基于Dual RNA-seq分析的褪黑素影響蘿卜與鏈格孢菌互作的作用研究

李經(jīng)緯 夏 銘 黃廷敏 祖貴東 陸芳麗 屈立武 張萬萍,*

(1 貴州大學(xué)蔬菜研究院，貴州 貴陽 550000；2 貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550000；3 威寧縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 畢節(jié) 551700；4 貴州省農(nóng)業(yè)信息中心，貴州 貴陽 550000)

蘿卜(RaphanussativusL.)是重要的十字花科蔬菜，其可持續(xù)性生產(chǎn)受蕓薹鏈格孢菌(Alternariabrassicae)引起的黑斑病的威脅[1]，發(fā)病時植株各部位形成黑褐色、具同心輪紋的近圓形病斑，嚴重影響蘿卜光合同化效率和商品性[2]。鏈格孢菌適應(yīng)力強、傳播快，目前主要依賴化學(xué)藥劑防治，但大量使用化學(xué)農(nóng)藥不利于產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展，因此應(yīng)積極探索綠色防控方法。

褪黑素(melatonin，MT)最早發(fā)現(xiàn)于牛松果體[3]，是廣泛存在于生物界的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)[4-8]，主要作用于晝夜節(jié)律[9-10]、抗氧化[11-15]和抗逆[11,16-19]調(diào)節(jié)。在誘導(dǎo)逆境抗性方面，MT可顯著提高葫蘆科(Cucurbitaceae)作物對黃粉菌(Podsphaeraxanthii)和疫霉菌(Phytophthoracapsici)的抗性[17]，以及通過介導(dǎo)水楊酸(salicylic acid, SA)、茉莉酸(jasmonic acid, JA)信號途徑調(diào)節(jié)基因和病程相關(guān)蛋白基因表達，提高水稻(OryzasativaL.)對白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv．Oryzae)的抗性[15]；另外，劉建龍[20]證明了MT通過激活PbOPR3轉(zhuǎn)錄促進JA合成，最終提高梨(PyrusbretschneideriRehd.)果實對輪紋病的抗性。此外，MT在對微生物生理生化作用上表現(xiàn)出復(fù)雜性[21-23]。該物質(zhì)一方面可促進枝菌根菌(Rhizophagusintraradices)逆境下菌絲體生長發(fā)育[24]，另一方面會在低劑量下抑制對綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)和鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)增殖[25]。感病植物同時攜帶植物細胞與病原體，對感病植物噴施MT，該物質(zhì)同時作用于二者，目前大部分針對MT介導(dǎo)植物抗病的研究集中在植物上，對其影響植物與病原物互作的作用模式研究十分有限。

隨著測序和建庫技術(shù)的提升，以及高通量UTRNAs序列敏感性的增加，促進了“雙重RNA序列”的發(fā)展[26]?；プ鬓D(zhuǎn)錄組測序(Dual RNA-seq)可同時對宿主和病原體的轉(zhuǎn)錄水平進行測定，該方法已成為揭示二者相互關(guān)系的有效手段[27]。目前，Dual RNA-seq已成功應(yīng)用于人類-寄生蟲[28]、動物-病原菌[27,29]或寄生蟲[27]、微生物共生[30]、植物-病原[31-33]互作的研究。本研究以Dual RNA-seq為主要檢測手段，在生理水平上和轉(zhuǎn)錄水平上初步探究外源褪黑素介導(dǎo)感病蘿卜中寄主與蕓薹鏈格孢菌互作的作用模式，以期為研究外源褪黑素調(diào)控植物對病原菌的防御機制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和培養(yǎng)方法

試驗使用菌種為蕓薹鏈格孢菌[A.brassicae(Berk.)Sacc]，分離于貴州省威寧縣雙龍鎮(zhèn)紅光村蘿卜種植基地，于合成低營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(synthetic low nutrient agar，SNA)中培養(yǎng)，環(huán)境條件為25±2℃、全黑暗，每3 d轉(zhuǎn)接1次。植物材料為黑斑病易感品種江南圓白四葉一心幼苗(25 d)，苗期培養(yǎng)條件為濕度80%、光強100%(33 000 Lux)、溫度25℃/16℃，光周期16 h。

