NO處理對采后映霜紅桃果實冷害及呼吸作用的影響

宋叢叢 趙垚垚 李 昂 林 瓊 段玉權

(中國農業(yè)科學院農產品加工研究所，北京 100193)

桃(PrunuspersicaL. Batsch)屬薔薇科(Rosaceae)李屬(Prunus)植物，在我國已有多年的栽培歷史，栽培區(qū)域廣泛，品種繁多，各國的栽培種先后由我國引入，目前在世界各地均有種植[1]。映霜紅是近幾年新培育的晚熟品種，果肉脆甜可口，清香宜人，果實硬度大,耐貯耐運，但冷藏期間極易受到冷脅迫，并表現出果肉褐變、木質化或絮敗，無法正常軟化等冷害癥狀，從而降低其商業(yè)價值，造成經濟損失[1-2]。

植物呼吸途徑主要包括糖酵解(glycolysis/embden-meyerh of pathway, EMP)、三羧酸(tricarboxylic acid, TCA)循環(huán)、磷酸戊糖(pentose phosphate pathway, PPP)途徑和電子傳遞途徑[3]。呼吸作用的強弱一般用呼吸強度來衡量，呼吸強度是影響保鮮、評價果實貨架期的重要因素和指標，是園藝產品最重要的品質特性。在呼吸躍變型果實中，呼吸途徑和呼吸強度在采后貯藏期間不斷發(fā)生變化。同時，果蔬采后的成熟衰老及耐藏性與呼吸速率和不同呼吸途徑的比例也密切相關[4]。朱玲玲等[5]發(fā)現褪黑素處理可以減緩青花菜的總呼吸速率，延緩青花菜的黃化衰老，這與改變青花菜EMP、TCA循環(huán)和PPP途徑的運行密切相關。Lin等[6]發(fā)現H2O2通過抑制龍眼果實PPP途徑，增強EMP和TCA循環(huán)途徑來提高果實呼吸速率，加速果肉分解并縮短果實貨架期。高等植物的線粒體具有兩條電子傳遞途徑，一是電子通過細胞色素氧化酶途徑從泛醌轉移到氧氣，該途徑產生腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)，另一條是通過替代氧化酶(alternative oxidase, AOX)途徑，不產生ATP[7]。研究表明在正常生長條件下，AOX途徑AOX蛋白水平極低，但大多數非生物脅迫(包括干旱、高鹽、低溫等)會明顯誘導AOX蛋白水平上調[8-9]。近年來，多項研究表明AOX有助于植物的抗冷脅迫[10-11]。因此，合理調控呼吸作用對果實采后貯藏保鮮具有重要意義。

一氧化氮(nitric oxide, NO)作為信號分子，參與呼吸作用、成熟衰老、細胞壁木質化、種子發(fā)芽等多種植物生理生化過程[12-13]。目前，NO用于果蔬保鮮已成為果蔬貯藏保鮮領域的熱門課題之一，許多園藝作物中，如香蕉[14]、芒果[15]、柑橘[16]、草莓[17]、伽師瓜[18]等，用一定濃度的外源NO或NO供體處理可以抑制果蔬貯藏期的呼吸速率，減輕冷害，延緩成熟衰老，延長貨架期，并改善果蔬采后貯藏品質。已有研究發(fā)現，NO可以通過提高果實抗氧化能力[15,19]，能量代謝[20]，保護細胞膜[21]，激活CBF(C-repeat binding transcription)抗冷途徑[22]來提高果實抗冷性。但NO通過對不同呼吸途徑之間的調控來提高果實抗冷性的研究鮮有報道。本研究以映霜紅桃為試驗材料，探究不同濃度NO理對不同呼吸途徑關鍵酶的活性及呼吸速率的調控作用，以期從NO對不同呼吸途徑影響的角度探討NO提高桃果實采后貯藏品質及延緩冷害的作用機理，為NO在桃采后貯藏保鮮中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

映霜紅桃，于2020年10月購自北京新發(fā)地水果批發(fā)市場，使用常溫貨車2 h內運回實驗室。挑選大小一致、無病蟲害、無機械損傷的桃果實作為試驗樣品。

NO氣體(純度99.9%)，N2氣體(純度99.9%)，三氯乙酸、間苯二酚、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)、2,6-二氯酚靛酚鈉(2,6-dichlorophenolindophenolsodium salt, DCIP)、吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate, PMS)、D-葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽、6-磷酸果糖(6-phosphate-fructose, 6-P-F)、琥珀酸，購自上海源葉生物科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)、蔗糖，購自國藥集團化學試劑有限公司；丙二醛(malondialdehyde content, MDA)含量檢測試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；植物細胞色素氧化酶(cytochrome oxidase，COX)酶聯免疫分析試劑盒、植物交替氧化酶(alternative oxidase，AOX)酶聯免疫分析試劑盒，購自上海酶聯生物科技有限公司；一氧化氮測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

