成組毒理學(xué)分析儀在污染物識(shí)別與毒性測試中的應(yīng)用

楊曉溪，李姿慷，郭云鶴，劉艷娜，王 易，聶 童，周群芳，史建波，曲廣波，江桂斌

（中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085）

隨著工業(yè)的快速發(fā)展和科技的飛速進(jìn)步，每年新合成的化學(xué)品不斷涌現(xiàn)，但受到監(jiān)管的化學(xué)品十分有限，進(jìn)入環(huán)境中的潛在污染物數(shù)量以驚人的速度迅猛增加。環(huán)境污染被認(rèn)為是當(dāng)今世界誘發(fā)人類疾病甚至導(dǎo)致死亡的重要因素［1］，我國環(huán)境污染所導(dǎo)致的健康問題也已突顯［2］?；瘜W(xué)品隨著人們的生產(chǎn)生活釋放到各類環(huán)境介質(zhì)或食品中，種類繁多，復(fù)雜多變，一些化學(xué)品可在極低濃度下產(chǎn)生毒性，而一些本無毒性的物質(zhì)可與其他化合物協(xié)同發(fā)揮更強(qiáng)的毒性作用，呈現(xiàn)出復(fù)合毒性效應(yīng)［3］。此外，化學(xué)品在復(fù)雜介質(zhì)中的遷移轉(zhuǎn)化會(huì)產(chǎn)生各類轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其毒性作用可能強(qiáng)于母體化合物［4］，提示著更多不可預(yù)測的風(fēng)險(xiǎn)。

現(xiàn)有的污染物分析方法利用液相色譜-質(zhì)譜或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)僅針對(duì)已知目標(biāo)化合物進(jìn)行檢測，再基于濃度預(yù)測其毒性效應(yīng)，但忽略了大量的非目標(biāo)化合物或未知化學(xué)品，難以反映復(fù)雜體系中所有化合物的實(shí)際效應(yīng)［5］。利用活體動(dòng)物或離體細(xì)胞的生物效應(yīng)檢測方法可以直接評(píng)估樣品的毒性，但較低的通量和較差的可重復(fù)性使得該方法無法適用于大規(guī)模樣品的篩選。為了運(yùn)用更有效的方法預(yù)測化學(xué)品對(duì)人類健康及環(huán)境的影響，美國于2007年提出了Tox21計(jì)劃，美國環(huán)境保護(hù)署（EPA）、國家毒理學(xué)計(jì)劃（NTP）、國立衛(wèi)生研究院（NIH）以及食品和藥物管理局（FDA）形成了Tox21聯(lián)盟，搭建了基于百余種離體細(xì)胞測試的高通量自動(dòng)化毒性檢測平臺(tái)，建立了涵蓋工業(yè)化學(xué)品、消費(fèi)品、食品添加劑等在內(nèi)的上萬種化合物的毒性數(shù)據(jù)庫［6-7］。然而，Tox21篩選平臺(tái)僅限于純化學(xué)品的檢測，無法對(duì)未知化合物和實(shí)際環(huán)境樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)，不能反映復(fù)雜基質(zhì)中化學(xué)品的實(shí)際毒性與健康危害。

面對(duì)我國嚴(yán)峻的環(huán)境與食品安全問題，為突破實(shí)際樣品中毒性物質(zhì)快速識(shí)別的瓶頸，本課題組于2005年首次在國際上提出了“成組毒理學(xué)”（Integrated toxicology）的概念，并研制出第一代“成組毒理學(xué)分析儀”（Integrated toxicology analyzer，ITA），于2013年獲得國家發(fā)明專利授權(quán)［8］。該儀器通過固相萃取、高效液相色譜、四極桿串聯(lián)質(zhì)譜、加樣裝置的在線聯(lián)用，可完成樣品自動(dòng)分離、組分收集與分析、毒性測試三部分復(fù)雜的操作，適用于實(shí)際環(huán)境樣品中效應(yīng)污染物的篩選。

