李 梁 李春霖 王貞紅 劉振東 聶 晶 張永志 袁玉偉,*
(1 西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院/西藏特色農(nóng)牧資源研發(fā)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,西藏 林芝 860000;2 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品信息溯源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310021;3 西藏農(nóng)牧學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院,西藏 林芝 860000)
我國(guó)西藏人民飲茶歷史悠久,茶葉對(duì)于藏區(qū)人民的日常飲食起著重要作用[1]。過(guò)去西藏茶葉產(chǎn)量較低,主要依賴(lài)從四川等地運(yùn)輸。近年來(lái),西藏高度重視茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展,把茶產(chǎn)業(yè)作為促進(jìn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和助推脫貧攻堅(jiān)的重要產(chǎn)業(yè)之一[2]。西藏茶葉主產(chǎn)于林芝市,2019年林芝市茶園種植面積為4.5萬(wàn)畝,2020年春季干毛茶產(chǎn)量約1.55萬(wàn)公斤,帶動(dòng)1 400余人人均增收3 445元,茶產(chǎn)業(yè)已成為西藏人民致富的“金葉子”[3]。西藏主要生產(chǎn)紅茶、綠茶和黑茶類(lèi)產(chǎn)品,由于高海拔和獨(dú)特的地理環(huán)境,西藏茶葉品質(zhì)較優(yōu),香氣豐富,滋味醇厚,具有高原特色。然而,西藏茶葉的產(chǎn)地特征尚不清楚,市場(chǎng)中可能出現(xiàn)的假冒標(biāo)識(shí)問(wèn)題,對(duì)西藏茶葉的貿(mào)易公平和品牌保護(hù)產(chǎn)生不利影響。因此,挖掘西藏茶葉的產(chǎn)地特征,開(kāi)展溯源機(jī)理研究對(duì)西藏茶葉質(zhì)量監(jiān)管和產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。
植物穩(wěn)定同位素值(δ13C、δ15N、δ2H和δ18O)與栽培地的氣候環(huán)境和栽培方式等因素密切相關(guān)[4-5]。已有研究表明,茶葉中穩(wěn)定同位素存在一定的地域差異,具有特征指示性。Liu等[6]研究發(fā)現(xiàn),浙江和山東茶葉中穩(wěn)定同位素比率有明顯差異,結(jié)合多元素和化學(xué)計(jì)量學(xué)方法,能夠?qū)Ξa(chǎn)地進(jìn)行有效判別。Jin等[7]分析了福建安溪和武夷山茶葉中穩(wěn)定同位素比率,發(fā)現(xiàn)兩地樣品差異顯著。植物穩(wěn)定同位素在不同地域表現(xiàn)的差異主要是由環(huán)境和氣候因子的變化導(dǎo)致的,這些因子通過(guò)調(diào)控植物生理過(guò)程從而引起同位素特征發(fā)生改變[8]。目前已有相關(guān)研究探索農(nóng)產(chǎn)品中穩(wěn)定同位素與環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)性。如Camin等[9]測(cè)定了意大利葡萄酒樣本的穩(wěn)定同位素比率和環(huán)境氣候因子,發(fā)現(xiàn)δ18O值與氣候和地理位置信息相關(guān)性最強(qiáng);Akamatsu等[10]統(tǒng)計(jì)分析了日本水稻中δ13C和δ18O值與環(huán)境因子之間的關(guān)系,結(jié)果表明灌漿期的日最低氣溫是影響大米同位素的主要因素;Wang等[11]研究了氣候、地形和土壤等生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)香蕉同位素組成的影響,發(fā)現(xiàn)降水和氣溫對(duì)δ18O值影響較大。已有研究發(fā)現(xiàn),茶葉中穩(wěn)定同位素受到環(huán)境溫度和光照強(qiáng)度的影響[12],δ2H值與氣溫、光照和降水量呈現(xiàn)顯著相關(guān)性[13]。上述研究對(duì)探索茶葉同位素特征與環(huán)境因子關(guān)系具有一定的借鑒意義。