Neofuge 15R臺式高速冷凍離心機，上海力申科學儀器有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；BIORAD680型全自動酶標儀，美國Biorad公司；F-950型便攜式乙烯/O2/CO2分析儀，北京陽光億事達科技有限公司；多功能高速球磨儀，五洲鼎盛北京科技有限公司；GY-4水果手持式硬度計，北京陽光億事達有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 材料處理 將挑選出的果實隨機分成4組，每組40個果，設3個生物學重復，共480個果實。處理方法：1)試驗組：通入N21～2 min排出熏蒸桶中空氣，分別加入5、10、15 μL·L-1NO熏蒸3 h；2)對照(CK)組：N2熏蒸3 h。熏蒸箱內放入10 mL的1% (w/v) KOH溶液吸收CO2。處理后放入溫度4±1℃、相對濕度90%～95%的冷庫貯藏，每隔7 d取一次樣并測定相關指標。

1.3.2 內源NO含量測定 準確稱取1 g桃組織，加入4 mL 磷酸緩沖液(pH值7.4)，冰浴勻漿。取20%勻漿液，于4℃、4 000×g條件下離心15 min，取上清液于冰上待測。內源NO含量測定參照一氧化氮(NO)測定試劑盒說明書。

1.3.3 冷害指數測定 根據Wang等[23]的評價方法。每隔7 d隨機從冷庫中取出果實，觀察果肉褐變面積，統(tǒng)計冷害指數(cold index, CI)。依據發(fā)病面積，分為4個等級：0級=正常(未發(fā)生褐變)；1級=極輕(褐變面積1%～25%)；2級=較輕(褐變面積26%～50%)；3級=嚴重(褐變面積51%～75%)；4級=極嚴重(褐變面積76%～100%)。冷害指數=∑[(級數×對應級別的果數)/(4×果實總數)]×100%。

1.3.4 硬度測定 根據千春錄等[24]的方法，采用GY-4水果手持式硬度計11.1 mm探針進行測定。在每個桃果實對稱兩側赤道位置取2個點，各削去厚度1 mm左右的果皮，進行測定，每個處理3次重復，取平均值。

1.3.5 呼吸速率測定 根據張小康等[20]的方法，每個處理取6個果，2個一組放入1.5 L保鮮盒中，密封2 h，用F-950型便攜式乙烯/O2/CO2分析儀檢測CO2濃度。呼吸速率用 mL·kg-1·h-1CO2表示。

1.3.6 葡萄糖磷酸異構酶(glucose-6-phosphate isomerase，GPI)活性測定 參照Zhang等[25]的方法并稍作修改。稱取0.1 g桃凍樣加入1 mL 0.05 mmol·L-1Tris-HCl，冰浴研磨。在4℃、12 000×g條件下離心30 min，取上清液于4℃保存待用。測定時取0.25 mL上清液，加入0.5 mL 10 mmol·L-16-磷酸葡萄糖。30℃水浴5 min，加入1 mL 10%三氯乙酸，4℃、 12 000×g離心15 min，取0.1 mL上清液加入2.5 mL 38% HCL和1 mL 0.1%間苯二酚，80℃水浴10 min。在520 nm波長下以6-P-F為標準物測定果實6-P-F含量以表示GPI活性。

1.3.7 琥珀酸脫氫酶(succinic dehydrogenase，SDH)活性、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G-6-PDH)和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-phosphogluconate dehydrogenase，6-PGDH)聯合活性測定 參照Zhang等[25]的方法并稍作修改。SDH活性測定：取7 μL磷酸鉀緩沖液，7 μL琥珀酸鈉，7 μL DCIP及175 μL蒸餾水組成反應液，置于30℃水浴中保溫10 min。測定酶活性前加入7 μL提取酶液，混勻。測定時加7 μL PMS，在600 nm波長下測定吸光度的變化。G-6-PDH和6-PGDH聯合活性測定：取180 μL測定介質(5 mmol·L-16-磷酸葡萄糖溶液，5 mmol·L-1MgCl2，5 mmol·L-1煙酰胺核苷酸，0.1 mol·L-1Tris-HCI)，加入20 μL樣品，以20 μL Tris-HCl的緩沖液作為對照，立即于340 nm波長下測定吸光度的增量。