近年來，隨著質(zhì)譜技術(shù)、機(jī)械自動(dòng)化、大數(shù)據(jù)分析及人工智能的高速發(fā)展，本課題組于2016年開始研制第三代成組毒理學(xué)分析儀—高通量多功能成組毒理學(xué)分析系統(tǒng)，從設(shè)備先進(jìn)性、規(guī)模配置及功能設(shè)計(jì)等方面進(jìn)行升級(jí)改造，旨在實(shí)現(xiàn)全面自動(dòng)化、高通量的快速檢測與篩選，于2020年獲得國家發(fā)明專利授權(quán)［9］。該系統(tǒng)發(fā)展了自動(dòng)化、高通量、簡便快捷的樣品分離與制備技術(shù)，構(gòu)建了復(fù)雜介質(zhì)樣品的分離與制備子系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜介質(zhì)樣品中效應(yīng)組分的自動(dòng)提取、富集、純化、收集及規(guī)?；苽?；發(fā)展了無機(jī)物、有機(jī)物、細(xì)顆粒物的分析與鑒定技術(shù)，構(gòu)建了由質(zhì)譜、光譜等儀器分析模塊與結(jié)構(gòu)-性質(zhì)關(guān)系信息庫組成的綜合鑒定系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜樣品中未知污染物、毒性效應(yīng)物的自動(dòng)多維分離、定量及鑒定；構(gòu)建了以生物有效性、細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)和生物靶分子3個(gè)層次的多靶點(diǎn)高通量毒性評(píng)價(jià)模塊，建立了污染物的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)、神經(jīng)毒理學(xué)效應(yīng)、血液毒性效應(yīng)等多靶點(diǎn)毒性評(píng)價(jià)方法，實(shí)現(xiàn)了樣品的高通量多靶點(diǎn)自動(dòng)化毒性評(píng)價(jià)；發(fā)展了in silico污染物健康危害高通量篩查評(píng)價(jià)方法，實(shí)現(xiàn)了不良健康結(jié)局的優(yōu)先級(jí)排序，為污染物健康影響評(píng)價(jià)提供理論和方法儲(chǔ)備，并建立了基于計(jì)算模擬的污染物體內(nèi)潛在靶點(diǎn)篩查方法和計(jì)算模塊，整合于高通量成組毒理學(xué)數(shù)據(jù)一體化分析平臺(tái)。高通量多功能成組毒理學(xué)分析系統(tǒng)結(jié)合最先進(jìn)的化學(xué)分析與現(xiàn)代毒理學(xué)評(píng)價(jià)方法，可高通量完成實(shí)際復(fù)雜樣品中效應(yīng)污染物的結(jié)構(gòu)解析、識(shí)別與毒性評(píng)價(jià)，顯著提高了污染物識(shí)別及毒性評(píng)價(jià)的可靠性及效率，為未知污染物的篩選及復(fù)合效應(yīng)等研究提供了全新的技術(shù)手段和通用平臺(tái)。本文主要總結(jié)了成組毒理學(xué)分析儀的結(jié)構(gòu)與設(shè)計(jì)，以及該儀器在復(fù)雜樣品中污染物分離與制備、污染物檢測與鑒定、生物毒性效應(yīng)高通量篩查、實(shí)際樣品中效應(yīng)污染物識(shí)別方面的應(yīng)用進(jìn)展，并對(duì)其未來的發(fā)展趨勢和應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

1 成組毒理學(xué)分析儀的結(jié)構(gòu)與設(shè)計(jì)

第二代成組毒理學(xué)分析儀即高通量多功能成組毒理學(xué)分析系統(tǒng)涵蓋了多個(gè)功能區(qū)，包含復(fù)雜介質(zhì)樣品的高通量分離與制備、有毒物質(zhì)的儀器分析與結(jié)構(gòu)-性質(zhì)關(guān)系綜合鑒定、多靶點(diǎn)高通量生物效應(yīng)評(píng)價(jià)、儀器控制及數(shù)據(jù)綜合分析4個(gè)子系統(tǒng)。通過各子系統(tǒng)功能間的耦合，可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜介質(zhì)樣品中效應(yīng)組分的自動(dòng)提取、富集、純化、收集及規(guī)?；苽?，未知污染物的自動(dòng)化多維分離、定量及定性分析，高通量多靶點(diǎn)自動(dòng)化毒性檢測以及數(shù)據(jù)一體化解析。

