單細(xì)胞與空間轉(zhuǎn)錄組分析研究進(jìn)展

許 醒，蔡林峰，張倩楠，楊啟正，梁珊珊，李銘殷，李 翀，楊朝勇，2*

（1．廈門大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門 361005；2．上海交通大學(xué) 分子醫(yī)學(xué)研究院，上海 200217）

17世紀(jì)中葉，荷蘭顯微鏡學(xué)家列文虎克與英國科學(xué)家胡克發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞，揭開了生命體基本單位—細(xì)胞的面紗。由于細(xì)胞增殖、分化和代謝等過程受到細(xì)胞內(nèi)在生命活動(dòng)以及周圍微環(huán)境的影響，不同細(xì)胞在細(xì)胞大小、化學(xué)組成、生物活性、生理響應(yīng)對象以及響應(yīng)時(shí)間等方面存在異質(zhì)性。為了解碼各種類型細(xì)胞的身份、特征和功能狀態(tài)，單細(xì)胞分析應(yīng)運(yùn)而生，其通過對單個(gè)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)分析，從而了解不同組織、器官及生命體的特征，探究不同生命活動(dòng)的發(fā)生過程。單細(xì)胞測序是單細(xì)胞分析中的重要組成部分，其以細(xì)胞內(nèi)的RNA、DNA等核酸分子作為研究對象，利用測序技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)與序列解析，為細(xì)胞異質(zhì)性研究提供可靠、準(zhǔn)確的研究手段及觀測視野，為揭示生物發(fā)育規(guī)律、疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制等提供了重要的技術(shù)手段［1-2］。2019年，“單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)”被Nature Methods評為年度技術(shù)方法；2020年，“空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)”被Nature Methods評為年度技術(shù)方法；2022年，空間多組學(xué)被Nature評為值得關(guān)注的七大技術(shù)之一。至此，單細(xì)胞測序分析朝著多維度、空間化方向發(fā)展。本文將圍繞單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組分析，系統(tǒng)討論近幾年單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序、單細(xì)胞多組學(xué)測序及空間轉(zhuǎn)錄組分析的研究進(jìn)展，并總結(jié)及展望其未來的發(fā)展方向。

1 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq）通過對單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的RNA（~10 pg）進(jìn)行提取及文庫制備，利用高通量測序技術(shù)讀取文庫序列獲得全轉(zhuǎn)錄本信息，以辨別細(xì)胞類型、狀態(tài)與功能，闡明細(xì)胞異質(zhì)性及進(jìn)化軌跡等。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序靶標(biāo)檢測通量高，理論上可實(shí)現(xiàn)對單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組的同時(shí)測量，提高了對單細(xì)胞異質(zhì)性的辨別能力；同時(shí)，轉(zhuǎn)錄組不僅繼承了基因組的遺傳信息，還反映了細(xì)胞基因選擇性表達(dá)的詳細(xì)情況，細(xì)胞分型準(zhǔn)確性高。目前，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序已在腫瘤生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、微生物學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域的研究中得到廣泛應(yīng)用［3-6］。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序主要流程包括單細(xì)胞的分離、單個(gè)細(xì)胞核酸的提取、微量核酸的擴(kuò)增與建庫等。根據(jù)文庫類型差異分為基于全長轉(zhuǎn)錄組的文庫構(gòu)建法和基于標(biāo)簽轉(zhuǎn)錄組的文庫構(gòu)建法。

1.1 基于全長轉(zhuǎn)錄組的文庫構(gòu)建法

該文庫構(gòu)建方法針對全長轉(zhuǎn)錄組，對基因、單核苷酸多態(tài)性、可變剪切體具有高檢測能力，并易于定位來源細(xì)胞。2009年，湯富酬課題組首次報(bào)道了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序方法［7］。該方法利用末端轉(zhuǎn)移酶將poly（A）短鏈添加至逆轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA上，再通過雜交錨定有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）引物的poly（T）短鏈完成第二鏈合成，進(jìn)而進(jìn)行PCR擴(kuò)增，首次實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞維度的基因表達(dá)異質(zhì)性研究。Sandberg課題組于2014年發(fā)展的Smart-seq2技術(shù)是目前應(yīng)用最廣的單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)之一。其利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶同時(shí)具有模板轉(zhuǎn)化與末端轉(zhuǎn)移酶活性的特點(diǎn)，在cDNA合成至3′端時(shí)在其尾部添加一段特殊序列并以此作為引物序列實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增［8］。該課題組于2020年提出了Smart-seq3技術(shù)，在cDNA合成過程中引入獨(dú)特分子標(biāo)記（UMI），通過校正擴(kuò)增偏差實(shí)現(xiàn)了對RNA的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，提高了基因檢出的靈敏度與準(zhǔn)確度［9］。

然而，以上基于離心管的建庫方式存在細(xì)胞挑取困難，試劑消耗大，核酸反應(yīng)效率低等問題。與之相比，微流控技術(shù)可提供pL至nL級反應(yīng)體系，與單細(xì)胞尺寸相匹配，在提高模板反應(yīng)濃度的同時(shí)減少了試劑消耗量，具有高轉(zhuǎn)錄本檢出能力及低成本的優(yōu)勢［10-11］。黃巖誼課題組開發(fā)了一種集成式微流控芯片用于全長scRNA-seq分析，提高了基因表達(dá)測量的準(zhǔn)確性和靈敏度［12］。商業(yè)化平臺(tái)Fluidigm C1系統(tǒng)使用了類似的設(shè)計(jì)，兼容Smart-seq2等文庫構(gòu)建方式［13］。Sarma等［14］設(shè)計(jì)了一種通過濃度梯度驅(qū)動(dòng)引起流體擴(kuò)散進(jìn)行試劑去除和輸送的微流控平臺(tái)，可在同一個(gè)腔室中完成Smart-seq2全步驟。然而，以上平臺(tái)使用泵/閥結(jié)構(gòu)控制流體運(yùn)動(dòng)，需要復(fù)雜的芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與制作工藝。為了簡化微流控芯片的設(shè)計(jì)、制作與操控，增加平臺(tái)的普適性，本課題組基于具有離散液滴操控功能的數(shù)字微流控芯片結(jié)合Smart-seq2技術(shù)，構(gòu)筑了自動(dòng)化單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序平臺(tái)（Digital-RNA-seq，圖1A），實(shí)現(xiàn)了快速、高效、靈敏及準(zhǔn)確的單細(xì)胞RNA檢測［15］。Digital-RNA-seq通過在芯片上構(gòu)筑親-疏水特征結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞的快速、高效和無損分離；采用納升級反應(yīng)體系及疏水界面增加模板的反應(yīng)濃度，減少核酸吸附，實(shí)現(xiàn)了高靈敏的基因檢測；借助均勻的液滴生成和油相隔離的反應(yīng)空間減少加樣偏差及外源污染，提高了測量的準(zhǔn)確性。相比傳統(tǒng)離心管方法，該平臺(tái)減少了近百倍的試劑消耗量，實(shí)現(xiàn)了低成本的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析。在此基礎(chǔ)上，本課題組進(jìn)一步將文庫純化、文庫構(gòu)建等部分集成，實(shí)現(xiàn)了“細(xì)胞進(jìn)，文庫出”的一體化操作（Cilo-seq），將文庫檢出率提高了1．4倍［16］。