1.2 鏈格孢接種

將剪去葉尖的蘿卜幼苗葉面浸泡于106CFU·cm-3的菌懸液5 min，葉片上包裹保鮮膜保濕，在上述苗期培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)4周至葉片表面出現(xiàn)黑斑病癥。以0.6%(v/v)乙醇溶液為溶劑，配置50、100、500、 1 000、 1 500 μmol·L-1MT溶液，過濾滅菌后備用。以ddH2O和溶劑噴施組為對照，對培養(yǎng)4周后出現(xiàn)病癥的植株每株噴施5 mL，每3 d噴施1次，共處理5次，期間培養(yǎng)條件同1.1。每個處理至少重復(fù)3次，每重復(fù)至少使用10棵蘿卜幼苗。

1.3 病情指數(shù)測定

最后一次噴施MT 3 d后測定病情指數(shù)，每個處理隨機調(diào)查10株，每株均調(diào)查全部葉片，總計3次重復(fù)。植株發(fā)病分級標(biāo)準(zhǔn)如下：0級：無癥狀；1級：葉黑斑面積占總?cè)~面5%以下；3級：葉黑斑面積占總?cè)~面6%～10%；5級：葉黑斑面積占總?cè)~面11%～20%；7級：葉黑斑面積占總?cè)~面21%～50%；9級：葉黑斑面積占總?cè)~面51%以上。病情指數(shù)計算公式如下：

病情指數(shù)=[∑(各級病葉數(shù)×相對級數(shù)值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×9)]×100。

1.4 互作轉(zhuǎn)錄組的測定和分析

1.4.1 文庫構(gòu)建和測序 對感病葉片提取和純化總RNA，方法參考TRIzol試劑盒(Invitrogen，美國)和NanoDrop ND-1000超微量分光光度計(Wilmington，美國)說明書進行。RNA質(zhì)量通過Bioanalyzer 2100試劑盒(Agilent，美國)操作說明和瓊脂糖電泳進行驗證。通過oligo(dT)磁珠(Thermo Fisher，美國)特異捕獲帶有PolyA尾的mRNA。利用Magnesium RNA Fragmentation Module(NEBNext?，美國)對mRNA在94℃條件下處理5～7 min至片段化后，參照 Invitrogen SuperScript II Reverse Transcriptase(Invitrogen，美國)操作說明合成cDNA。cDNA的二鏈合成使用EscherichiacoliDNA polymerase I(NEB，美國)和RNase H(NEB，美國)試劑盒，同時在二鏈中摻入dUTP Solution(Thermo Fisher，美國)，補平雙鏈DNA末端，再在末端各加1個A，隨后篩選和純化片段大小。UDG酶(NEB，美國)消化二鏈。產(chǎn)物反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性3 min；98℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸5 min，8個循環(huán)；72℃終延伸5 min。程序下合成片段大小為300±50 bp的文庫。使用illumina Novaseq 6000(聯(lián)川生物，杭州)對文庫進行雙端測序，測序模式為PE150。轉(zhuǎn)錄組檢測中，在各處理組中隨機取9個樣本，3個樣本混合為1重復(fù)，共3個重復(fù)進行測序。

1.4.2 測序結(jié)果分析 利用cutadapt 1.9對原始數(shù)據(jù)除接頭、低質(zhì)量序列和重復(fù)序列。使用HISAT2(2.0.4)將Clean Data比對到基因組上(蘿卜參考基因組：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/12929 genomeassemblyid=249276，鏈格孢真菌參考基因：https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/refseq/fungi/Alternaria-alternata/latestassemblyver sions/GCF-001642055.1-Altal1/GCF-001642055.1-Altal1genomic.fna.gz)。利用StringTie(1.3.4d.Linux-x86-64)進行初組裝，gffcompare(0.9.8.Linux-x86-64)進一步組裝注釋結(jié)果。使用ballgown包進行每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取數(shù)(Fragments Per Kilobase per Million，F(xiàn)PKM)定量[Total_exon_fragments/mapped_reads(millions)× exon_length(kb)]，R包edgeR或者R包DESeq 2對樣本之間進行顯著差異分析，將差異倍數(shù)(fold change, FC)>2倍或FC<0.5倍且P<0.05的基因定義為差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)，并對其進行基因本體論(Gene Ontology，GO，http://geneontology.org/)注釋和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG，http://www.kegg.jp/kegg)富集分析。