復(fù)雜介質(zhì)樣品高通量分離與制備子系統(tǒng)由樣品制備、樣品分離和樣品收集三部分組成，分別對(duì)樣品進(jìn)行提取、凈化、濃縮，基于色譜柱的組分分離以及餾分自動(dòng)化收集。該子系統(tǒng)主要原理涵蓋機(jī)械臂定位、進(jìn)樣環(huán)定量、進(jìn)樣閥切換、色譜分離及自動(dòng)化軟件控制，樣品經(jīng)自動(dòng)化提取后，機(jī)械臂將樣品轉(zhuǎn)移至凈化濃縮模塊，凈化濃縮后的樣品直接經(jīng)管道進(jìn)入色譜分離系統(tǒng)進(jìn)行組分的制備，通過進(jìn)樣閥比例的調(diào)節(jié)，組分分別進(jìn)入高分辨質(zhì)譜完成污染物的鑒定，進(jìn)入餾分收集系統(tǒng)完成組分的自動(dòng)收集。有毒物質(zhì)的儀器分析與結(jié)構(gòu)-性質(zhì)關(guān)系綜合鑒定子系統(tǒng)包括可用于有機(jī)物定量和定性分析的高分辨液相色譜-質(zhì)譜、氣相色譜-質(zhì)譜，以及自主研制的質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)質(zhì)譜，用于無機(jī)物如金屬元素和甲基汞快速測定的檢測儀。經(jīng)分離制備子系統(tǒng)處理得到的樣品或組分通過綜合鑒定子系統(tǒng)的相應(yīng)檢測儀器完成測定后，結(jié)合測試結(jié)果并調(diào)用儀器控制及數(shù)據(jù)綜合分析子系統(tǒng)中的結(jié)構(gòu)-性質(zhì)關(guān)系信息庫模塊，完成污染物的快速鑒定。多靶點(diǎn)高通量生物效應(yīng)評(píng)價(jià)子系統(tǒng)由生物有效性、細(xì)胞效應(yīng)及分子效應(yīng)檢測3個(gè)模塊組成，分別為通過檢測細(xì)胞生存力及跨膜電阻評(píng)價(jià)化合物穿透力的人Caco-2細(xì)胞的腸上皮生物屏障模型，通過檢測細(xì)胞增殖分化、凋亡、特征酶活性及受體轉(zhuǎn)錄活性的多種離體細(xì)胞高通量測試模型，以及通過檢測功能基因及蛋白的高通量DNA羥甲基化測序方法及DNA損傷產(chǎn)物的電化學(xué)發(fā)光檢測裝置。該子系統(tǒng)通過整合多種自動(dòng)化細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備、全自動(dòng)機(jī)械臂等，可高通量快速完成各模塊的全流程自動(dòng)化測試。儀器控制及數(shù)據(jù)綜合分析子系統(tǒng)是以多維滑軌機(jī)械臂為核心的自動(dòng)控制系統(tǒng)，通過建立化學(xué)品結(jié)構(gòu)與性質(zhì)關(guān)系數(shù)據(jù)管理體系、關(guān)鍵分子起始事件虛擬篩選技術(shù)及基于體外與生物信息學(xué)數(shù)據(jù)的有害結(jié)局通路解析方法，實(shí)現(xiàn)全流程數(shù)據(jù)采集、匯總與分析，通過結(jié)構(gòu)與數(shù)據(jù)挖掘的信息和決策技術(shù)，完成數(shù)據(jù)一體化分析。

成組毒理學(xué)分析儀以自動(dòng)化控制與高通量篩選為核心，形成了功能強(qiáng)大的有機(jī)整體，其主要工作流程如圖1所示。復(fù)雜樣品（如細(xì)顆粒物、土壤、底泥、藥物、生物樣品等）經(jīng)前處理系統(tǒng)進(jìn)行初步提取與凈化后，進(jìn)行基于離體生物實(shí)驗(yàn)的多靶點(diǎn)毒性效應(yīng)快速篩查和基于靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜的有毒物質(zhì)快速鑒定，對(duì)于效應(yīng)樣品進(jìn)行進(jìn)一步分離與純化，解析關(guān)鍵活性組分或未知化合物的結(jié)構(gòu)特征。利用該系統(tǒng)，不僅可同時(shí)完成針對(duì)大規(guī)模樣品的化學(xué)分析與毒性檢測的聯(lián)動(dòng)測試，也可進(jìn)行單一化學(xué)分析或生物學(xué)效應(yīng)高通量篩查，其作用和功能覆蓋了化學(xué)分析與毒理學(xué)研究中的多個(gè)層面。ITA可在短時(shí)間內(nèi)獲取化合物的毒性、含量及結(jié)構(gòu)特征，為環(huán)境化學(xué)與毒理學(xué)研究領(lǐng)域提供了強(qiáng)有力的技術(shù)手段和通用平臺(tái)，可滿足我國環(huán)境保護(hù)、食品安全、藥物成分解析、軍事毒物分析等應(yīng)急需求。