圖1 基于數(shù)字微流控的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（digital-RNA-seq）［15］（A）；基于配對微流控芯片的高通量單細(xì)胞測序（paired-seq）［25］（B）Fig．1 Single-cell transcriptome sequencing based on digital microfluidics（digital-RNA-seq）［15］（A）；high-throughput single-cell sequencing based on paired microfluidic chip（paired-seq）［25］（B）

1.2 基于標(biāo)簽轉(zhuǎn)錄組的文庫構(gòu)建法

該文庫構(gòu)建方法主要通過在轉(zhuǎn)錄本一端添加標(biāo)簽標(biāo)記細(xì)胞來源，從而允許高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組平行分析。Yanai課題組于2016年推出CEL-Seq2技術(shù)，利用隨機(jī)寡核苷酸鏈在逆轉(zhuǎn)錄步驟為每個(gè)單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本標(biāo)記上獨(dú)一無二的細(xì)胞編碼與分子編碼，由此可在后續(xù)擴(kuò)增過程中將上千個(gè)細(xì)胞的核酸在同一個(gè)反應(yīng)池中進(jìn)行反應(yīng)，大大降低了人力、試劑與測序成本，使單個(gè)測序文庫包含大量單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組信息［17］。為了進(jìn)一步提高單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析通量，Macosko課題組和Weitz課題組分別發(fā)展了Drop-Seq與Indrops技術(shù)，基于攜帶有細(xì)胞編碼與分子編碼的編碼微球，利用液滴微流控芯片在短時(shí)間內(nèi)生成大量油包水液滴，同時(shí)將單個(gè)細(xì)胞與單個(gè)微球包裹于同一微液滴中，以此實(shí)現(xiàn)高通量單細(xì)胞的快速分離及對應(yīng)轉(zhuǎn)錄組信息的標(biāo)記［18-19］。Shalek課題組和郭國驥課題組將該技術(shù)拓展至微陣列體系中，分別開發(fā)了Seq-Well和Microwell-seq平臺(tái)，在微孔中實(shí)現(xiàn)了單個(gè)細(xì)胞與微球的配對、mRNA捕獲、編碼及逆轉(zhuǎn)錄，通過測序技術(shù)，獲得了成千上萬個(gè)單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)信息［20-21］。此類方法極大提高了單細(xì)胞的分析通量，進(jìn)一步降低了試劑用量和分析成本，推動(dòng)了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，如10×Genomics公司的ChromiumTM液滴微流控平臺(tái)、BD公司推出的RhapsodyTMSingle-Cell Analysis System等。然而，大多數(shù)方法由于單細(xì)胞和編碼微球的包裹基于泊松分布，許多細(xì)胞無法與微球成功配對從而造成信息丟失，導(dǎo)致細(xì)胞利用率偏低。

為了克服泊松分布，樊榮課題組開發(fā)了一種集成的介電電泳（DEP）-捕獲-納微孔轉(zhuǎn)移方法（dTNT），通過DEP輔助捕獲細(xì)胞于微陣列中（捕獲效率達(dá)91．84%），然后將整個(gè)裝置翻轉(zhuǎn)并改變DEP的方向，使捕獲于DEP陣列中的單細(xì)胞落入與其對應(yīng)的大孔徑微陣列中（細(xì)胞轉(zhuǎn)移效率為82%），以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞與單微球在微孔中的高效配對［22］?；诒瞄y控制結(jié)構(gòu)的微流控芯片提供了另一種提高細(xì)胞利用率的方法，可實(shí)現(xiàn)稀有樣本包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞、腸類器官的單細(xì)胞分析［23-24］。本課題組開發(fā)了Paired-seq技術(shù)（圖1B），通過發(fā)展基于差異流阻原理的單細(xì)胞/單微珠操控微流控芯片，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞/單微球的高效快速捕獲，成功突破了因泊松分布導(dǎo)致的細(xì)胞利用率低的限制，在稀有細(xì)胞分析方面具有明顯優(yōu)勢（細(xì)胞利用率＞95%）；同時(shí)Paired-seq利用泵閥操控結(jié)構(gòu)移除游離RNA以降低背景干擾，并通過皮升級反應(yīng)腔體增加單細(xì)胞mRNA的捕獲能力，大大提高了轉(zhuǎn)錄組的基因檢出效率［25］。Paired-seq的分析通量在千級水平，為了提高樣品分析通量，本課題組進(jìn)一步發(fā)展了一種協(xié)同尺寸排阻和局部準(zhǔn)靜態(tài)動(dòng)力學(xué)的雙層微孔芯片平臺(tái)（Well-Paired-seq），用于超高通量的scRNA-seq分析，一個(gè)芯片可以分析超過10萬個(gè)細(xì)胞。通過尺寸排阻原理允許在細(xì)胞捕獲微孔和微球捕獲微孔分別捕獲一個(gè)細(xì)胞和一個(gè)微球，并通過準(zhǔn)靜態(tài)流體力學(xué)原理確保被捕獲的細(xì)胞不被沖洗出去，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的累積捕獲和有效的緩沖交換［26］。Well-Paired-seq保證了高密度的單細(xì)胞/微球配對，實(shí)現(xiàn)了優(yōu)異的細(xì)胞捕獲效率（~91%）、細(xì)胞/微球配對效率（~82%）和細(xì)胞游離RNA去除效率。Well-Paired-seq的超高通量分析能力、高效細(xì)胞捕獲效率和高游離RNA去除效率等優(yōu)勢在細(xì)胞圖譜繪制、細(xì)胞異質(zhì)性分析、稀有細(xì)胞亞群分析中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