1.5 關(guān)鍵基因表達模式的檢測

以與蘿卜生長和免疫反應(yīng)相關(guān)的DEGs序列和與鏈格孢菌增殖調(diào)控和致病相關(guān)的DEGs序列為目標(biāo)，設(shè)計引物(表1、2)，進行逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR(reverse transcription real-time fluorescence quantitative chain polymerase reaction, RT-qPCR)表達驗證并以相對定量方法進行分析，試驗平臺為LineGene 9600 Plus(博日，杭州)。反應(yīng)體系為 20 μL：2× SYBR Green qPCR Master Mix(APExBIO，USA)10 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，無酶水7 μL。RT-qPCR程序：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性15 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)。繪制溶解曲線時程序為：95℃變性15 s，60℃退火60 s；95℃變性15 s，每秒升高或者降低0.4℃。RT-qPCR中，每個基因重復(fù)檢測3次，同時設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)。

表2 關(guān)鍵DEGs RT-qPCR引物序列Table 2 Key DEGs primer sequences for RT-qPCR

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

顯著性差異分析利用單因素方差分析(One way ANOVA)于0.05水平上進行比較，P<0.05表示顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源褪黑素對病情指數(shù)的影響

植株病情指數(shù)隨褪黑素濃度的增加呈先下降后上升的趨勢，50、100和500 μmol·L-1處理組的病情指數(shù)低于對照和其他處理組，其中100和500 μmol·L-1處理間無顯著性差異，1 000和1 500 μmol·L-1處理組病情指數(shù)顯著高于其他處理組(圖1左)。葉面病癥見圖1右圖。

2.2 互作轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量分析

互作轉(zhuǎn)錄組中CK、500和1 500 μmol·L-1處理組轉(zhuǎn)錄測序數(shù)據(jù)有效率在97%以上，GC含量在46%以上，Q30均為98%(表3)，以上數(shù)據(jù)表明轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量穩(wěn)定，可用于下一步分析。測序結(jié)果與蘿卜基因組數(shù)據(jù)進行比對，三組總reads比對率均為88%以上，唯一對比率均為62%左右(表4)。測序結(jié)果與鏈格孢菌基因組數(shù)據(jù)進行比對，三組唯一對比率為0.02%(500 μmol·L-1和1 500 μmol·L-1組)-0.05%(CK)。三組比對結(jié)果在蘿卜樣本上無明顯差異，但在鏈格孢菌樣本上差異較大，500 μmol·L-1和1 500 μmol·L-1處理組上可比對reads和唯一比對reads數(shù)量明顯低于對照(表4)。

注：左圖：噴施外源褪黑素的江南元白蘿卜黑斑病苗病害指數(shù)；數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。右圖：不同濃度外源褪黑素對蘿卜黑斑病發(fā)病率的影響；A～F分別代表0、50、100、500、1 000和1 500 μmol·L-1外源褪黑素處理的病葉；比例尺=1厘米。Note: Left: disease index of black leaf-spot diseased Jiangnan Yuanbai radish seedlings sprayed with exogenous melatonin. Lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level. Right: the disease incidence of radish black leaf spot diseased leaves sprayed with different concentrations of exogenous melatonin. A～F represent diseased leaves with 0, 50, 100, 500, 1 000 and 1 500 μmol·L-1 exogenous melatonin treated. Bar=1 cm.圖1 感黑斑病江南圓白蘿卜幼苗外源噴施褪黑素后病情指數(shù)和發(fā)病情況Fig.1 The disease incidence and Disease index of black leaf spot disease in radish leaves sprayed with different concentrations of exogenous melatonin

表3 樣品測序數(shù)據(jù)評估Table 3 evaluation of sample sequencing data

2.3 互作轉(zhuǎn)錄組轉(zhuǎn)錄本區(qū)域分布比對

互作轉(zhuǎn)錄組中，CK和500、1 500 μmol·L-1處理組測序數(shù)據(jù)與蘿卜和鏈格孢菌基因外顯子的比對率均在98%以上(圖2)，說明樣本和測序質(zhì)量較高。