圖1 成組毒理學(xué)分析儀工作流程Fig．1 The workflow of integrated toxicology analyzer

2 污染物識(shí)別與毒性測試方法的開發(fā)與應(yīng)用

2.1 在復(fù)雜樣品中污染物分離與制備方面的應(yīng)用

環(huán)境、食品和生物樣品中污染物種類繁多、性質(zhì)各異，一些有機(jī)污染物的濃度很低，因此建立復(fù)雜樣品中不同污染物的快速提取、凈化、分離方法對(duì)實(shí)現(xiàn)大量樣品的高通量分析與檢測極為重要。已有的樣品前處理及制備技術(shù)僅利用獨(dú)立的儀器或容器進(jìn)行樣品中特定性質(zhì)污染物的處理，操作復(fù)雜、耗時(shí)長、重復(fù)性差，且無法進(jìn)行痕量物質(zhì)的高效提?。?］。ITA中高通量分離與制備系統(tǒng)解決了復(fù)雜介質(zhì)樣品提取與制備的難題，利用該系統(tǒng)，通過樣品分級(jí)提取、組分收集、色譜分離純化及細(xì)顆粒物分離純化，即可完成不同樣品的快速提取與組分的制備。

ITA整合了加速溶劑萃取儀、全能樣品前處理平臺(tái)、機(jī)械臂等自動(dòng)化設(shè)備，通過硬件連接和軟件控制結(jié)合的方式，開發(fā)了適用于復(fù)雜樣品中目標(biāo)有機(jī)污染物的自動(dòng)化提取與制備技術(shù)。對(duì)于固體、半固體樣品的處理，采用快速溶劑萃取儀完成對(duì)污染物的提取。全能樣品前處理平臺(tái)集成了凝膠凈化、固相萃取、定量濃縮和液相進(jìn)樣4個(gè)功能模塊，可獨(dú)立完成液體樣品中有機(jī)物的提取、富集和濃縮。完成提取、凈化及濃縮的樣品，經(jīng)色譜柱分離后，分別進(jìn)入質(zhì)譜儀及收集器，可快速用于后續(xù)各餾分化學(xué)檢測與生物效應(yīng)評(píng)價(jià)的并行分析，節(jié)省了樣品處理時(shí)間并提高了效率。

細(xì)顆粒物樣品不僅附著了各類金屬、有機(jī)物，且一些超細(xì)顆粒物可進(jìn)入人體從而產(chǎn)生健康危害，針對(duì)細(xì)顆粒物樣品的分離純化是深入研究其環(huán)境效應(yīng)及生物安全性的前提。在ITA系統(tǒng)中，中科院生態(tài)環(huán)境研究中心的譚志強(qiáng)等［10］利用中空纖維膜流場流分離技術(shù)自主研制了細(xì)顆粒物的在線多維分離純化模塊，通過與紫外吸收光譜檢測器和電感耦合等離子發(fā)射光譜的在線聯(lián)用，可進(jìn)行不溶態(tài)顆粒粒徑表征及顆粒上附著的可溶性金屬的定量測定。利用該裝置，針對(duì)在超純水、模擬天然水和模擬肺液中孵育的實(shí)際大氣細(xì)顆粒物樣品，進(jìn)行可溶性金屬及殘余細(xì)顆粒物的分離純化，并對(duì)其溶出率及數(shù)量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)鋅在模擬肺液中的溶出率最高，而尺寸小于10 nm的細(xì)顆粒物在模擬肺液中檢出的數(shù)量最多。該裝置可快速有效地分離純化可溶性金屬組分及小粒徑的細(xì)顆粒物，在實(shí)時(shí)監(jiān)測并追蹤大氣細(xì)顆粒物在環(huán)境與生物介質(zhì)中的轉(zhuǎn)化方面具有潛在的應(yīng)用前景。