細(xì)胞原位編碼技術(shù)是另一類基于標(biāo)簽轉(zhuǎn)錄組的文庫構(gòu)建技術(shù)。該方法無需利用微液滴及微陣列對細(xì)胞進(jìn)行分隔，而是將細(xì)胞本身作為單獨(dú)的反應(yīng)器。同時(shí)，該方法無需使用編碼微球，通過組合拆分方法即可對大量單細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞及分子編碼。Shendure課題組和Seelig課題組將大量細(xì)胞分配至96或384孔板中，利用含有編碼序列的引物對cDNA進(jìn)行標(biāo)記，其后將所有細(xì)胞回收并重新分配至含有新編碼序列的引物的96或384孔板中，對cDNA進(jìn)行下一輪標(biāo)記，然后重復(fù)組合-拆分過程［27-28］。此時(shí)，編碼容量隨著組合-拆分次數(shù)的增加呈指數(shù)型增長。因此，該方法的細(xì)胞分析通量極大，但由于需要不斷地進(jìn)行拆分混合操作，文庫構(gòu)建存在繁瑣性與復(fù)雜性。近期，Bock課題組將細(xì)胞原位編碼技術(shù)與液滴微流控技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)了單細(xì)胞組合流體索引技術(shù)scifi-RNA-seq［29］。該方法通過在384孔板中將透化的細(xì)胞（核）隨機(jī)等分，使用孔板中的預(yù)標(biāo)第一輪條形碼實(shí)現(xiàn)cDNA的合成與標(biāo)記。然后，將含有預(yù)索引cDNA的細(xì)胞（核）隨機(jī)混合，使用具有高度過載的標(biāo)準(zhǔn)微流控液滴發(fā)生器進(jìn)行封裝，使大多數(shù)液滴包含多個(gè)細(xì)胞（核）。在這些過載的液滴中，轉(zhuǎn)錄本用液滴內(nèi)第二輪條形碼進(jìn)行標(biāo)記。因此，在同一分裂池中的所有細(xì)胞共享第一輪條形碼，在同一液滴中的所有細(xì)胞共享第二輪條形碼，兩種條形碼的組合可唯一編碼來自同一單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本。與傳統(tǒng)多輪組合拆分技術(shù)相比，scifi-RNA-seq更為簡便高效；與單一液滴微流控方法相比，scifi-RNA-seq允許每個(gè)液滴內(nèi)包裹多個(gè)細(xì)胞，大大提高了分析細(xì)胞通量，避免了傳統(tǒng)液滴方法因包裹多個(gè)細(xì)胞導(dǎo)致的錯(cuò)誤。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序主要朝著3個(gè)方向發(fā)展：（1）更高基因檢出率；（2）更高通量；（3）更高細(xì)胞利用率。然而，目前仍面臨以下兩大問題：基于全長轉(zhuǎn)錄組的文庫構(gòu)建法相對于基于標(biāo)簽轉(zhuǎn)錄組的文庫構(gòu)建法基因檢測能力更高，但是犧牲了高通量分析的能力，高基因檢出率與高分析通量難以兼得；超高通量與高細(xì)胞利用率（尤其是針對稀有細(xì)胞）的分析仍難以平衡，靈活性強(qiáng)、樣品適用范圍廣的操縱平臺(tái)仍有待進(jìn)一步開發(fā)。

2 單細(xì)胞多組學(xué)測序分析

單個(gè)細(xì)胞的表型往往受到不同分子（如DNA、RNA及蛋白質(zhì)）的共同調(diào)控，單細(xì)胞單組學(xué)分析難以提供全面的細(xì)胞異質(zhì)性信息。與之相比，單細(xì)胞多組學(xué)分析可以從多種分子層面揭示細(xì)胞特性，同時(shí)將不同組學(xué)信息直接關(guān)聯(lián)，更加深入地研究單細(xì)胞狀態(tài)、功能與生長過程及其分子調(diào)節(jié)機(jī)制［30］。目前，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組及其與其它組學(xué)的聯(lián)合分析在技術(shù)開發(fā)與整合分析方面已取得了初步進(jìn)展。

2.1 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和基因組聯(lián)合分析

基因組是決定細(xì)胞內(nèi)遺傳變異分子機(jī)制的源代碼，而轉(zhuǎn)錄組決定了細(xì)胞的特定功能?；蚪M和轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合分析通過探究DNA拷貝數(shù)、DNA編碼區(qū)與非編碼區(qū)如何決定轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平，從而建立基因組和轉(zhuǎn)錄組的相關(guān)性，并闡述選擇性表達(dá)分子作用機(jī)制，如RNA編輯、調(diào)控變異和等位基因特異性表達(dá)［31］。另外，對不同細(xì)胞的基因組和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行聯(lián)合分析，可進(jìn)一步區(qū)分遺傳亞克隆，同時(shí)進(jìn)行譜系示蹤。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和基因組的聯(lián)合分析步驟主要包括單細(xì)胞分離、細(xì)胞裂解、DNA/RNA分離、基因組/轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建。

DR-seq和G&T-seq是單細(xì)胞DNA和RNA平行分析的開創(chuàng)性工作［32-33］。DR-seq在挑取并裂解單細(xì)胞后，mRNA經(jīng)測序適配子（Ad-1x）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；接著以適配子（Ad-2）為引物，進(jìn)行cDNA與基因組DNA的線性預(yù)擴(kuò)增；之后將產(chǎn)物分成兩個(gè)部分，分別用于MALBAC全基因組文庫構(gòu)建及CEL-seq轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建。DR-seq避免了DNA和RNA的物理分離，減少了核酸的損失及操作繁瑣度，但易造成DNA與RNA間的相互污染。G&T-seq利用寡聚poly（T）包被的磁珠從細(xì)胞裂解液中物理分離含poly（A）尾的mRNA，接著對DNA和mRNA分別進(jìn)行MDA基因組文庫構(gòu)建和Smart-seq2轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建。這種單細(xì)胞DNA/RNA分離方式可適用于多種下游建庫方法，亦可將所獲得的DNA用于甲基化組研究。然而由于該方法針對poly（A）尾mRNA，難以應(yīng)用于非編碼RNA的測量。湯富酬課題組發(fā)展的ScTrio-seq采用溫和裂解法，在保持細(xì)胞核完整的同時(shí)裂解細(xì)胞膜以獲得所有胞質(zhì)RNA，通過移取上清液實(shí)現(xiàn)RNA/細(xì)胞核的分離，并將細(xì)胞核內(nèi)DNA用于全基因組和甲基化組的同時(shí)分析［34］。然而，為了在移取上清液的過程中避免細(xì)胞核的不慎吸取，該方法保留了部分上清液，造成RNA的損失。為了提高RNA的回收量，SIDR-seq利用抗體修飾磁珠標(biāo)記單個(gè)細(xì)胞，然后采用低滲裂解策略在細(xì)胞質(zhì)膜上進(jìn)行穿孔以釋放RNA，并通過磁分離方式實(shí)現(xiàn)RNA/細(xì)胞核的分離，允許不同類型的下游文庫構(gòu)建［34］。