1.3.8 COX和AOX活性測定 準確稱取0.1 g桃果實組織，加入1 mL 磷酸鈉緩沖液(pH值7.4)，冰浴勻漿。于4℃、8 000×g條件下離心30 min，取上清液于冰上待測。COX和AOX活性測定使用植物細胞色素氧化酶(COX)和植物交替氧化酶(AOX)酶聯免疫分析試劑盒，嚴格按照說明書操作。

1.4 數據分析

采用SPSS 24軟件對數據進行統(tǒng)計分析，顯著性分析采用最小顯著性差異法(least-significant difference, LSD)，試驗結果均表示為平均值±標準誤差，所得數據使用Origin 8.6軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 不同濃度NO處理對映霜紅桃內源NO含量的影響

圖1 不同濃度NO處理對映霜紅桃內源NO含量的影響Fig.1 Effect of NO treatment on the endogenous NO content of Yingshuanghong peach

圖2 不同濃度NO處理對映霜紅桃冷害癥狀(A)和冷害指數(B)的影響Fig.2 Effect of NO treatment on chilling injury symptoms (A) and index (B) of Yingshuanghong peach

由圖1可知，桃果實內源NO含量在整個貯藏過程中呈現先上升后下降的趨勢，貯藏21 d前，NO處理的桃果實內源NO含量顯著高于對照(P<0.05)。貯藏14 d時，10 μL·L-1NO和15 μL·L-1NO處理的桃果實內源NO含量是對照的1.7和1.62倍。貯藏35 d時，15 μL·L-1NO處理組內源NO含量顯著下降(P<0.05)，與10 μL·L-1NO處理組相比降低了43.17%。表明外源NO處理對內源NO的誘導存在濃度效應 ，即外源NO濃度低于10 μL·L-1時提高內源NO濃度，高于10 μL·L-1時抑制NO積累，其中10 μL·L-1NO 處理組效果最有效。

2.2 不同濃度NO處理對映霜紅桃冷害的影響

由圖2可知，不同濃度NO處理的桃果實冷害癥狀與冷害指數出現顯著差異(P<0.05)，且均呈現上升的趨勢。貯藏至21 d時，對照組的果肉開始出現冷害癥狀，果心呈現褐色，而NO處理延緩了冷害的發(fā)生。貯藏至35 d時，所有處理組果肉均出現明顯褐變，對照組的冷害指數達到74.07%，顯著高于NO處理組(P<0.05)，其中10 μL·L-1NO處理組的桃果實冷害癥狀最輕。由此可見，NO處理可以減輕桃果實采后冷藏期間的冷害癥狀，延緩冷害的發(fā)生，其中10 μL·L-1NO處理組效果最好。

2.3 不同濃度NO處理對映霜紅桃硬度的影響

由圖3可知，NO處理可以保持桃果實硬度，維持果實采后貯藏品質。對照和15 μL·L-1NO處理組的硬度在貯藏 21 d 顯著下降(P<0.05)，而后提高，這可能是由于冷害使果實無法正常后熟。5 μL·L-1和10 μL·L-1NO處理組桃果實硬度在貯藏期間持續(xù)下降，貯藏21 d時，10 μL·L-1NO處理組的硬度比對照組高26.9%，比15 μL·L-1NO處理組高38.2%。表明適當濃度的NO處理可以維持桃果實貯藏期間的硬度，而高濃度的NO處理則影響果實采后正常軟化。

圖3 不同濃度NO處理對映霜紅桃硬度的影響Fig.3 Effect of NO treatment on firmness of Yingshuanghong peach

2.4 不同濃度NO處理對映霜紅桃呼吸速率的影響

由圖4可知，隨著貯藏時間的延長，桃果實的呼吸速率呈現先上升后下降的趨勢。在貯藏21 d時達到呼吸高峰，且10 μL·L-1NO處理組的呼吸速率顯著低于其他處理(P<0.05)，峰值為7.46 mL·kg-1·h-1。而15 μL·L-1NO處理促進了果實采后的呼吸作用，峰值為9.55 mL·kg-1·h-1。由此可見，不同濃度的NO對桃果實的呼吸速率影響不同，10 μL·L-1NO處理可以顯著抑制桃果實的呼吸速率(P<0.05)，延緩果實成熟衰老。

圖4 不同濃度NO處理對映霜紅桃呼吸速率的影響Fig.4 Effect of NO treatment on respiration rate of Yingshuanghong peach