西藏茶葉作為我國(guó)特色農(nóng)產(chǎn)品,其產(chǎn)地同位素特征和環(huán)境影響因素尚不明確。本研究通過(guò)分析西藏不同海拔地區(qū)茶葉的同位素特征,研究西藏茶葉與我國(guó)四大主產(chǎn)區(qū)(江北茶區(qū)、江南茶區(qū)、華南茶區(qū)、西南茶區(qū))茶葉的同位素差異,挖掘環(huán)境因子對(duì)茶葉中同位素的影響,旨在為西藏茶葉品牌保護(hù)提供技術(shù)支撐和科學(xué)依據(jù)。
本試驗(yàn)材料為93份茶葉樣品,收集于2017年4月,來(lái)自全國(guó)12個(gè)省,包括27個(gè)地市及自治州,覆蓋我國(guó)江北(山東、陜西)、江南(安徽、浙江)、華南(福建、廣東、海南)和西南(貴州、四川、云南、重慶)四大茶區(qū),其中江北茶區(qū)樣品9個(gè)、江南茶區(qū)樣品21個(gè)、華南茶區(qū)樣品15個(gè)、西南茶區(qū)樣品30個(gè)。西藏自治區(qū)樣品18個(gè),取自林芝市不同海拔的3個(gè)取樣點(diǎn),其中低海拔(750 m)樣品5個(gè)、中海拔(1 250 m)樣品8個(gè)、高海拔(2 120 m)樣品5個(gè)。所有樣品均于2017年春季按照綠茶工藝加工制成。樣品分布情況見(jiàn)圖1。
圖1 樣品分布及氣象信息收集圖Fig.1 Collection map of tea samples and climate information
穩(wěn)定同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):IAEA-CH-6(蔗糖,δ13CV-PDB= -10.45‰±0.03‰)、IAEA-N-2(硫酸銨,δ15Nair=20.30‰±0.20‰),購(gòu)于國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)(international atomic energy agency, IAEA,奧地利);B2155(酪蛋白,δ13CV-PDB=-26.98‰±0.13‰,δ15Nair=5.94‰±0.08‰),購(gòu)于英國(guó)Elemental Microanalysis公司;USGS64(甘氨酸,δ13CV-PDB=-40.81‰±0.04‰)、USGS40(δ15Nair=-4.52‰±0.06‰)、USGS54(加拿大松,δ2HV-SMOW=-150.40‰±1.10‰,δ18OV-SMOW=17.79‰±0.15‰)、USGS56(南非紅象牙木,δ2HV-SMOW=-44.0‰±1.8‰,δ18OV-SMOW=27.23‰±0.03‰),購(gòu)于美國(guó)地質(zhì)勘探局Reston同位素實(shí)驗(yàn)室。
XP6型天平,瑞士Mettler-Toledo公司;Vario PYRO cube、Vario Isotope cube型元素分析儀,Isoprime 100型、Biovision穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜儀,德國(guó)Elementar公司;HR2864粉碎機(jī),中國(guó)飛利浦電子公司。
1.3.1 樣品預(yù)處理 茶葉樣品烘干至含水量不變,經(jīng)粉碎機(jī)粉碎處理,過(guò)80目網(wǎng)篩,避光常溫保存,待測(cè)。