然而，以上方法均局限于細(xì)胞的分析通量。為了解決這一問題，Shendure課題組采用組合拆分策略實(shí)現(xiàn)了高通量單細(xì)胞基因組和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析（sci-L3，圖2A）［36］。細(xì)胞被固定及核小體剝離后，分散至多孔板中；在每個(gè)孔板中，對細(xì)胞基因組進(jìn)行基于Tn5酶的片段化及插入反應(yīng)，對轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，通過Tn5插入引物及逆轉(zhuǎn)錄引物分別對細(xì)胞的基因組及轉(zhuǎn)錄組標(biāo)記第一輪編碼；將所有細(xì)胞混合，重新隨機(jī)拆分至孔板中，通過連接技術(shù)添加包含有T7啟動(dòng)子的第二輪編碼；將所有細(xì)胞重新拆分，并進(jìn)行間隙擴(kuò)展形成雙鏈T7啟動(dòng)子，隨后經(jīng)過體外轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄和第二鏈合成，添加第三輪編碼。同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的RNA與DNA共享相同的細(xì)胞編碼，通過測序數(shù)據(jù)中不同的文庫結(jié)構(gòu)區(qū)分RNA/DNA來源，最終實(shí)現(xiàn)高通量單細(xì)胞RNA/DNA的聯(lián)合分析。然而，該方法的基因組覆蓋率只有20%，因此集高通量、高覆蓋率于一體的單細(xì)胞基因組和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析方法仍有待開發(fā)。

圖2 高通量單細(xì)胞基因組和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合測序（sci-L3）［36］（A）；高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)聯(lián)合測序（multi-Paired-seq）［43］（B）；高通量單細(xì)胞染色質(zhì)可及性和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析（SNARE-seq）［47］（C）Fig．2 High-throughput single-cell genome and transcriptome sequencing（sci-L3）［36］（A）；high-throughput single-cell simultaneous transcriptome and proteins sequencing（multi-Paired-seq）［43］（B）；high-throughput single-cell chromatin accessibility and transcriptome sequencing（SNARE-seq）［47］（C）

2.2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組聯(lián)合分析

蛋白質(zhì)作為表型的直接輸出者，直接反映細(xì)胞當(dāng)下的生理狀態(tài)和細(xì)胞功能。轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的聯(lián)合測量有助于解釋轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性如何轉(zhuǎn)化為功能表型多樣性，深入理解轉(zhuǎn)錄/翻譯后修飾過程；同時(shí)有助于揭示RNA層面無法區(qū)分的表型差異，并探討特定細(xì)胞亞型的基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和功能調(diào)控類型。

基于熒光探針雜交或?qū)崟r(shí)定量熒光PCR的傳統(tǒng)RNA/蛋白測量法由于受到熒光光譜重疊和引物種類限制，靶標(biāo)檢測及細(xì)胞分析通量有限［37-38］。基于微流控技術(shù)和高通量測序技術(shù)的CITE-seq和REAP-seq有效解決了這一問題［39-40］。該類方法利用含有抗體編碼及poly（A）的DNA序列標(biāo)記并偶聯(lián)特定抗體，從而將蛋白信息轉(zhuǎn)化為核酸信息；接著借助Drop-seq及10×Genomics技術(shù)平臺(tái)在標(biāo)記抗體孵育細(xì)胞后將單個(gè)細(xì)胞及編碼微球共包裹于液滴中，細(xì)胞裂解所釋放的mRNA和標(biāo)記抗體DNA在堿基互補(bǔ)配對原則下被編碼微球捕獲。通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得帶有細(xì)胞編碼、分子編碼的cDNA與標(biāo)記抗體DNA，對所有產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增與測序，首次實(shí)現(xiàn)了成千上萬個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)的聯(lián)合分析，不僅提高了分析通量，且可用于低豐度蛋白檢測。在此基礎(chǔ)上，Abate課題組將DNA標(biāo)記抗體更替為靶向特定蛋白的核酸適體，減少了抗體使用量并降低了成本［41］。Smibert課題組進(jìn)一步將該類方法與T細(xì)胞/B細(xì)胞受體、細(xì)胞標(biāo)簽等分析結(jié)合，拓展了單細(xì)胞領(lǐng)域的多模態(tài)分析［42］。為了提高單細(xì)胞利用率，減少泊松分布帶來的細(xì)胞損失，本課題組結(jié)合抗體編碼與Paired-seq技術(shù)［25］發(fā)展了高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)聯(lián)合測序平臺(tái)（multi-Paired-seq，圖2B）［43］。該平臺(tái)在標(biāo)記抗體孵育細(xì)胞后將單個(gè)細(xì)胞通入微流控芯片，基于差異流阻原理進(jìn)行單細(xì)胞/單微球的順序捕獲與配對；接著利用含poly（T）的編碼微球捕獲細(xì)胞裂解釋放的mRNA及標(biāo)記抗體DNA，通過逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增、建庫及測序構(gòu)建單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)的表達(dá)矩陣。multi-Paired-seq證實(shí)了其在細(xì)胞利用水平、蛋白質(zhì)檢測準(zhǔn)確性等方面的優(yōu)越性，并成功揭示了單細(xì)胞在mRNA與對應(yīng)蛋白間的表達(dá)差異性。