2.4 差異表達基因數(shù)量分析

蘿卜樣本中，500 μmol·L-1處理組與CK相比共檢測出588個上調(diào)基因和898個下調(diào)基因，1 500 μmol·L-1處理樣品中共檢測出1 185個上調(diào)基因和1 352個下調(diào)基因；1 500 μmol·L-1VS 500 μmol·L-1中共檢出606個上調(diào)基因和526個下調(diào)基因。鏈格孢菌樣本檢出差異表達基因較少：500 μmol·L-1處理樣品中共檢測出6個上調(diào)基因和47個下調(diào)基因，1 500 μmol·L-1處理樣品中共檢測出6個上調(diào)基因和136個下調(diào)基因，1 500 μmol·L-1VS 500 μmol·L-1中未檢出上調(diào)基因，檢出4個下調(diào)基因(圖3)。與蘿卜相比，褪黑素對感病葉片上鏈格孢菌影響較小。

表4 比對到參考基因組去除核糖體RNA數(shù)據(jù)Table 4 RNA data that mapped to reference genome and with rRNA data removed

圖2 轉(zhuǎn)錄本區(qū)域分布比對Fig.2 Transcripts mapped region

圖3 差異表達基因火山圖Fig.3 Volcano plot of deferentially expressed genes

2.5 差異表達基因富集分析

2.5.1 GO富集分析 蘿卜和鏈格孢菌DEGs均被富集為3個GO功能 (GO function)：生物過程、細胞組成和分子功能。蘿卜500 μmol·L-1VS對照比對組中，生物過程中最顯著富集(P<0.05)的GO條目為190個，DEGs 2 208個，最顯著富集GO條目包括幾丁質(zhì)應(yīng)答、脫落酸應(yīng)答、抗逆境應(yīng)答、細菌防御反應(yīng)、創(chuàng)傷應(yīng)答以及芳香族化合物生物合成過程等；細胞組成中顯著變化的條目共24個，共894個DEGs，包括光合系統(tǒng)I和II、質(zhì)膜、捕光復(fù)合體、葉綠體類囊體膜等；分子功能中顯著富集的GO條目共97個，包括序列特異DNA結(jié)合、葉綠素結(jié)合、色素結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性等，共涉及1 317個DEGs。蘿卜1 500 μmol·L-1VS對照中，生物過程中最顯著富集的GO條目195個，共 2 937 個DEGs，包括幾丁質(zhì)應(yīng)答、細菌抵御反應(yīng)、創(chuàng)傷應(yīng)答、氧化脅迫應(yīng)答、冷脅迫應(yīng)答和脫落酸反應(yīng)等；細胞組成上顯著富集的GO條目共26個，其中最顯著富集為質(zhì)外體、葉綠體、CCR4-NOT核復(fù)合體、細胞壁、質(zhì)膜和類囊體等；分子功能上最顯著富集GO條目共108個，DEGs共1 710個，包括特異序列DNA結(jié)合、硫酸鹽跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性活性、琥珀酸跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性等。蘿卜樣本1 500 μmol·L-1VS 500 μmol·L-1中，生物過程中最顯著富集的GO條目144個，包括光合作用中光和系統(tǒng)I和II光采集、對生物體反應(yīng)、葉片衰老的負調(diào)控、蛋白質(zhì)-生色團連鎖等，共1 019個DEGs；細胞組成上顯著富集的GO條目共40個，包括質(zhì)體小葉、采光復(fù)合體、光和系統(tǒng)I和II、質(zhì)膜、葉綠體等，共1 358個DEGs；分子功能上共有108條顯著富集的GO條目，色素結(jié)合、脂質(zhì)結(jié)合、葉綠素結(jié)合、過渡金屬離子結(jié)合和錯誤折疊蛋白結(jié)合等為最顯著富集條目，共檢出450個DEGs。蘿卜對照VS 500 μmol·L-1VS 1 500 μmol·L-1中，生物過程中共檢出250個GO條目，最顯著富集條目為冷脅迫應(yīng)答、幾丁質(zhì)應(yīng)答、脫落酸應(yīng)答和細菌抵御應(yīng)答等，DEGs共4 109個；細胞組成上共有GO條目42條，包括質(zhì)膜、光合體統(tǒng)I和II，光捕捉復(fù)合體和葉綠體類囊體膜等，檢出3 348個DEGs；分子功能上顯著性富集條目141條，包括葉綠素結(jié)合、序列特異DNA結(jié)合、色素結(jié)合和蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等，DEGs共2 756個(前20條顯著富集GO條目見圖4)。