2.5 不同濃度NO處理對映霜紅桃呼吸途徑關鍵酶的影響

葡萄糖磷酸異構酶(GPI)是糖酵解途徑的關鍵酶，其活性由6-P-F含量來表示。由圖5-A可知，NO處理可以抑制桃果實6-P-F含量的升高，貯藏前14 d均呈現下降的趨勢。貯藏7 d時，對照組6-P-F含量為12.53 g·kg-1，而10 μL·L-1NO處理組含量為10.05 g·kg-1，顯著低于對照組(P<0.05)。琥珀酸脫氫酶(SDH)是TCA循環(huán)途徑的關鍵酶。由圖5-B可知，隨著貯藏時間的延長，各處理SDH活性均呈現先上升后下降趨勢，對照和10 μL·L-1NO處理組在21 d達到最高，分別為317.28和251.59 U·g-1。5 μL·L-1和15 μL·L-1NO處理組桃果實SDH活性在28 d達到最大值，顯著高于10 μL·L-1NO處理(P<0.05)。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PDH)和 6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-PGDH)是磷酸戊糖途徑的關鍵酶。由圖5-C可知，貯藏21 d前，NO處理顯著提高了G-6-PDH和6-PGDH聯合活性(P<0.05)。貯藏7和14 d時，10 μL·L-1NO處理比對照高49.43%和23.16%。貯藏28 d后，10 μL·L-1NO和15 μL·L-1NO處理的桃果實G-6-PDH和6-PGDH聯合活性呈下降趨勢，顯著低于其他組(P<0.05)。以上研究結果表明，10 μL·L-1NO處理可以抑制桃果實冷藏期間GPI活性和SDH活性，提高G-6-PDH和6-PGDH聯合活性，進而影響桃果實的呼吸速率。

2.6 不同濃度NO處理對映霜紅桃電子傳遞途徑關鍵酶的影響

圖5 不同濃度NO處理對映霜紅桃6-磷酸果糖含量(A)、SDH活性(B)、G-6-PDH和6-PGDH聯合活性(C)的影響Fig.5 Effect of NO treatment on 6-P-F content(A), SDH (B), G-6-PDH and 6-PGDH (C) activity of Yingshuanghong peach

圖6 不同濃度NO處理對映霜紅桃COX活性(A)和AOX活性(B)的影響Fig.6 Effect of NO treatment on COX (A) and AOX (B) activity of Yingshuanghong peach

由圖6-A可知，對照組桃果實COX活性在貯藏28 d內持續(xù)處于較高水平，在貯藏35 d時緩慢下降。5 μL·L-1NO處理顯著抑制了桃果實貯藏前期的COX活性(P<0.05)，在7和14 d分別比對照低17.03%和19.16%。而15 μL·L-1NO處理組COX活性在貯藏14～21 d下降，21 d時，COX活性為0.83 U·L-1，分別比對照和10 μL·L-1NO處理組低19.65%和16.73%。由圖6-B可知，10 μL·L-1NO處理顯著提高了桃果實的AOX活性(P<0.05)，在貯藏21和28 d分別比對照高20.25%和27.70%。與對照相比，15 μL·L-1NO處理也提高了映霜紅桃的AOX活性，但差異不顯著(P>0.05)。由此可見，NO處理可以抑制桃果實冷藏期間的COX活性，提高AOX活性，其中，10 μL·L-1NO處理組效果最好。

3 討論

桃果實冷害的主要癥狀是果實內部褐變，伴隨著乙烯生成的抑制和無法正常軟化，導致果肉出現粉狀質地[26-27]。而緩解冷害是一氧化氮在果蔬保鮮中最成熟的作用之一。王魯陽等[28]研究表明，60 μL·L-1NO處理可以減輕哈密瓜果實冷害發(fā)病率與冷害指數。Jiao等[29]使用NO供體硝普鈉(sodium nitroprusside, SNP)處理提高了桃果實耐冷性，減輕了果實冷害。同時，在番茄果實中也發(fā)現，通過褪黑素處理提高果實內源NO含量，可以抑制ROS、MDA積累，從而提高果實耐冷性[30]。本研究表明，在貯藏21 d前，10 μL·L-1NO處理的映霜紅桃果實內源NO含量與對照組相比顯著提高(P<0.05)，且硬度下降速度緩慢，其冷害癥狀與冷害指數明顯低于對照組，這與使用NO供體硝普鈉浸泡桃果實得到的結果一致[29]。但是NO的處理效果具有濃度效應，不同植物和組織對外源NO處理的濃度要求也不同。研究發(fā)現低濃度NO處理可以緩解鎘脅迫對草地早熟禾造成的傷害，而高濃度NO處理抑制了早熟禾種子萌發(fā)及幼苗正常生長[31]。同樣，常雪花等[32]研究發(fā)現，高濃度(200 μL·L-1)NO處理不僅不能保持果實的貯藏品質，反而會加速貯藏期間冬棗果實的品質劣變，導致果實出現較為嚴重的腐爛。在本試驗中，隨著貯藏期間桃果實果肉褐變的出現，對照和15 μL·L-1NO處理組的果實在貯藏21 d后硬度顯著升高(P<0.05)，使果實無法正常軟化，且果肉褐變嚴重，影響果實品質。因此，外源NO處理通過提高桃果實內源NO含量，維持果實正常軟化后熟，減輕桃果實冷害；過高濃度的NO處理會加速果實衰老，而對于映霜紅桃果實，10 μL·L-1NO處理效果最優(yōu)。