2.2 在污染物檢測與鑒定方面的應(yīng)用

復(fù)雜樣品中未知污染物的結(jié)構(gòu)鑒定往往需借助多種儀器和技術(shù)完成，對(duì)于未知化合物，除了質(zhì)譜分析結(jié)果，還需利用紫外、紅外等多種光譜技術(shù)以及核磁共振波譜技術(shù)分別對(duì)餾分中化合物的官能團(tuán)以及分子骨架進(jìn)行分析，以推測結(jié)構(gòu)。ITA整合了超高分辨率、超高質(zhì)量準(zhǔn)確度的全掃描型高分辨質(zhì)譜儀，輔以光譜分析模塊，結(jié)合數(shù)據(jù)分析軟件，可實(shí)現(xiàn)樣品或組分中新型未知污染物的高通量快速識(shí)別。

在新污染物鑒定方面，本課題組阮挺等［11］對(duì)20個(gè)省份和自治區(qū)共56個(gè)不同污水處理廠的污泥樣本中新型氯代多氟醚基磺酸鹽類物質(zhì)（Cl-PFESAs）進(jìn)行疑似靶標(biāo)篩查，發(fā)現(xiàn)了3種Cl-PFESAs同系物，即6∶2 Cl-PFESA、8∶2 Cl-PFESA和10∶2 Cl-PFESA，其檢出率分別為100%、89．3%、23．2%，污泥中化合物含量范圍為未檢出~209 ng/g（干重）。其中6∶2 Cl-PFESA為最主要的Cl-PFESAs污染物，其幾何平均濃度為2．15 ng/g，在部分地區(qū)污泥樣本中的濃度已超過全氟辛烷磺酸鹽（PFOS），成為主要的全氟化合物污染物。進(jìn)而對(duì)6∶2 Cl-PFESA在體外超還原態(tài)氰鈷胺厭氧體系中可能的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行非靶標(biāo)分析，篩查出3個(gè)脫鹵加氫還原轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，即1H-6∶2 PFESA、2H-6∶2 PFESA和1H-6∶2 PFUESA，進(jìn)一步在真實(shí)河流底泥樣品中發(fā)現(xiàn)了其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物［12］。在污染物轉(zhuǎn)化方面，本課題組張青等［13］采用2，4，6-三溴苯酚對(duì)水稻進(jìn)行了水培暴露，通過可能的代謝途徑建立本地的代謝物數(shù)據(jù)庫，結(jié)合氣相色譜和高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜，鑒定了40種Ⅰ相和Ⅱ相代謝物，為系統(tǒng)了解溴苯酚的遷移轉(zhuǎn)化及其環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了重要參考。同時(shí)，本課題組陳偉芳等［14］利用基于成對(duì)質(zhì)譜碎片質(zhì)量差的方法，在水稻細(xì)胞中鑒定出65種新型短鏈和中鏈氯化石蠟代謝物，并揭示了其在懸浮水稻細(xì)胞中的代謝分子網(wǎng)絡(luò)，首次發(fā)現(xiàn)了氯化石蠟的羥基化、硫化和糖基化過程。

在有機(jī)氣體檢測方法方面，中科院生態(tài)環(huán)境研究中心束繼年課題組［15］通過單光子過程研究、質(zhì)子來源研究、激發(fā)態(tài)二氯甲烷誘導(dǎo)的高效質(zhì)子化過程機(jī)理推導(dǎo)，揭示了激發(fā)態(tài)二氯甲烷誘導(dǎo)的質(zhì)子轉(zhuǎn)移離子化機(jī)理，以此研制了新型電離方法?；谘兄频男滦碗x子源，研究人員開展了常見爆炸物如硝基化合物的高靈敏檢測研究［16］，該方法對(duì)芳香族硝基化合物具有超高的電離效率，對(duì)空氣中硝基苯化合物的檢測具有重要應(yīng)用價(jià)值。利用新離子化技術(shù)，可在呼出氣體中檢測疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物如丙烯醛等［17］，實(shí)時(shí)監(jiān)測有機(jī)胺類物質(zhì)［18］，檢測有機(jī)磷類神經(jīng)毒劑等［19］。該方法應(yīng)用范圍廣，實(shí)用性強(qiáng)，有望為各類復(fù)雜樣品中揮發(fā)性有機(jī)物化學(xué)成分的鑒別及含量測定提供技術(shù)支撐。