感病葉片上鏈格孢菌生物量顯著低于蘿卜，各GO功能上富集的條目數(shù)量顯著低于蘿卜。500 μmol·L-1VS對照中，生物過程上檢出52條GO條目，其中有絲分裂肌動球蛋白收縮環(huán)組件、肌動蛋白絲退火的負調(diào)控、鳥苷一磷酸(guanosine monophosphate, GMP)挽救和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運和肌動蛋白絲脫支等條目富集最顯著，DEGs共56個；細胞組成上顯著性富集9條GO條目，包括質(zhì)膜、肌動蛋白相關(guān)、Set3復(fù)合體和細胞尖端等，DEGs共17個；分子功能上顯著富集GO term為30條，包括外源性跨膜轉(zhuǎn)運腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphophate)ATP酶活性、蛋白質(zhì)二聚活性、肌動蛋白絲結(jié)合和谷胱甘肽合酶活性等，DEGs 37個。1 500 μmol·L-1VS對照中，生物過程中共有63條顯著富集GO條目，包括Arp2/3復(fù)合物介導(dǎo)肌動蛋白成核的正調(diào)控、醋酸鹽分解代謝過程、碳利用和RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物組裝的正調(diào)控等，DEGs共97個；細胞組成中24條顯著性富集GO條目，包括線粒體、細胞質(zhì)、胞漿蛋白酶體復(fù)合體、核蛋白酶體復(fù)合體和肌動蛋白皮質(zhì)片等，DEGs共83個；分子功能上顯著富集GO條目共48條，包括蛋白酶體激活A(yù)TP酶活性、外源性跨膜轉(zhuǎn)運ATP酶活性、質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性和高檸檬酸合酶活性等，DEGs共60個。1 500 μmol·L-1VS 500 μmol·L-1中，各GO功能下沒有顯著性富集條目。對照VS 500 μmol·L-1VS 1 500 μmol·L-1比對組中，生物過程中顯著性富集條目共52條，包括Arp2/3復(fù)合物介導(dǎo)肌動蛋白成核的正調(diào)控、RNA聚合酶ⅡC末端絲氨酸2殘基的磷酸化與RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄延伸的正調(diào)控、肌動蛋白成核、甾醇進口等，顯著DEGs 52個；細胞組成上共17個顯著GO條目，包括核蛋白酶體復(fù)合體、線粒體、肌動蛋白皮質(zhì)片、細胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂滴等，顯著DEGs 92個；分子功能上顯著性富集GO條目共34個，包括外源性跨膜轉(zhuǎn)運ATP酶活性、RNA聚合酶Ⅱ羧基末端結(jié)構(gòu)域激酶活性、肌動蛋白絲結(jié)合和ATP結(jié)合等條目，共57個DEGs(前20條顯著富集GO條目見圖4)。

圖4 差異表達基因GO富集分析Fig.4 GO classification analysis of DEGs

2.5.2 KEGG富集分析 蘿卜葉片樣本上，500 μmol·L-1VS對照組中，DEGs主要富集植物絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路(46個)、光合作用天線蛋白(10個)、植物-病原體互作(48個)、倍半萜和三萜生物合成(9個)、膦酸鹽和膦酸鹽代謝(5個)、丁酸代謝(6個)等；1 500 μmol·L-1VS對照組中，DEGs主要富集于植物-病原體互作(85個)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號通路(59個)、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(14個)等；1 500 μmol·L-1VS 500 μmol·L-1組中，DEGs主要富集光合作用天線蛋白(9個)和真核生物自噬(7個)等；500 μmol·L-1VS 1 500 μmol·L-1VS對照比對中，光合作用天線蛋白(15個)、植物-病原體互作(91個)和MAPK信號通路(67個)等。

鏈格孢菌樣本上，顯著富集的DEGs較蘿卜樣本明顯減少。500 μmol·L-1VS對照組中，僅3個DEGs顯著富集于ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體(ATP-binding cassette transporter, ABC transporter)通路；1 500 μmol·L-1VS對照組和1 500 μmol·L-1VS 500 μmol·L-1比對組中，各有1個DEGs顯著富集于淀粉和蔗糖代謝通路；在3個處理的比對組中，共有9個DEGs被富集于3個KEGG通路上，其中蛋白酶體通路上4個，萜類主鏈生物合成通路上3個，脂肪酸延長2個(圖5)。