1.3.2 碳、氮穩(wěn)定同位素檢測(cè) 稱(chēng)取茶葉樣品3.0~4.0 mg,放入錫箔舟中包樣,按順序放入元素分析儀固體樣品自動(dòng)進(jìn)樣盤(pán)。樣品中的碳、氮元素經(jīng)燃燒還原后分別轉(zhuǎn)化為純凈的CO2和N2氣體,進(jìn)入同位素比率質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。元素分析儀的燃燒管主要填料為WO3,溫度保持1 150℃,還原管填料為Cu,溫度保持850℃,載氣為高純氦氣(He, 99.999%),流量為250 mL·min-1,參考?xì)怏w為CO2和N2。元素分析儀和熱導(dǎo)檢測(cè)器(thermal conductivity detector, TCD)檢測(cè)流速分別為230 mL·min-1和40~50 mL·min-1。氧氣流量為40 mL·min-1,注氧時(shí)間70 s。C模式質(zhì)譜參數(shù):加速電壓為3 964 V,捕集電流為200 μA,磁場(chǎng)強(qiáng)度為4 000 mA;N模式質(zhì)譜參數(shù):加速電壓為4 162 V,捕集電流為400 μA,磁場(chǎng)強(qiáng)度為3 000 mA。樣品檢測(cè)前進(jìn)行氣密性檢測(cè)、離子源真空度和穩(wěn)定性測(cè)試,CO2參考?xì)鈮毫?2 psi,N2參考?xì)鈮毫? psi。檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[6]和[13]。
1.3.3 氫、氧穩(wěn)定同位素檢測(cè) 稱(chēng)取茶葉樣品0.5 mg,放入銀舟中包樣,按順序放入元素分析儀固體樣品自動(dòng)進(jìn)樣盤(pán)。樣品中的氫、氧元素經(jīng)高溫裂解后分別轉(zhuǎn)化為H2和CO氣體,進(jìn)入同位素比率質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。元素分析儀裂解爐溫度保持1 450℃,氦氣吹掃流量為150 mL·min-1,參考?xì)怏w為CO和H2。H模式質(zhì)譜參數(shù):加速電壓為4 497 V,捕集電流為600 μA,磁場(chǎng)強(qiáng)度為890 mA;O模式質(zhì)譜參數(shù):加速電壓為 4 191 V, 捕集電流為200 μA,磁場(chǎng)強(qiáng)度為3 000 mA。樣品檢測(cè)前進(jìn)行氣密性檢測(cè)、離子源真空度和穩(wěn)定性測(cè)試,H2參考?xì)鈮毫?0 psi,CO參考?xì)鈮毫?5 psi。檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[6]和[13]。
1.3.4 穩(wěn)定同位素比率計(jì)算
(1)
式中,R樣品為檢測(cè)樣品中重同位素與輕同位素豐度之比,即13C/12C、15N/14N、2H/1H、18O/16O;R標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品中重同位素與輕同位素豐度比[14]。測(cè)試數(shù)據(jù)均采用兩點(diǎn)法進(jìn)行校正。
在試驗(yàn)樣品采集點(diǎn)中,選取16個(gè)采樣點(diǎn)(圖1)進(jìn)行氣象信息采集,涵蓋了西藏和我國(guó)茶葉主產(chǎn)區(qū),收集當(dāng)?shù)丨h(huán)境氣象信息,包括平均相對(duì)濕度、最小相對(duì)濕度、日降雨量、日照時(shí)間、平均氣溫、最高氣溫、最低氣溫,每個(gè)環(huán)境因子均包括采樣當(dāng)月(2017年4月)和采樣前3個(gè)月(2017年1月至4月)的2組平均數(shù)據(jù),共計(jì)14項(xiàng)環(huán)境數(shù)據(jù)。
采用正態(tài)檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)判斷數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布和方差齊性,采用單因素方差分析中的Duncan法對(duì)不同海拔樣品的同位素比率進(jìn)行差異顯著性分析,采用Tamhane’s T2方法對(duì)不同產(chǎn)區(qū)樣品的同位素比率進(jìn)行差異顯著性分析,在IBM SPSS Statistics 21軟件中進(jìn)行。