2.3 在生物毒性效應(yīng)高通量篩查方面的應(yīng)用

復(fù)雜介質(zhì)樣品中存在多種化合物，其毒性效應(yīng)各異，在機(jī)體內(nèi)的代謝及生物有效性尚不明確，而針對(duì)其中種類繁多的未知污染物的毒性篩選工作相當(dāng)繁重，時(shí)間、人力、財(cái)力消耗巨大。然而，目前國際上現(xiàn)有的毒理效應(yīng)篩選平臺(tái)僅限于純化學(xué)品的檢測，且在效應(yīng)重組細(xì)胞及分子傳感器上存在缺陷，無法進(jìn)行復(fù)雜基質(zhì)及未知化合物的高通量篩選與毒性評(píng)估。ITA中多靶點(diǎn)高通量生物效應(yīng)評(píng)價(jià)子系統(tǒng)是以離體生物學(xué)測試為核心的自動(dòng)化毒性測試模塊，適用于樣品、組分或化學(xué)純品的各類毒性效應(yīng)高通量篩查研究。

四溴雙酚A（TBBPA）及其衍生物是一類新型溴代阻燃劑，廣泛用于電子電器產(chǎn)品、油漆、紡織品等日用品。這類物質(zhì)的大量使用，不可避免地使其隨著人們的生產(chǎn)生活進(jìn)入到環(huán)境中，對(duì)人類造成威脅。本課題組曲廣波等［20］利用ITA平臺(tái)中多靶點(diǎn)毒性篩查技術(shù)，基于T-screen方法研究了TBBPA衍生物及其環(huán)境轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對(duì)TR信號(hào)通路的潛在干擾效應(yīng)，結(jié)果表明，這些化合物可能會(huì)與甲狀腺激素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合從而干擾甲狀腺激素水平，也可能會(huì)進(jìn)入細(xì)胞與甲狀腺激素受體TR作用，干擾相關(guān)基因調(diào)控從而引起甲狀腺激素干擾效應(yīng)。與TBBPA衍生物相比，其環(huán)境轉(zhuǎn)化產(chǎn)物更易進(jìn)入細(xì)胞而發(fā)揮甲狀腺激素干擾作用。該研究可為TBBPA衍生物及其環(huán)境轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)，也提示人們其環(huán)境轉(zhuǎn)化產(chǎn)物可能帶來的潛在威脅。

由新冠病毒SARS-CoV-2引起的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）已遍及全球，越來越多的研究關(guān)注其感染的相關(guān)因素。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）被確定為SARS-CoV-2的功能受體，其轉(zhuǎn)錄水平與SARS-CoV-2易感性和COVID-19癥狀的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。ACE2轉(zhuǎn)錄水平受遺傳因素和非遺傳因素的調(diào)控，作為非遺傳因素的外源化學(xué)品暴露對(duì)病毒受體的表達(dá)影響尚不明確。利用ITA平臺(tái)，本課題組曲廣波等［21］基于多種細(xì)胞系建立了病毒受體轉(zhuǎn)錄表達(dá)的高通量檢測方法，針對(duì)環(huán)境中常見的60種化學(xué)污染物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)部分污染物如鉛以及大氣細(xì)顆粒會(huì)導(dǎo)致ACE2轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)（如圖2所示），最高表達(dá)量可達(dá)到對(duì)照組的7倍。該研究揭示了外源性化合物暴露可能通過共同的關(guān)鍵調(diào)控因子影響病毒受體的轉(zhuǎn)錄，從而增加病毒感染的可能性，為研究外源化合物暴露與病毒易感性和有害結(jié)局路徑之間的聯(lián)系提供了初步線索。

圖2 不同化學(xué)品暴露對(duì)病毒受體轉(zhuǎn)錄水平的影響［18］Fig．2 Expressions of virus receptors in HEK-293T cells stimulated by nongenetic external chemicals［18］