2.6 關(guān)鍵DEGs表達模式驗證

本研究根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分別在蘿卜和鏈隔孢菌上各篩選出5個關(guān)鍵DEGs，其中蘿卜關(guān)鍵基因為Apx1、Ert-like、Aos、Lox3和Dlp-like，涉及功能分別為L-抗壞血酸過氧化物酶1、乙烯反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子3、丙二烯氧化物合酶、葉綠體脂氧合酶3和防御素樣蛋白合成；鏈格孢菌上DEGs分別為GstII、Gt1、Ilp、Glm和PrpD，其功能分別涉及谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶II合成、葡萄糖/半乳糖轉(zhuǎn)運體合成、異檸檬酸裂解酶和磷酰變位酶合成、谷胱甘肽代謝調(diào)控、2-甲基檸檬酸脫水酶合成。

蘿卜樣本中，RT-qPCR結(jié)果證實Apx1在對照樣品中表達量最高，為5.45，500 μmol·L-1組中最低，為0.53，1 500 μmol·L-1組樣本中表達量居中，為1.02；Ert-like表達趨勢與LPd相反，500 μmol·L-1組樣本表達量最高，為69.42，對照最低，為29.43，1 500 μmol·L-1組居中，為50.74；Aos表達量在對照中顯著高于500和1 500 μmol·L-1褪黑素處理組；Lox3在1 500 μmol·L-1樣本中表達量顯著高于對照和500 μmol·L-1；Dlp-like在500 μM外源褪黑素處理樣本中的表達量明顯高于對照和1 500 μmol·L-1。鏈格孢菌樣本中，GstII在500 μmol·L-1組中表達量高于其他兩組，其中對照為0.52，1 500 μmol·L-1組中為0.82；Gtl、Ilp和Glm表達趨勢與GstII相似，500 μmol·L-1組表達量高于其他兩組；PrpD在對照組樣本中表達量顯著高于外源褪黑素處理組，其中500 μmol·L-1組中為0.92，1 500 μmol·L-1組中為0.51。10個DEGs在3組中的表達趨勢與RNA-seq測序結(jié)果基本一致(表5、6)。

表5 關(guān)鍵DEGs的RNA-seq FPKM值Table 5 RNA-seq FPKM value of DEGs and their RT-qPCR verification

表6 關(guān)鍵DEGs的RT-qPCR驗證Table 6 RT-qPCR verification of DEGs

圖5 差異表達基因KEGG pathway功能富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis of DEGs from each contrast set

3 討論

MT是自然界廣泛存在的胺類物質(zhì)，對植物和微生物均具有較復(fù)雜的生長調(diào)節(jié)作用[22-23,34-35]。大量報道證實外源施加MT可顯著提升農(nóng)作物對生物脅迫的抗性，但該類報道主要集中于植物的研究[11,17,20,36]，忽略了其對病原微生物的影響，限制了對外源MT介導(dǎo)作物與病原菌互作作用機制的理解。本研究主要利用基于RNA-seq的互作轉(zhuǎn)錄組分析解析不同濃度外源褪黑素影響蘿卜黑斑病葉上寄主與鏈格孢菌互作的作用模式，為進一步明確MT誘導(dǎo)植物抗病的機制提供數(shù)據(jù)支持。

已有報道證實MT對植物的生長調(diào)節(jié)作用具有明顯的劑量依賴性效應(yīng)[37-39]。外源MT對蘿卜健康葉片的生長和對鏈格孢菌免疫力、以及對鏈格孢菌菌落生長和孢子發(fā)生的影響亦表現(xiàn)為明顯的劑量依賴型效應(yīng)，共同呈現(xiàn)低濃度(50～500 μmol·L-1)促進、高濃度(1 000 和1 500 μmol·L-1)抑制的趨勢，其中500 μmol·L-1對寄主和鏈格孢菌的促生作用最明顯，1 500 μmol·L-1明顯抑制二者生長(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)。理論上，外源MT在相同濃度下對寄主和病原物的生長調(diào)節(jié)影響作用相同，可能不具備緩解蘿卜黑斑病的作用，但本研究證實適宜濃度的外源MT可顯著降低黑斑病病情指數(shù)(圖1)。以上結(jié)果證明外源褪黑素對蘿卜-鏈格孢菌互作影響的作用模式與其單獨對二者的作用模式存在明顯差異。