呼吸作用被認為是影響采后果實成熟衰老及貯藏品質的重要因素。有研究表明，采后果實的品質變化與呼吸速率密切相關，NO處理可以降低果實的呼吸速率，抑制生理代謝，延緩果實冷害，保持果實較高的品質[4,33]。范蓓等[34]研究發(fā)現，NO處理可以延緩芒果果實呼吸高峰的出現，抑制冷害的發(fā)生。裴嘩嘩等[35]發(fā)現不同濃度乙烯處理會提高果實呼吸速率，加速果實冷害的發(fā)生。在本試驗中，桃果實呼吸速率高峰出現在貯藏21 d，10 μL·L-1NO處理組顯著低于其他處理，且冷害癥狀和冷害指數最低，而15 μL·L-1NO處理未抑制果實呼吸速率的升高，反而促進了果實的品質劣變，這與不同濃度NO處理伽師瓜[18]的結果一致。

植物呼吸代謝包括多條代謝途徑，而GPI、SDH、G-6-PDH和6-PGDH分別為糖酵解、TCA循環(huán)和磷酸戊糖途徑的關鍵酶。本研究結果表明，不同濃度NO處理桃果實不同程度地降低了GPI和SDH活性，提高了G-6-PDH和6-PGDH聯合活性，其中10 μL·L-1NO處理的效果最好。桃果實呼吸速率變化趨勢與GPI和SDH活性變化趨勢一致，表明NO可以通過調控呼吸途徑關鍵酶的活性來調節(jié)各呼吸途徑呼吸速率強弱，從而影響總呼吸速率，這與NO處理在伽師瓜[18]、番茄[4]中的研究結果相似。COX作為細胞色素途徑的關鍵酶，對果實能量代謝具有調控作用，本試驗不同濃度NO處理的果實COX活性在貯藏期間無顯著變化(P>0.05)。AOX是抗氰呼吸途徑的關鍵酶，其與果實的采后處理方式、貯藏條件、品質變化等密切相關。研究發(fā)現，NO處理可以提高AOX活性和基因表達水平，從而增強果實耐寒性[29]。Wang等[36]研究發(fā)現，NO處理可以通過提高G-6-PDH和6-PGDH活性來增強香蕉果實耐冷性。在本研究中，10 μL·L-1NO處理維持了較高的AOX活性、G-6-PDH和6-PGDH活性，以及較低的果實冷害癥狀與冷害指數，這與通過外源黃體酮處理提高果實AOX活性和基因表達來延緩香蕉冷害發(fā)生的結果一致[14]。王雅楠[37]研究發(fā)現誘導李果實抗氰呼吸，提高AOX的活性，可以延緩李果實冷害，提高抗冷能力。綜上所述，一氧化氮處理通過提高映霜紅桃果實內源NO含量，增強了抗氰呼吸和磷酸戊糖途徑的呼吸速率，降低了糖酵解、TCA循環(huán)、細胞色素氧化酶途徑的呼吸速率，從而降低了總呼吸速率，減少了果實的硬度損失，提高了果實抗冷性。

4 結論

本研究結果表明，10 μL·L-1NO處理可以延緩桃果實冷藏期間冷害的發(fā)生，降低冷害指數，這與NO處理參與調控桃果實呼吸作用密切相關。NO處理可通過降低糖酵解途徑、TCA循環(huán)途徑、細胞色素氧化酶途徑關鍵酶的活性，降低果實的呼吸速率，抑制桃果實的采后生理活動。同時，NO處理通過提高G-6-PDH和6-PGDH聯合活性及AOX活性增強磷酸戊糖途徑和抗氰呼吸途徑，提高果實冷藏期間的耐冷性，減輕果實冷害，維持貯藏品質。因此，外源NO處理在延長桃果實采后貯藏期及維持果實品質方面具有較好的應用前景。