2.4 在實(shí)際樣品中效應(yīng)物質(zhì)識(shí)別方面的應(yīng)用

識(shí)別實(shí)際樣品中的效應(yīng)物質(zhì)是污染物環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及污染物控制的重要步驟，單一的化學(xué)分析或毒性測試難以反映實(shí)際樣品的效應(yīng)。效應(yīng)導(dǎo)向分析（Effect-directed analysis，EDA）是以生物效應(yīng)為核心，通過組分分離及化學(xué)分析實(shí)現(xiàn)復(fù)雜環(huán)境樣品中貢獻(xiàn)污染物的有效識(shí)別方法［22-23］。該方法從樣品的生物效應(yīng)入手，僅針對(duì)活性樣品進(jìn)行組分分離及結(jié)構(gòu)鑒定，很大程度上降低了樣品的復(fù)雜性并縮小了篩選范圍，可直接快速地鎖定毒性貢獻(xiàn)化合物［24-25］。

利用EDA思路，基于第一代ITA系統(tǒng)，本課題組［26］建立了基于大鼠小腦顆粒神經(jīng)元細(xì)胞（CGNs）原代培養(yǎng)方法，通過毒物或樣品對(duì)CGNs暴露進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)，建立了神經(jīng)毒性效應(yīng)引導(dǎo)的復(fù)合污染物毒性篩查新方法，進(jìn)而應(yīng)用非靶標(biāo)有機(jī)質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)某化工廠附近的實(shí)際環(huán)境樣品進(jìn)行測定，在活性組分中鑒定出1種潛在的新型有機(jī)污染物—四溴雙酚A雙丙烯基醚（TBBPA-BAE）?；赥BBPA-BAE的毒性當(dāng)量和化學(xué)濃度，發(fā)現(xiàn)其在樣品中的濃度可以解釋實(shí)測發(fā)育神經(jīng)毒性的86%，表明該物質(zhì)是誘發(fā)潛在神經(jīng)毒性風(fēng)險(xiǎn)的主要效應(yīng)污染物。該研究為實(shí)際樣品中效應(yīng)物質(zhì)的識(shí)別奠定了堅(jiān)實(shí)的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

基于ITA平臺(tái)，本課題組［27］進(jìn)一步利用EDA技術(shù)對(duì)廣東貴嶼地區(qū)電子垃圾拆解地附近底泥中的雌激素效應(yīng)污染物進(jìn)行了篩查。通過體外MVLN細(xì)胞熒光素酶報(bào)告基因體系對(duì)樣品進(jìn)行雌激素效應(yīng)初篩，針對(duì)效應(yīng)樣品，利用反相制備色譜進(jìn)行組分的分離與制備，對(duì)所有組分進(jìn)行雌激素效應(yīng)檢測后篩選出活性組分，通過高分辨質(zhì)譜靶向和非靶向結(jié)構(gòu)識(shí)別，發(fā)現(xiàn)了雙酚A、己烯雌酚等7種物質(zhì)為雌激素效應(yīng)貢獻(xiàn)物，并對(duì)其污染來源及遷移規(guī)律進(jìn)行了解析。同時(shí)，本課題組［28］使用效應(yīng)導(dǎo)向分析策略鑒定了樣品中的多環(huán)芳烴受體激動(dòng)劑，選取小鼠肝癌細(xì)胞系CBG2．8D報(bào)告基因檢測法用于毒性的定量及毒性效力的測定，采用正相制備色譜對(duì)效應(yīng)樣品進(jìn)行組分分離，以降低樣品中化合物的復(fù)雜程度。借助氣相色譜-高分辨質(zhì)譜技術(shù)，結(jié)合毒理學(xué)數(shù)據(jù)庫比對(duì)，篩選并最終確定23種化學(xué)物質(zhì)為樣品中的多環(huán)芳烴受體激動(dòng)劑，其中二至五環(huán)的多環(huán)芳烴化合物是樣品中毒性效應(yīng)的主要來源。上述兩項(xiàng)研究均通過效應(yīng)導(dǎo)向分析策略揭示了電子垃圾拆解地區(qū)相關(guān)的毒性效應(yīng)因果化學(xué)物質(zhì)，為特征污染地區(qū)效應(yīng)化學(xué)品的監(jiān)控提供了重要的科學(xué)數(shù)據(jù)和應(yīng)用參考。