為分析差異發(fā)生原因，以CK、外源噴施500、1 500 μmol·L-1MT的感病葉片進行Dual RNA-seq測序，并做互作轉(zhuǎn)錄組分析。各組樣本比對到蘿卜基因組的read比例均為88%以上，而比對到鏈格孢菌基因組上reads比率僅為0.02%～0.06%(表4)，結(jié)合葉面積與病斑面積的比率計算(病情指數(shù))可知，在感病葉片上，蘿卜葉片的生物量與鏈格孢菌生物量相比占絕對優(yōu)勢，推斷植物寄主與MT的作用水平顯著超過MT對鏈格孢菌的作用，導(dǎo)致各濃度MT對蘿卜葉片的生長和抗性的影響明顯超過對鏈格孢菌侵染力的影響。另外，500及1 500 μmol·L-1處理組上，蘿卜樣本中可分別檢出1 486和2 537個DEGs，而鏈格孢菌上檢出數(shù)量分別為53和142個，進一步說明在感黑斑病葉片上，MT對蘿卜的影響遠超對鏈格孢菌。

褪黑素可通過多種途徑調(diào)節(jié)植物對病原菌抗性[11]。Yin等[36]證明外源MT通過調(diào)控蘋果(Malusprunifolia)葉片抗氧化酶活性以降低植株H2O2含量，最終提高對蘋果斑點病(Diplocarponmali)的抗性。L-抗壞血酸過氧化物酶在清除H2O2中起到重要作用，可通過調(diào)控水楊酸合成途徑誘導(dǎo)抗性[39]。一般逆境會誘導(dǎo)抗壞血酸過氧化物酶家族成員表達量上調(diào)[40]，且該酶合成受H2O2負調(diào)控，參與植物對病原物的超敏反應(yīng)和免疫反應(yīng)[39]。本研究中，蘿卜L-抗壞血酸過氧化物酶1合成基因Apx1在500及 1 500 μmol·L-1處理組中表達量顯著低于對照，且500 μmol·L-1中表達量最低，說明蘿卜因感病引起的氧化逆境可能因外施MT得到緩解，從而提高對鏈格孢菌的抗性。RT-qPCR證明蘿卜類乙烯反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子3合成基因Ert-like在500 μmol·L-1處理上表達量為對照的2.35倍。已有研究證明生物和非生物脅迫均可刺激乙烯反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子3合成上調(diào)[41]。本研究中，低濃度外源MT可能通過提高Ert-like的表達以提高蘿卜葉片對鏈格孢菌抗性。丙二烯氧化物合酶屬于細胞色素P450酶超家族，定位于葉綠體中，Rustgi等[42]認為該酶可通過調(diào)控植物防御調(diào)節(jié)劑JA的生物合成以防御環(huán)境脅迫，是植物抗逆中重要的酶，但也有研究認為該酶對葡萄(VitisviniferaL.)中JA合成意義不大[43]，說明該酶在不同植物中作用復(fù)雜。本研究中，丙二烯氧化物合酶合成基因AOS受外源MT負調(diào)控，且其表達量隨MT濃度提高而下降，與各處理病情指數(shù)的變化不一致，說明該基因或許不參與MT誘導(dǎo)的抗性調(diào)控，可能存在更加復(fù)雜的模式。脂質(zhì)過氧化是植物內(nèi)源氧化脅迫中的重要內(nèi)容，可由脂氧合酶家族介導(dǎo)合成，在對抗性表現(xiàn)差異較大的番茄(Lycopersiconesculentum和L.pennellii)中，脂氧合酶合成基因LOX的表達量之間的差異達400倍[44]。本研究中，500 μmol·L-1處理組中Lox3的表達量顯著低于對照，且1 500 μmol·L-1處理組中表達量最高，說明低濃度外源MT可有效減輕蘿卜葉片脂質(zhì)氧化，從而提高植株抗性，但高濃度MT可能轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸{迫，使植物喪失抗性。MAPK通路是MT誘導(dǎo)植物抗逆的重要途徑[16]。RNA-seq結(jié)果顯示，MAPK通路中防御樣蛋白1合成基因Dlp-like隨MT施用表達量變化明顯，其中500 μmol·L-1處理組中表達量顯著高于對照和1 500 μmol·L-1處理組。Naguib[45]證明該蛋白可調(diào)控小麥(Triticumaestivum)對枯萎病(Fusariumwilt)抗性，Dlp-like在各組中的表達模式與各處理組種病情指數(shù)的變化類似，說明其可能受MT調(diào)控，介導(dǎo)蘿卜對生物脅迫抗性的變化。