通過(guò)偏最小二乘法(partial least squares,PLS)分別建立4種同位素比率與環(huán)境因子之間的關(guān)聯(lián)性模型,以樣品14項(xiàng)環(huán)境因子數(shù)據(jù)為自變量,穩(wěn)定同位素比率為因變量,建立定量預(yù)測(cè)模型。模型共包含16個(gè)樣本,隨機(jī)選取其中14個(gè)樣本為訓(xùn)練集,2個(gè)樣本為預(yù)測(cè)集。模型結(jié)果根據(jù)所有樣品的決定系數(shù)(R2)、均方根誤差(root mean square error,RMSE)和相對(duì)預(yù)測(cè)偏差(relative prediction deviation,RPD)表示,計(jì)算方法見(jiàn)公式(2)~(4)[15-16]。結(jié)合連續(xù)變量投影法進(jìn)行變量重要性分析(variable importance for projection,VIP),并計(jì)算自變量的標(biāo)準(zhǔn)化相關(guān)系數(shù)。PLS和VIP在XLSTAT 2019軟件中進(jìn)行。
(2)
(3)
(4)
式中,N為樣品數(shù)量,ypred為同位素預(yù)測(cè)值,yref為同位素檢測(cè)值,yref為同位素檢測(cè)值的平均數(shù),SD為同位素檢測(cè)值的標(biāo)準(zhǔn)差。
本研究共采集西藏茶葉樣品18份,穩(wěn)定同位素比率分析結(jié)果見(jiàn)表1。由于西藏海拔差異較大,樣品取自3個(gè)不同海拔的取樣點(diǎn),不同海拔的樣品穩(wěn)定同位素比率差異整體顯著。δ13C隨海拔變化最為明顯,茶葉樣品中δ13C值隨海拔高度的升高而減小。低海拔地區(qū)(750 m)樣品δ13C值介于-28.8‰ ~ -27.8‰ 之間,平均值為-28.3‰;中海拔地區(qū)(1 250 m) 樣品δ13C值介于-30.1‰ ~ -28.9‰之間,平均值為-29.6‰;高海拔地區(qū)(2 120 m)樣品δ13C值介于-31.9‰ ~ -30.9‰之間,平均值為-31.2‰。δ15N 值在低海拔地區(qū)樣品中最高,平均值為3.0‰,顯著高于中海拔(0.9‰)和高海拔地區(qū)(0.0‰)的樣品。δ2H和δ18O隨海拔變化趨勢(shì)一致,均為低海拔樣品最高,分別為-48.8‰和27.3‰,中海拔樣品最低,分別為-100.9‰和23.4‰。
西藏由于其獨(dú)特的地理位置,與我國(guó)茶葉主產(chǎn)區(qū)在環(huán)境氣候條件上差異明顯,穩(wěn)定同位素比率也呈現(xiàn)一定的特征差異。將西藏樣品分別與江北、江南、華南、西南(除西藏)四大主產(chǎn)區(qū)代表性樣品進(jìn)行差異顯著性分析,結(jié)果見(jiàn)圖2。西藏樣品中δ13C值特征最為明顯,介于-31.9‰ ~ -27.8‰之間,平均值為-29.7‰,顯著低于其他主產(chǎn)區(qū)樣品。δ15N值介于-2.2‰ ~ 5.0‰之間,平均值為1.2‰,與其他產(chǎn)區(qū)樣品無(wú)顯著差異。δ2H值介于-111.5‰ ~ -40.5‰ 之間,平均值為-83.3‰,顯著低于西南、江南和江北產(chǎn)區(qū)樣品,與華南產(chǎn)區(qū)樣品無(wú)顯著差異。δ18O值介于22.2‰ ~ 27.6‰之間,平均值為25.3‰,顯著高于華南產(chǎn)區(qū)樣品,與其他產(chǎn)區(qū)樣品均無(wú)顯著差異。
注:**代表P<0.01,*代表P<0.05,ns代表P>0.05。Note: **represent P<0.01, * represent P<0.05, ns represent P>0.05.圖2 西藏與四大主產(chǎn)區(qū)茶葉中穩(wěn)定同位素箱線圖Fig.2 Boxplot of stable isotopes in tea samples from Tibet and four main producing area