然而以上方法均局限于細(xì)胞膜蛋白的分析。為了實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜內(nèi)蛋白的聯(lián)合測量，Mulder課題組將人工合成的標(biāo)記RNA與抗體偶聯(lián)，令其進(jìn)入固定后的細(xì)胞后于原位與磷酸化蛋白結(jié)合，并基于CELseq技術(shù)為每一個(gè)細(xì)胞的RNA及標(biāo)記抗體的合成RNA進(jìn)行編碼、擴(kuò)增與測序，最終實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞mRNA及膜內(nèi)磷酸化蛋白的聯(lián)合分析［44］。因此，當(dāng)前的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)聯(lián)合分析正朝著高通量、多模態(tài)方向發(fā)展。然而，DNA/RNA標(biāo)記抗體偶聯(lián)效率有限，制備工藝繁瑣，商品化的DNA標(biāo)記抗體價(jià)格昂貴，可替代的核酸適體種類有限，亟需開發(fā)高效便捷的蛋白標(biāo)記方法以提高單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組分析的普適性與廣泛性。

2.3 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳組聯(lián)合分析

細(xì)胞內(nèi)表觀遺傳標(biāo)記變化廣泛，如DNA甲基化修飾、組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、染色質(zhì)可及性等，其通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與構(gòu)象促進(jìn)/抑制轉(zhuǎn)錄組表達(dá)。因此，對轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組進(jìn)行聯(lián)合分析可以解析染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與構(gòu)象變化對細(xì)胞基因表達(dá)的可塑性，并構(gòu)建細(xì)胞表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制；同時(shí)，二者的同時(shí)分析可幫助鑒別細(xì)胞發(fā)育和疾病發(fā)展過程中的特殊標(biāo)記并實(shí)現(xiàn)遺傳譜系示蹤。

染色質(zhì)可及性和轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合檢測為揭示單個(gè)細(xì)胞的基因調(diào)控機(jī)制提供了強(qiáng)有力的工具。Cao等基于組合拆分策略發(fā)展了Sci-CAR技術(shù)，通過將細(xì)胞核隨機(jī)分配于多孔板中并依次進(jìn)行原位逆轉(zhuǎn)錄與Tn5酶打斷標(biāo)記，為RNA文庫及染色質(zhì)可及性文庫添加第一輪編碼；接著將所有細(xì)胞核合并并重新分配于多孔板中，對其進(jìn)行裂解后將產(chǎn)物分成兩部分，在PCR過程中添加第二輪編碼；由于來自同一細(xì)胞的RNA文庫及染色質(zhì)可及性文庫擁有相同編碼，因此可關(guān)聯(lián)同一單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)可及性并作聯(lián)合分析［45］。為了進(jìn)一步提高分析通量，Zhu等在Sci-CAR的基礎(chǔ)上，增加了三輪基于連接反應(yīng)的編碼，將單細(xì)胞分析通量提高至1×107［46］。為了提高分析靈敏度并減少復(fù)雜操作，Chen等提出了SNARE-seq（圖2C），通過在透化的細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行Tn5酶標(biāo)記反應(yīng)并引入與標(biāo)簽適配子互補(bǔ)的含有poly（A）的夾板序列作為介導(dǎo)，利用液滴微流控技術(shù)將單個(gè)細(xì)胞核與編碼微球包裹于同一液滴中，使編碼微球可同時(shí)捕獲夾板序列和mRNA，并利用測序技術(shù)進(jìn)行染色質(zhì)可及性與轉(zhuǎn)錄組信息讀取［47］。相比Sci-CAR，SNARE-seq多檢測到了4~5倍的可及DNA。Greenleaf課題組使用Cy5標(biāo)記DNA偶聯(lián)的綠色熒光蛋白（GFP）抗體對HEK293細(xì)胞表達(dá)的核定位GFP進(jìn)行染色，然后基于10×Genomics液滴微流控平臺(tái)生成單細(xì)胞染色質(zhì)可及性文庫和轉(zhuǎn)錄組文庫，通過一次測序即實(shí)現(xiàn)了對內(nèi)源性核蛋白豐度、染色質(zhì)可及性和轉(zhuǎn)錄組的定量分析［48］。然而以上方法均基于細(xì)胞核進(jìn)行，犧牲了細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄本；此外均將產(chǎn)物分成兩部分以進(jìn)行染色質(zhì)可及性文庫與轉(zhuǎn)錄組文庫的獨(dú)立制備，導(dǎo)致了一半信息的丟失。因此，基于全細(xì)胞水平的染色質(zhì)可及性和轉(zhuǎn)錄組文庫集中構(gòu)建方法仍有待開發(fā)。

單細(xì)胞DNA甲基化組和轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合分析可鑒別突變產(chǎn)生的遺傳譜系，全面揭示細(xì)胞間的異質(zhì)性，同時(shí)探討DNA甲基化修飾對基因表達(dá)的調(diào)控規(guī)律。scM&T-seq通過流式細(xì)胞儀分選單個(gè)細(xì)胞，然后利用oligo-dT磁珠對細(xì)胞內(nèi)的DNA及RNA進(jìn)行物理分離，并對其分別進(jìn)行甲基化文庫（scRRBS）及轉(zhuǎn)錄組文庫（Smart-seq2）構(gòu)建［49］。同年報(bào)道的scMT-seq利用相似的方法對單個(gè)細(xì)胞中的DNA及RNA進(jìn)行分離，并分別進(jìn)行全基因組水平的甲基化文庫（scWGBS）和轉(zhuǎn)錄組文庫（Smart-seq2）構(gòu)建［50］。然而，以上兩種方法易在DNA/RNA的物理分離過程中造成核酸損失。為了解決這一問題，Luo等發(fā)展了單管操作snmCT-seq技術(shù)，將單個(gè)細(xì)胞分選至384孔板，在逆轉(zhuǎn)錄和cDNA擴(kuò)增過程中用5mC-dCTP代替dCTP，因此cDNA鏈上全部的C堿基均為甲基化的；隨后進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，發(fā)生C＞T轉(zhuǎn)變。而gDNA中少量胞嘧啶是甲基化的，其他胞嘧啶都是未甲基化的，因此可通過測序進(jìn)行RNA及gDNA來源序列區(qū)分，從而實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和甲基化組的聯(lián)合分析［51］。然而該方法未事先對GC區(qū)域進(jìn)行富集，在測量甲基化位點(diǎn)時(shí)需加大測序深度在全基因組范圍內(nèi)搜尋，成本昂貴。

