒的表面積和內(nèi)容物的數(shù)量均會(huì)呈指數(shù)級(jí)下降，這導(dǎo)致以上策略無法實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)EVs的低拷貝蛋白、核酸等的定量分析。為了解決上述問題，Shen等［62］建立了基于信號(hào)放大的流式檢測方案，其原理如圖5所示：采用核酸適配體識(shí)別EVs表面的特異性抗原，以該適配體觸發(fā)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Hybridization chain reaction，HCR），形成的DNA納米結(jié)構(gòu)不僅將單個(gè)EVs的粒徑擴(kuò)大到500 nm，也可結(jié)合大量的熒光探針，實(shí)現(xiàn)單個(gè)EVs散射信號(hào)和熒光信號(hào)的同時(shí)放大?；诖?，研究人員成功區(qū)分了不同乳腺癌細(xì)胞來源的EVs，進(jìn)一步提高了傳統(tǒng)FCM對(duì)EVs的單顆粒檢測能力。然而，該法所需EVs濃度較高（11012particle/mL）、擴(kuò)增流程耗時(shí)較長（＞8 h），難以應(yīng)用于臨床研究中。

圖5 基于靶標(biāo)引發(fā)的DNA納米結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)單個(gè)EVs分析的流式檢測原理［62］Fig．5 The scheme of single EV flow cytometry approach enabled by target-initiated engineering of DNA nanostructures［62］

2.6.3 納米流式檢測技術(shù)為了從根本上解決傳統(tǒng)FCM由于靈敏度限制，難以對(duì)粒徑小于200 nm的生物納米顆粒進(jìn)行檢測的瓶頸問題，廈門大學(xué)顏曉梅教授課題組將瑞利光散射與鞘流單分子熒光檢測技術(shù)相結(jié)合，于2009年成功研發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的納米流式檢測裝置（Nano-flow cytometer，nFCM）（圖6A），將散射檢測靈敏度較傳統(tǒng)FCM提升了4~6個(gè)數(shù)量級(jí)，熒光檢測靈敏度提升了1~2個(gè)數(shù)量級(jí)［63-64］，實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞上清［65-66］、血漿［65-67］、尿液［68］、淚液［69］等體液和細(xì)菌［70］、牛奶［71］等來源的EVs的單顆粒多參數(shù)定量表征。2018年，Tian等［65］利用nFCM首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)粒徑低至40 nm的單個(gè)EVs的多參數(shù)定量分析。nFCM的分析速率高達(dá)每分鐘10 000個(gè)顆粒，僅需幾分鐘便可獲得具有高度統(tǒng)計(jì)代表性的EVs粒徑分布，其分辨率和準(zhǔn)確性媲美Cryo-TEM（圖6B）。在蛋白表征方面，結(jié)合免疫熒光標(biāo)記技術(shù)，nFCM可以快速表征表達(dá)特定蛋白的EVs亞群在總體EVs中的精確占比，并可實(shí)現(xiàn)單個(gè)EVs上特定蛋白拷貝數(shù)的準(zhǔn)確定量（圖6C）。在臨床樣本分析中，通過對(duì)血漿中CD147+EVs的濃度測定，實(shí)現(xiàn)了結(jié)直腸癌的早期診斷和預(yù)后分析。2020年，Tian等［67］使用多種分離純化方法對(duì)血漿EVs進(jìn)行純化，并利用nFCM對(duì)其純化效果進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果顯示，與超速離心法相比，EVs提取試劑盒可將血漿中大量的非囊泡組分共分離，雖然樣本顆粒濃度高出2~4個(gè)數(shù)量級(jí)，但純度卻低得多。近期，Liu等［66］使用核酸染料標(biāo)記EV-DNA，首次在單顆粒水平揭示了DNA在不同粒徑的EVs亞群上的分布情況。Chen等則基于nFCM的單顆粒檢測優(yōu)勢，對(duì)EVs上偶聯(lián)的靶向配體的修飾效果［71］和不同載藥策略的藥物封裝效率［72］進(jìn)行了綜合評(píng)估。

圖6 nFCM對(duì)EVs的粒徑分布與表面蛋白的單顆粒水平表征［65］Fig．6 Characterization of particle size and surface protein of EVs at the single-particle level via nFCM［65］

nFCM在EVs的多種理化性質(zhì)的表征中均展現(xiàn)了突出優(yōu)勢，由該技術(shù)轉(zhuǎn)化的商品化納米流式檢測儀Flow NanoAnalyzer已銷售至全球頂尖的科研院所與醫(yī)療單位，應(yīng)用于EVs的基礎(chǔ)研究、臨床診斷與藥物開發(fā)。如美國梅奧診所王海龍教授課題組［73］利用nFCM對(duì)不同電刺激條件下大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的AQP4+EVs的濃度、粒徑進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)胞外電刺激可調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞EVs的釋放及內(nèi)含物組成，推進(jìn)了EVs在帕金森綜合征等神經(jīng)退行性疾病中的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。近期，南方醫(yī)科大學(xué)鄭磊教授課題組［74］基于DNA納米線誘導(dǎo)的核酸放大技術(shù)，利用nFCM在單顆粒水平實(shí)現(xiàn)了對(duì)乳腺癌細(xì)胞系來源的EVs中miR-1246的定量檢測，體現(xiàn)了nFCM在EV miRNA研究中的潛在應(yīng)用價(jià)值。2020年，美國Codiak BioScience公司［75］利用nFCM在單顆粒水平對(duì)EVs蛋白的表征優(yōu)勢，發(fā)現(xiàn)PTGFRN蛋白是其他蛋白融合表達(dá)的最佳選擇，成功研制出全球首個(gè)外泌體候選藥物exoIL-12并投入臨床I期試驗(yàn)，大大加速了EVs的臨床應(yīng)用進(jìn)程。

3 總結(jié)與展望

EVs作為一種攜載豐富分子信息的新型生物標(biāo)志物，廣泛分布于各種體液中，在臨床疾病診斷和治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，EVs的粒徑及其攜載的蛋白、核酸、脂質(zhì)等“貨物分子”存在高度的個(gè)體差異性和多樣性。因此，越來越多的新型單顆粒分析技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，為精準(zhǔn)揭示EVs的個(gè)體差異、鑒定EVs的來源與生物學(xué)功能提供了重要的技術(shù)支撐。但是，這些SVA技術(shù)對(duì)EVs濃度、粒徑及生物分子組成的表征能力不盡相同，且缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)操作指南，因此目前仍需要聯(lián)合多種SVA技術(shù)以實(shí)現(xiàn)EVs各種理化性質(zhì)的全面表征。未來，SVA技術(shù)仍需要在以下兩個(gè)方面進(jìn)一步發(fā)展：第一，發(fā)展更加高靈敏、高通量的技術(shù)與方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)EVs的快速、高分辨表征；第二，發(fā)展自動(dòng)、便捷、微型化的綜合型分析平臺(tái)，以推進(jìn)EVs的臨床應(yīng)用進(jìn)程。我們相信，SVA技術(shù)的創(chuàng)新必將加速推動(dòng)EVs分泌和分選機(jī)制的研究、基于EVs的臨床診斷標(biāo)志物的篩選和新型納米藥物的研發(fā)，在生命科學(xué)領(lǐng)域畫下濃墨重彩的一筆！