為探索西藏茶葉同位素特征形成的氣候環(huán)境影響,本研究選取西藏和我國(guó)茶葉主產(chǎn)區(qū)范圍內(nèi)16個(gè)取樣點(diǎn)進(jìn)行環(huán)境因子數(shù)據(jù)采集和茶葉同位素比率檢測(cè),分別將δ13C、δ15N、δ2H、δ18O與14項(xiàng)環(huán)境因子數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS分析,定量預(yù)測(cè)模型結(jié)果見(jiàn)表2。其中R2和RPD越高,RMSE越低,模型效果越優(yōu)[15-16]。4個(gè)模型的R2均高于0.55,RMSE均低于5.09,RPD介于1.51~3.08之間。δ2H模型預(yù)測(cè)效果最優(yōu),R2和RPD均最高,分別為0.90和3.08,表明δ2H與14項(xiàng)環(huán)境因子關(guān)聯(lián)性更強(qiáng)。由于δ2H絕對(duì)值較其他同位素比率偏大,而RMSE受自變量絕對(duì)值影響,導(dǎo)致δ2H模型RMSE最高,為5.09。其次為δ13C模型,R2為0.84,RPD為2.63,RMSE最低,為0.48。δ18O模型R2為0.75,RMSE為0.64,RPD為2.13。δ15N模型預(yù)測(cè)效果最差,R2和RPD均最低,分別為0.55和1.51,RMSE為1.20,表明δ15N與14項(xiàng)氣候環(huán)境因子關(guān)聯(lián)性較弱。
表1 西藏不同海拔茶葉樣品穩(wěn)定同位素分布表Table 1 Distribution of stable isotopes in tea samples from Tibet with different altitudes /‰
對(duì)模型進(jìn)一步進(jìn)行變量重要性分析和標(biāo)準(zhǔn)化相關(guān)系數(shù)分析,VIP值大于1的環(huán)境因子對(duì)同位素比率影響較大[17],結(jié)果見(jiàn)圖3。δ13C主要受日照和氣溫影響,重要性最高的3個(gè)因子為4月(采樣當(dāng)月)日照時(shí)數(shù)、平均氣溫和最低氣溫,3個(gè)變量因子的標(biāo)準(zhǔn)化相關(guān)系數(shù)均為正值,表明這3個(gè)因子與δ13C成正相關(guān)。在δ15N預(yù)測(cè)模型中,4月日照時(shí)數(shù)、1-4月(采樣前3個(gè)月)日照時(shí)數(shù)和1-4月平均相對(duì)濕度影響較大。δ2H模型顯示,日照、氣溫和相對(duì)濕度均會(huì)對(duì)δ2H影響較大,VIP大于1的因子以相對(duì)濕度為主,VIP最高的3個(gè)因子分別為4月日照時(shí)數(shù)、1-4月最高氣溫和1-4月最小相對(duì)濕度。δ18O則主要受氣溫影響,VIP大于1的因子主要包括1-4月和4月的最高氣溫、平均氣溫和最低氣溫,6個(gè)因子的標(biāo)準(zhǔn)化相關(guān)系數(shù)均為負(fù)值,表明這6個(gè)因子與δ18O成負(fù)相關(guān)。
表2 偏最小二乘模型結(jié)果Table 2 Results of partial least squares models
圖3 基于偏最小二乘的變量重要性分析與標(biāo)準(zhǔn)化相關(guān)系數(shù)Fig.3 Variable importance for projection and standardized coefficients based on partial least squares