為了進(jìn)一步增加單細(xì)胞的多模態(tài)分析，構(gòu)建多維表觀遺傳調(diào)控圖譜，scNMT-seq和scChaRM-seq在DNA/RNA分離后，引入甲基轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記可及的DNA，僅使開放染色質(zhì)上GCH位點(diǎn)未甲基化的胞嘧啶全部甲基化，其他位置的甲基化狀態(tài)保持不變，通過比對GpC和CpG位點(diǎn)同時(shí)辨別單細(xì)胞染色質(zhì)可及性區(qū)域和DNA甲基化修飾［52-53］。RNA部分用于構(gòu)建scRNA-seq文庫，從而實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞甲基化、染色質(zhì)可及性及轉(zhuǎn)錄組三組學(xué)的聯(lián)合分析。然而，目前涉及甲基化的單細(xì)胞多組學(xué)分析由于操作步驟較為繁瑣，難以利用液滴微流控或組合拆分策略提高分析通量，因此高通量、高靈敏的多維表觀遺傳組與轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析方法開發(fā)是該領(lǐng)域未來的發(fā)展方向。

3 空間轉(zhuǎn)錄組分析

在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序中，單細(xì)胞的獲取依賴于組織解離，因此丟失了細(xì)胞的空間信息。空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)是結(jié)合成像、生物標(biāo)記、測序及生物信息學(xué)等工具對組織切片的基因表達(dá)進(jìn)行空間定位的一項(xiàng)技術(shù)，可揭示各細(xì)胞類型在組織中的空間分布、各細(xì)胞群體間的相互作用以及繪制不同組織區(qū)域的基因表達(dá)圖譜，對于理解疾病和癌癥的發(fā)生機(jī)制具有深遠(yuǎn)的應(yīng)用價(jià)值［54-55］。當(dāng)前的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)主要分為激光顯微切割、熒光原位雜交、熒光原位測序以及原位捕獲技術(shù)四大類。

3.1 激光顯微切割法

結(jié)合二代測序技術(shù)的激光顯微切割法是空間轉(zhuǎn)錄組研究的有力工具。我國中科院景乃禾、韓敬東和彭廣敦課題組發(fā)展了Geo-seq，利用激光顯微切割直接分離組織中特定位點(diǎn)的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，以充分獲得組織中各位點(diǎn)的全轉(zhuǎn)錄組信息［56］。為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞分辨率的測量，Nichterwitz等［57］開發(fā)的LCM-seq將激光顯微鏡切割與Smart-seq2結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞水平的空間轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)合二代測序技術(shù)的激光顯微切割法在稀有組織或部分降解組織樣本分析中具有優(yōu)勢，然而面臨細(xì)胞形態(tài)破壞、空間分辨率有限、細(xì)胞逐個(gè)切割分離耗時(shí)長等問題。

3.2 熒光原位雜交法

熒光原位雜交法利用標(biāo)記的熒光探針確定組織或細(xì)胞中的RNA/DNA豐度，并逐漸發(fā)展至單分子分辨水平。傳統(tǒng)的單分子熒光雜交技術(shù)（smFISH）受到熒光光譜重疊限制，只能檢測3~4種目標(biāo)RNA。組合標(biāo)記技術(shù)通過多種熒光標(biāo)記的組合可有效提高熒光原位雜交通量。蔡龍課題組發(fā)展的seqFISH技術(shù)，在每輪雜交中利用24個(gè)標(biāo)記有單一顏色的FISH探針與每個(gè)轉(zhuǎn)錄本雜交；成像后將探針剝離，在下一輪的雜交中使用擁有相同序列但標(biāo)記不同熒光團(tuán)的探針與相同的靶標(biāo)雜交［58］。通過連續(xù)幾輪雜交、成像和探針剝離，參與每一輪雜交的不同熒光排序形成了每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的獨(dú)特條形碼。利用F種熒光團(tuán)數(shù)目，經(jīng)過N輪雜交后，seqFISH可對F×N種轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行條形碼編碼，提高了靶標(biāo)檢測通量。然而該方法存在因熒光信號的非特異性雜交引入的潛在錯(cuò)誤率，這種錯(cuò)誤隨順序雜交而累積，因此對基因表達(dá)鑒定的準(zhǔn)確性提出了重大挑戰(zhàn)。為了降低潛在錯(cuò)誤率，莊小威課題組發(fā)展了MERFISH技術(shù)，應(yīng)用于RNA、染色質(zhì)DNA三維結(jié)構(gòu)等靶標(biāo)測量［59-61］。在MERFISH中，每種RNA被設(shè)計(jì)與192個(gè)編碼探針雜交，該編碼探針由一個(gè)靶向序列與兩個(gè)讀出熒光探針組成。在每一輪雜交中，通過系列的熒光探針靶向靶標(biāo)RNA并讀取熒光信號，產(chǎn)生的信號在相應(yīng)的一輪中記為“1”，無熒光信號的一輪記為“0”；經(jīng)過N輪雜交后，每個(gè)位點(diǎn)可生成由N個(gè)二進(jìn)制編碼所組成的條形碼，通過與所設(shè)計(jì)的靶標(biāo)條形碼比對，獲得該位點(diǎn)的具體靶標(biāo)RNA信息。同時(shí)，MERFISH設(shè)計(jì)了一種糾錯(cuò)編碼策略，通過設(shè)定二進(jìn)制位編碼的最小漢明距離以選擇相差更明顯的編碼，在遇到1個(gè)熒光標(biāo)記識別錯(cuò)誤時(shí)可通過人為修改回歸正確的編碼標(biāo)記，提高了轉(zhuǎn)錄本檢測的準(zhǔn)確性。