2.5 在環(huán)境分析與毒性檢測產(chǎn)業(yè)化及合作研究方面的應(yīng)用

基于成組毒理學(xué)分析儀的概念，本課題組提出了集約型自動(dòng)化小型機(jī)的創(chuàng)新思路與技術(shù)設(shè)計(jì)，擬研制不同樣品的特異毒性化學(xué)物質(zhì)篩選與識(shí)別個(gè)性化系統(tǒng)，面向環(huán)境保護(hù)及監(jiān)測、食品安全、軍事毒物分析等領(lǐng)域的不同檢測需求，實(shí)現(xiàn)該小型化系統(tǒng)的個(gè)性化定制并積極推動(dòng)其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。利用ITA系統(tǒng)，本課題組在樣品檢測與應(yīng)用方面與各研究機(jī)構(gòu)或企業(yè)合作開展了樣品中有毒物質(zhì)識(shí)別及特定毒性測試技術(shù)開發(fā)等研究，例如，與國內(nèi)知名企業(yè)合作開展了產(chǎn)品中毒性化學(xué)品的篩查與識(shí)別研究，與軍事醫(yī)學(xué)研究機(jī)構(gòu)合作開展有毒化學(xué)品的風(fēng)險(xiǎn)快速評(píng)估等工作。成組毒理學(xué)分析平臺(tái)可用于各類環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)、污染物篩選識(shí)別、食品安全、生物樣品、中藥試劑、化學(xué)品評(píng)估等復(fù)雜樣品的聯(lián)合研究。

3 總結(jié)與展望

成組毒理學(xué)分析儀是國際上首臺(tái)可用于實(shí)際樣品分析測試與毒性篩查的綜合平臺(tái)，可自動(dòng)化完成樣品前處理、組分分離與制備、多靶點(diǎn)毒性測試及效應(yīng)物質(zhì)結(jié)構(gòu)識(shí)別與鑒定，顯著提高了污染物識(shí)別及毒性評(píng)價(jià)的可靠性和效率，將大大推動(dòng)我國環(huán)境科學(xué)與毒理健康基礎(chǔ)研究的水平。為發(fā)揮其優(yōu)勢，展現(xiàn)其在環(huán)境與健康研究、食品安全、軍事及國家安全等領(lǐng)域的巨大應(yīng)用潛能，將從以下方面進(jìn)行改進(jìn)并推動(dòng)其應(yīng)用：

（1）特異響應(yīng)細(xì)胞的構(gòu)建及類器官毒性測試模型的建立。利用報(bào)告基因生物檢測技術(shù)或基因編輯技術(shù)，針對(duì)毒理學(xué)研究新興領(lǐng)域，構(gòu)建化合物特異效應(yīng)檢測細(xì)胞株和類器官毒性評(píng)價(jià)模型，并運(yùn)用于高通量自動(dòng)化檢測平臺(tái)，為快速篩查復(fù)雜樣品中健康風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)提供有效的生物效應(yīng)測試手段。

（2）新污染物篩查方法的開發(fā)及數(shù)據(jù)庫的建立。結(jié)合多種質(zhì)譜技術(shù)，發(fā)展適用于不同化合物類型的高靈敏識(shí)別與鑒定方法，以提高污染物發(fā)現(xiàn)效率?；谛挛廴疚锏奶卣髻|(zhì)譜信息，建立標(biāo)準(zhǔn)化污染物指紋數(shù)據(jù)庫，以適用于我國新型污染物的篩查研究。

（3）篩選通量的拓展及靈敏度的提高。基于已建立或正在開發(fā)的樣品分離與制備及毒性測試方法，拓展制備及測試通量，實(shí)現(xiàn)384或1 536微孔板的快速高通量測試。在拓展通量的同時(shí)，通過改進(jìn)優(yōu)化關(guān)鍵技術(shù)，提高毒性篩選的靈敏度，以適用于復(fù)雜介質(zhì)中低劑量有毒物質(zhì)的毒性效應(yīng)檢測。

（4）全流程標(biāo)準(zhǔn)化方法的建立及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)及測試法規(guī)，建立樣品全流程自動(dòng)化提取、制備、毒性測試及結(jié)構(gòu)鑒定的標(biāo)準(zhǔn)化方法，并獲得國家級(jí)認(rèn)證資質(zhì)，以應(yīng)用于工業(yè)化學(xué)品、中藥或合成藥物、食品、軍事毒物、突發(fā)事件毒物檢測等領(lǐng)域，建立成高效快速的測試平臺(tái)。