本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),相較于其他同位素比率,西藏茶葉中δ13C值隨海拔變化規(guī)律最明顯,茶葉中δ13C值隨海拔升高而降低。經(jīng)PLS-VIP分析表明,δ13C值主要受采樣當(dāng)月日照和氣溫影響,且δ13C值與日照時(shí)數(shù)和平均氣溫成正相關(guān)。而氣溫隨海拔的升高而降低,因此茶葉中δ13C值隨海拔的升高而降低。在西藏與四大主產(chǎn)區(qū)茶葉同位素比率比較研究中發(fā)現(xiàn),西藏茶葉δ13C值顯著低于四大主產(chǎn)區(qū)茶葉。而西藏林芝市4月平均氣溫僅10℃,較其他主產(chǎn)區(qū)偏低。該結(jié)果與PLS分析中δ13C值與氣溫成正相關(guān)的結(jié)果一致。已有研究分析了廬山不同海拔茶樹(shù)光合響應(yīng)的差異,結(jié)果表明茶樹(shù)在低海拔處的光合作用和光系統(tǒng)Ⅱ活性顯著低于高海拔處[18]。此外,氣溫和CO2濃度升高能夠明顯提高茶樹(shù)葉片的光合效率[19],而光合作用與植物13C穩(wěn)定同位素分餾密切相關(guān)[20-21],進(jìn)一步解釋了茶葉δ13C值隨海拔升高而降低的原因。
經(jīng)單因素方差分析,西藏不同海拔樣品中δ15N值差異不如δ13C值明顯,而西藏與不同產(chǎn)區(qū)茶葉樣品中δ15N值差異不顯著,并且在PLS分析中δ15N值與環(huán)境氣象因子關(guān)聯(lián)性較弱。這說(shuō)明相較其他同位素比率,δ15N值受氣候影響較小。已有研究表明,植物中δ15N值與栽培和土壤關(guān)系更為密切,主要受到栽培方式[22]、土壤類(lèi)型[23]、根系情況[24]等多方面影響。本研究有待進(jìn)一步收集西藏茶葉種植環(huán)境樣品,探究土壤背景、栽培方式以及肥料種類(lèi)對(duì)茶葉同位素的影響。
不同海拔茶葉樣品中δ2H和δ18O值分布規(guī)律較為一致,但西藏茶葉與主產(chǎn)區(qū)茶葉同位素比較中,δ2H和δ18O值分布規(guī)律有較大差異,推測(cè)與環(huán)境影響因素有關(guān)。已有研究表明,δ2H值與降雨、氣孔開(kāi)合等密切相關(guān),具有顯著的緯度效應(yīng)、海拔效應(yīng)和內(nèi)陸效應(yīng)[25]。本研究PLS結(jié)果表明,δ2H與環(huán)境氣象因子關(guān)聯(lián)性最強(qiáng),利用14項(xiàng)環(huán)境因子能對(duì)δ2H進(jìn)行定量預(yù)測(cè)。VIP結(jié)果顯示,光照、氣溫、濕度多種環(huán)境因素均會(huì)影響茶葉中δ2H值,VIP大于1的變量中以相對(duì)濕度為主。該結(jié)果與已有研究結(jié)果較為一致,如Deng等[13]利用同位素和多元素技術(shù)對(duì)我國(guó)綠茶進(jìn)行產(chǎn)地溯源,探究了不同產(chǎn)地綠茶的同位素特征及其與氣候環(huán)境的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)茶葉中δ2H值與氣溫、光照和降水量相關(guān)性顯著;Liu等[26]研究了不同產(chǎn)地綠茶的穩(wěn)定同位素比率,發(fā)現(xiàn)湖北的綠茶樣品中δ2H和δ18O值顯著高于貴州和廣東省樣品,推測(cè)與環(huán)境相對(duì)濕度和蒸騰速率等因素有關(guān)。本研究PLS-VIP分析結(jié)果表明,氣溫是茶葉中δ18O值的主要影響因素,影響δ18O值的氣溫包括了采樣當(dāng)月和采樣前3個(gè)月的平均氣溫、最低氣溫和最高氣溫。此外,除了氣溫對(duì)δ18O值的影響外,也已有研究表明植物纖維素中δ18O值與羰基和水之間的平衡同位素效應(yīng)等因素相關(guān)[27]。
本研究結(jié)果表明,西藏茶葉中穩(wěn)定同位素比率具有一定的海拔規(guī)律和區(qū)域特征,其中δ13C值特征最為明顯,隨海拔升高而降低,顯著低于其他主產(chǎn)區(qū)樣品。茶葉穩(wěn)定同位素比率均受到環(huán)境因子影響,其中δ2H值與氣象環(huán)境關(guān)聯(lián)性最強(qiáng),主要與相對(duì)濕度等因素相關(guān)。在同位素特征分析的基礎(chǔ)上,后續(xù)研究可結(jié)合代謝組學(xué)、光譜學(xué)、質(zhì)譜學(xué)等技術(shù),進(jìn)一步挖掘西藏茶葉品質(zhì)特征,助力西藏茶葉品牌建設(shè)與推廣,推動(dòng)西藏茶產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展。