為了進(jìn)一步提高RNA的檢測通量，蔡龍課題組發(fā)展了升級版seqFISH技術(shù)（intron seqFISH）［62-63］。在該技術(shù)中，所設(shè)計(jì)的探針由一個(gè)靶向靶標(biāo)基因內(nèi)含子的特異性序列和4個(gè)延伸序列組成，每一段延伸序列可與對應(yīng)的讀出探針雜交成像。在每一輪成像中采用3組標(biāo)記有不同熒光團(tuán)的探針，通過對4個(gè)序列雜交的疊加圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，可以在單輪中獲得12個(gè)偽彩色的圖像。通過5輪雜交（另一輪進(jìn)行誤差修正），intron seqFISH可解碼10 421種轉(zhuǎn)錄本。盡管具有高靶標(biāo)檢測通量，但該方法需對樣品進(jìn)行數(shù)十輪的雜交反應(yīng)，步驟復(fù)雜、成本高。為了減少雜交次數(shù)，李景虹課題組發(fā)展了基于調(diào)控核酸雜交熱力學(xué)的DNA序列編碼的熒光標(biāo)記技術(shù)（SeqEA，圖3A）［64］。SeqEA利用含有識別單元（R）和編碼單元（B1、B2．．．．）的編碼鎖式探針，在R識別靶標(biāo)RNA后引發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）反應(yīng)，產(chǎn)生一個(gè)具有幾百個(gè)與鎖式探針序列互補(bǔ)DNA的單鏈產(chǎn)物，并通過與熒光標(biāo)記的檢測探針P1和P2雜交實(shí)現(xiàn)成像。通過熱力學(xué)計(jì)算指導(dǎo)的編碼模塊B1序列能夠精確調(diào)控B1-P1雜交鏈的雜交效率，從而調(diào)控結(jié)合到RCA產(chǎn)物的P1數(shù)量，并利用所產(chǎn)生的熒光信號差異對不同轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行熒光編碼。該方法利用DNA序列作為高密度的信息存儲(chǔ)載體，具有可編程、模塊化及分子水平編碼穩(wěn)定等特點(diǎn)，減少了熒光探針使用數(shù)目及雜交次數(shù)，可實(shí)現(xiàn)高通量、易操作的單分子、單核苷酸分辨率的轉(zhuǎn)錄本空間分析。綜上所述，現(xiàn)有的熒光原位雜交法在空間分辨率及靶標(biāo)檢測通量上具有優(yōu)勢，但其缺點(diǎn)在于需要合成大量熒光探針，昂貴耗時(shí)，且僅能對已知的靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行測量。

3.3 熒光原位測序法

熒光原位測序法利用單堿基特異性熒光雜交和DNA連接反應(yīng)對組織中已知或未知轉(zhuǎn)錄本的序列進(jìn)行原位測定。柯榮秦等發(fā)展的原位測序（ISS）技術(shù)將細(xì)胞固定透化后，在原位逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA上雜交一個(gè)含有DNA標(biāo)簽（或帶有幾個(gè)堿基缺口）的鎖式探針，并利用DNA聚合和連接反應(yīng)填充間隙，通過RCA反應(yīng)在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生高密度的DNA納米球；利用標(biāo)記有獨(dú)特?zé)晒獾暮怂崽结樑c待測序列雜交，通過邊連接邊測序策略讀取DNA標(biāo)簽（或待測轉(zhuǎn)錄本）的具體序列［65］。2016年Cartana公司正式將該技術(shù)商品化。該方法雖首次實(shí)現(xiàn)了待測轉(zhuǎn)錄本的原位測序，但僅對靶標(biāo)位點(diǎn)的已知序列進(jìn)行測定。Church課題組發(fā)展的FISSEQ技術(shù)，利用隨機(jī)引物產(chǎn)生cDNA后通過單鏈DNA環(huán)化酶對cDNA進(jìn)行環(huán)化，經(jīng)RCA信號放大后對轉(zhuǎn)錄本本身進(jìn)行測序以獲取轉(zhuǎn)錄本序列信息，從而實(shí)現(xiàn)對未知靶標(biāo)的測量［66，76］。然而FISSEQ的測序結(jié)果中rRNA含量高（40%~80%），可測得的mRNA種類少（~200種）；同時(shí)FISSEQ產(chǎn)生的讀長較短（5~30 bp），難以充分揭示單細(xì)胞間基因表達(dá)的差異。為了增加測序讀長，同時(shí)提高成像分辨率，Church課題組進(jìn)一步發(fā)展了Exseq技術(shù)（圖3B）［67］。該技術(shù)通過增加一輪非原位的經(jīng)典二代測序獲得全長的轉(zhuǎn)錄組信息，同時(shí)與原位測序數(shù)據(jù)（作為空間碼）進(jìn)行匹配，成功獲得長讀長轉(zhuǎn)錄組的空間位置信息；此外，Exseq結(jié)合擴(kuò)展顯微鏡技術(shù)將生物大分子、小分子等交聯(lián)到可吸水放大的丙烯酰胺凝膠上，通過組織吸水放大（~4倍放大）減少了成像信號的堆積干擾，實(shí)現(xiàn)了納米尺度的RNA原位測序分析。整體而言，盡管熒光原位測序在對未知靶標(biāo)的測量及在空間分辨率上具有優(yōu)勢，但其轉(zhuǎn)錄本檢測效率低、測序讀長短、圖像處理復(fù)雜等問題仍有待進(jìn)一步解決，同時(shí)需要整合算法分析尋找細(xì)胞邊界以確定RNA分子歸屬的細(xì)胞。

3.4 原位捕獲技術(shù)

原位捕獲技術(shù)的核心是利用具有空間位置信息的DNA標(biāo)簽引物捕獲并標(biāo)記轉(zhuǎn)錄本的空間位置。近幾年原位捕獲技術(shù)發(fā)展迅猛，并朝著提高空間分辨率及空間多組學(xué)聯(lián)合分析兩個(gè)方向發(fā)展。2016年St?hl課題組首次提出了原位捕獲技術(shù)（ST）［68］。ST將含有空間編碼、分子編碼的mRNA特異捕獲引物簇固定于載玻片表面以制備空間編碼玻片；接著將組織切片貼于空間編碼玻片，并對其進(jìn)行固定、染色與成像；利用玻片上的引物捕獲經(jīng)透化后的組織釋放的mRNA，并通過逆轉(zhuǎn)錄過程生成含有空間編碼的cDNA，經(jīng)轉(zhuǎn)錄組文庫制備、高通量測序與分析，將轉(zhuǎn)錄組序列映射至原空間位置，實(shí)現(xiàn)高覆蓋度的組織空間轉(zhuǎn)錄組測量分析。之后，ST技術(shù)被成功轉(zhuǎn)化為商品化平臺(tái)（10×Genomics Visium）。雖然該方法分析面積大（6．5 mm×6．5 mm），但需要將大量DNA空間編碼探針固定于載玻片表面，修飾成本高，且空間分辨率有限（55 μm/編碼點(diǎn)陣），難以達(dá)到單細(xì)胞水平。為了進(jìn)一步提高空間分辨率，Rodriques等用編碼微球代替ST的空間點(diǎn)陣列，發(fā)展了Slide-seq技術(shù)［69］。Slide-seq將空間編碼、分子編碼與捕獲序列修飾于編碼微球上，并將微球緊密堆積在玻璃一側(cè)形成單層結(jié)構(gòu)。每個(gè)微球的空間編碼不同，可采用SOLiD技術(shù)進(jìn)行空間編碼的解碼。由于微球的直徑為10 μm，與單個(gè)細(xì)胞的尺寸相近，因此Slide-seq方法的空間分辨率可達(dá)10 μm。Vickovic等［70］發(fā)展的高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組（HDST）通過使用2 μm編碼微球并結(jié)合順序雜交策略進(jìn)行微球解碼，將分辨率提高至2 μm水平。李俊熙課題組發(fā)展了Seq-scope技術(shù)，基于Illumina測序芯片構(gòu)建空間編碼陣列后，對組織的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行解析，將空間分辨率提高至1 μm水平［71］。我國華大基因也推出了Stereo-seq技術(shù)，利用自組裝的DNA納米球制備空間編碼陣列，進(jìn)一步將空間分辨率提高至220 nm，并且可分析的組織面積達(dá)到42．25 cm2，遠(yuǎn)高于其他技術(shù)［72］。