谷胱甘-S-轉(zhuǎn)移酶基因家族廣泛存在于所有生命形式中，主要參與生物解毒、生長發(fā)育以及逆境抗性[46-47]。本研究中，谷胱甘-S-轉(zhuǎn)移酶合成基因GstII在MT處理的表達高于對照，且500 μmol·L-1處理組中最高，說明適宜濃度MT可能通過調(diào)節(jié)該酶表達量以促進鏈格孢菌發(fā)育。MT參與調(diào)節(jié)谷胱甘肽代謝以提高動植物對逆境的抗性[48-49]。RNA-seq和RT-qPCR證實鏈格孢菌參與谷胱甘肽代謝的基因Glm的表達量受外源MT誘導(dǎo)，且在500 μmol·L-1處理組表達量最高，可為MT在真菌中調(diào)節(jié)谷胱甘肽代謝提供證據(jù)。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶以及參與調(diào)控谷胱甘肽代謝的酶在真菌應(yīng)對氧化逆境中具有重要作用[50]，但真菌上相關(guān)研究較匱乏，GstII和Glm的具體功能和MT調(diào)控兩者機制需進一步驗證。葡萄糖是大多數(shù)生物碳和能量的主要來源，在細胞代謝和維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，也是一種信號分子，在基因轉(zhuǎn)錄、酶活性、激素分泌等方面具有多種調(diào)節(jié)功能。細胞外通過葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)的細胞膜攝取葡萄糖，是葡萄糖代謝的關(guān)鍵步驟[51]。本研究中控制葡萄糖/半乳糖轉(zhuǎn)運的基因Gt1在MT處理組中表達量高于對照，且500 μmol·L-1處理組中量最高，說明MT可能提高植物對碳源的獲取能力以刺激菌落生長。異檸檬酸裂解酶是一種參與乙醛酸途徑的關(guān)鍵酶，對多種真菌的毒力和致病性至關(guān)重要。目前認為可通過開發(fā)異檸檬酸裂解酶抑制劑以控制真菌的生長[52]。本研究中參與檸檬酸裂解酶合成的基因Ilp在500 μmol·L-1處理組中表達最高，說明適宜濃度MT可能提高鏈格孢菌毒力。2-甲基檸檬酸脫水酶對檸檬酸鹽、異檸檬酸鹽和2-甲基檸檬酸鹽具有脫水催化作用，也對部分羥基酸具有脫水催化作用[53]，在細菌中參與丙酸氧化為丙酮酸過程[54]。敲除2-甲基檸檬酸脫水酶合成基因PrpD導(dǎo)致蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis)大量合成2-甲基檸檬酸[55]，而該物質(zhì)可抑制芽孢形成[56]。目前，針對PrpD的研究大多集中在細菌上，該基因?qū)φ婢l(fā)育和毒性影響的生物功能尚不十分明確。本研究證實MT顯著抑制PrpD基因的表達，且濃度越高表達量越低，但具體機制需要后續(xù)深入研究。以上結(jié)果顯示，500 μmol·L-1MT對感病葉片上鏈格孢菌生長和毒性具有正向影響作用，但可能因MT對寄主細胞免疫誘導(dǎo)作用更強，導(dǎo)致噴施后葉片表現(xiàn)抗病性增強現(xiàn)象。

4 結(jié)論

本研究首次利用互作轉(zhuǎn)錄組檢測手段分析外源MT介導(dǎo)蘿卜-鏈格孢菌互作作用機制，研究了梯度濃度MT在寄主和病原菌代謝變化、以及蘿卜對鏈格孢菌抗性誘導(dǎo)上的作用，并證明該作用存在低濃度促進、高濃度抑制的劑量依賴性效應(yīng)：50～500 μmol·L-1濃度下MT對雙方均具生長促進作用，其中500 μmol·L-1在表型和轉(zhuǎn)錄水平上均可顯著提升寄主及病原菌的生長及抗性/致病性，但MT對寄主的影響顯著超過對菌的作用，最終表現(xiàn)為蘿卜抗性提高。另外，1 500 μmol·L-1濃度下MT抑制雙方生長及抗性/致病性。