在空間多組學(xué)研究方面，樊榮課題組發(fā)展的DBiT-seq技術(shù)開創(chuàng)了先河（圖3C）［73］。不同于利用空間陣列或微（納）球捕獲釋放的mRNA，DBiT-seq利用微流控技術(shù)對組織細(xì)胞進(jìn)行原位的空間編碼標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)了空間轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)的聯(lián)合測量。以甲醛固定的組織玻片為起始材料，將其與識別目標(biāo)蛋白的DNA標(biāo)簽修飾抗體（ADT）混合物共孵育；接著將含有50個(gè)平行微通道的微流體芯片放置在組織玻片上，以引入第一組DNA條碼（A1~A50），其通過oligo-dT結(jié)合mRNA或ADT的poly（A）尾部；原位逆轉(zhuǎn)錄后，將與第一個(gè)芯片通道垂直的微流控芯片放置在組織載玻片上，以引入第二個(gè)DNA條形碼（B1~B50），使其與含有A條形碼的cDNA連接，從而生成AiBj（i=1~50，j=1~50）數(shù)組。從組織中提取cDNA，并通過PCR擴(kuò)增制備測序文庫，通過識別cDNA及抗體DNA標(biāo)簽上連接的空間編碼AiBj重建空間表達(dá)圖。依照類似的方法，該課題組進(jìn)一步將該方法拓展至空間分辨的染色質(zhì)可及性（spatial-ATAC-seq）及組蛋白修飾（Spatial-CUT&Tag）研究，有望實(shí)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)等多種組學(xué)的聯(lián)合分析［74-75］。

圖3 基于調(diào)控核酸雜交熱力學(xué)的DNA序列編碼的熒光標(biāo)記技術(shù)（SeqEA）［64］（A）；納米級分辨率的完整組織RNA原位測序技術(shù)（Exseq）［67］（B）；基于確定性標(biāo)記的空間轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)聯(lián)合測序技術(shù)（DBiT-seq）［73］（C）Fig．3 DNA-sequence-encoded rolling circle amplicon for single-cell RNA imaging based on nucleic acid hybridization regulation（SeqEA）［64］（A）；in situ RNA sequencing in intact biological systems with nanoliter resolution（Exseq）［67］（B）；spatially multi-omics sequencing via deterministic barcoding in tissue（DBiT-seq）［73］（C）

本文在表1中對各類方法進(jìn)行了直接對比。

表1 空間轉(zhuǎn)錄組分析方法對比Table 1 Comparison of spatial transcriptome analysis methods

綜上所述，原位捕獲技術(shù)因具有分析通量高、靈敏度高、可分析的組織面積大、可進(jìn)行多模態(tài)分析等優(yōu)點(diǎn)，成為單細(xì)胞空間分辨分析的重要技術(shù)。然而，盡管當(dāng)前的原位捕獲技術(shù)已實(shí)現(xiàn)納米級分辨率，但基于微球/納米球的編碼方法需利用高通量測序儀對芯片上每一個(gè)編碼位置進(jìn)行從頭測序以獲得每個(gè)地理坐標(biāo)位置的編碼序列，過程復(fù)雜、耗時(shí)長、成本高，限制了其大規(guī)模應(yīng)用；同時(shí)亞細(xì)胞水平的空間轉(zhuǎn)錄本定位研究仍然受限。開發(fā)制備易、通量高、成本低、面積大、靈敏度高、分辨率高的原位捕獲技術(shù)并進(jìn)行應(yīng)用拓展是這一領(lǐng)域的未來發(fā)展方向。

4 結(jié)論與展望

本文綜述了單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組分析的前沿進(jìn)展，總結(jié)并討論了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序、單細(xì)胞多組學(xué)測序和空間轉(zhuǎn)錄組分析方法。可以看到，當(dāng)前的單細(xì)胞測序技術(shù)正朝著空間化與多組學(xué)化方向發(fā)展。盡管目前單細(xì)胞多組學(xué)及空間轉(zhuǎn)錄組分析在揭示單細(xì)胞異質(zhì)性及細(xì)胞間的相互作用方面取得了重要突破，但仍面臨若干重大挑戰(zhàn)：首先，用于樣品制備或測序的自動(dòng)化設(shè)備成本較高，且需要權(quán)衡細(xì)胞數(shù)量和測序深度以控制成本；第二，大多數(shù)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究局限于poly（A）尾mRNA分析，而鮮有非多聚腺苷酸RNA（如非編碼RNA、小RNA等）的聯(lián)合分析，亟需發(fā)展針對全轉(zhuǎn)錄組的單細(xì)胞空間多組學(xué)研究方法；第三，目前基于原位捕獲的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究雖擁有了較高的基因測量數(shù)，但單細(xì)胞或亞細(xì)胞的空間分辨率有限，而基于成像的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究雖擁有納米級分辨率，但基因檢測數(shù)目有限，兼具高基因檢測通量和高空間分辨率的分析方法是未來的發(fā)展方向；第四，當(dāng)前的空間轉(zhuǎn)錄組分析局限于二維空間水平，盡管已有一些課題組利用連續(xù)切片組織進(jìn)行二維空間基因表達(dá)分析，然后采用算法分析重構(gòu)三維圖譜［77］，但這種方法仍存在過程復(fù)雜、切片質(zhì)量無法保證等問題，完美的三維結(jié)構(gòu)重塑仍未解決。因此，開發(fā)低成本、全方位、高通量、高分辨的單細(xì)胞空間多組學(xué)分析方法，實(shí)現(xiàn)對單個(gè)細(xì)胞更為細(xì)致、全面及準(zhǔn)確的描述和精準(zhǔn)單細(xì)胞圖譜構(gòu)建，將更具研究及應(yīng)用潛力。