亞洲棉NCED3基因克隆及其抗旱功能分析

蔡 肖 王海濤 李興河 甄軍波 劉琳琳 劉 迪 遲吉娜 張建宏

(河北省農(nóng)林科學(xué)院棉花研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮海半干旱棉花生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家棉花改良中心河北分中心，河北 石家莊 050051)

棉花(Gossypiumarboreum)是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。在全國水資源形勢異常嚴(yán)峻的情況下，提高棉花的耐旱能力，利用好我國廣大的干旱、半干旱土地，對保持棉花產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展、保障我國糧食安全具有重要意義[1]。植物抗旱反應(yīng)涉及多種抗旱機(jī)制和信號傳導(dǎo)途徑，分子機(jī)理復(fù)雜[2]。研究表明，一些編碼保護(hù)蛋白的基因(滲透調(diào)節(jié)和氧化還原相關(guān)酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等)、干旱響應(yīng)信號分子[鈣離子信號、脫落酸(abscisic acid, ABA)信號和蛋白激酶等]和干旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子[MYB(V-myb avian myelobastosis viral oncogene homolog)、WRKY、NAC(NAM、ATAF and Cuc)、亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper, bZIP)和乙烯響應(yīng)因子(ethylene-responsive factor, ERF)等]等通過信號感知、生理反應(yīng)和逆境相關(guān)基因響應(yīng)及表達(dá)調(diào)控等一系列細(xì)胞和分子信號調(diào)節(jié)防御機(jī)制來提高植物的耐旱能力[3-5]。雖然棉花抗旱相關(guān)基因挖掘研究已取得了一定進(jìn)展[6-8]，但基因數(shù)量仍非常有限，因此深入挖掘干旱相關(guān)功能基因，并解析其作用機(jī)制，對于創(chuàng)制棉花抗旱種質(zhì)資源具有重要意義。

9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(9-cis-epoxy carotenoid dioxygenase，NCED)是ABA合成過程中的關(guān)鍵限速酶，被證實(shí)廣泛參與植物生長發(fā)育進(jìn)程及對非生物脅迫的應(yīng)答[9-11]。植物中NCED基因多以基因家族的形式存在。擬南芥(Arabidopsisthaliana)中共鑒定出5個(gè)NCED基因(NCED2、NCED3、NCED5、NCED6和NCED9)[12-13]。隨后許多高等植物如水稻(Oryzasativa)[14]、煙草(Nicotianatabacum)[15]、番茄(Solanumlycopersicum)[16]、谷子(Setariaitalica)[17]、蘋果(Malusdomestica)[18]、草莓(Fragariavesca)[19]、葡萄(Vitisvinifera)[20]、甘蔗(Saccharum)[21]和毛竹(Phyllostachysedulis)[22]等的NCED基因也受到了研究者們的關(guān)注。研究表明，多種植物NCED基因的表達(dá)均受干旱脅迫的誘導(dǎo)[23-25]。過表達(dá)AtNCED3的擬南芥通過增加植株內(nèi)源ABA水平提高對干旱脅迫的抗性[26]。過表達(dá)AtNCED3基因的水稻表現(xiàn)出對干旱脅迫的耐受性增強(qiáng)[27]。水稻nced3突變體對鹽和干旱脅迫敏感，而OsNCED3超表達(dá)則提高了對鹽和干旱脅迫的耐受力[28]，OsNCED4和OsNCED5基因也被證實(shí)可以調(diào)節(jié)干旱脅迫下水稻ABA水平和抗逆性[29-31]。由此可見，NCEDs基因?qū)δ婢稠憫?yīng)起著重要的調(diào)節(jié)作用，在植物抗旱性改良方面具有重要研究價(jià)值。

目前棉花中NCED基因相關(guān)研究相對較少。劉江娜等[32]克隆了1個(gè)陸地棉(G.hirsutum)GhNCED基因，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫能強(qiáng)烈誘導(dǎo)該基因表達(dá)。喻娟等[33]將陸地棉GhNCED2基因轉(zhuǎn)入煙草，發(fā)現(xiàn)干旱、鹽和低溫逆境能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草GhNCED2基因大量表達(dá)。由于棉花NCED基因包含多個(gè)家族成員，系統(tǒng)了解每個(gè)成員的結(jié)構(gòu)和表達(dá)特征，可以為深入挖掘干旱相關(guān)NCED基因提供理論依據(jù)。本研究前期對棉花類胡蘿卜素裂解加氧酶(carotenoid cleavage oxygenase，CCO)基因家族進(jìn)行鑒定分析，將棉花CCO基因家族分為CCD和NCED亞家族，分別鑒定出8個(gè)CCD成員(CCD1、CCD4a、CCD4b、CCD7、CCD8a、CCD8b、CCD-likea和CCD-likeb)和7個(gè)NCED成員(NCED3a、NCED3b、NCED3c、NCED5a、NCED5b、NCED5c和NCED6)[34]。結(jié)合二倍體亞洲棉干旱轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)1個(gè)干旱脅迫后顯著上調(diào)表達(dá)的NCED基因GaNCED3a(ID:Cotton_A_27981)。本研究在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上，克隆亞洲棉干旱響應(yīng)基因GaNCED3，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)驗(yàn)證該基因的表達(dá)特征，通過轉(zhuǎn)化擬南芥進(jìn)行抗旱功能驗(yàn)證，以期初步明確GaNCED3在干旱響應(yīng)中的功能，對于闡釋棉花NCED基因的抗旱作用機(jī)制，利用基因工程手段改良棉花抗旱性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試棉花材料為亞洲棉(G.arboreum)石系亞1號(Shixiya-1)，遺傳轉(zhuǎn)化受體為擬南芥哥倫比亞生態(tài)型(Col-0)，均由本研究室(河北省農(nóng)林科學(xué)院棉花研究所分子育種研究室)保存。

本試驗(yàn)引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，總RNA提取采用LS1040Eastep?Super總RNA提取試劑盒(Promega，北京)，反轉(zhuǎn)錄cDNA使用RR047A PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect real time)試劑盒(TaKaRa，北京)，qRT-PCR采用RR820Q TB GreenTMPremix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa，北京)，DNA聚合酶采用RR02 MALATag酶(TaKaRa，北京)，DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶購自天根生化科技(北京)有限公司。農(nóng)桿菌(Agrobacterium)GV3101由本研究室保存。丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量和游離脯氨酸含量測定按照蘇州科銘生物技術(shù)有限公司的丙二醛試劑盒(MDA-1-Y)和脯氨酸含量試劑盒(PRO-1-Y)說明書進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 亞洲棉種植及干旱處理 選取籽粒飽滿的石系亞1號種子，NaClO3溶液滅菌2 min，無菌水漂洗3次，接種于無菌的1/2 MS培養(yǎng)基上，一周后取子葉、胚軸和胚根，并將生長一致的棉苗接種于Hogland’s營養(yǎng)液中進(jìn)行水培。待棉苗長至兩葉一心時(shí)進(jìn)行17%(W/V)PEG6000模擬的干旱處理。分別剪取處理0、1、3、6和12 h的棉苗新葉和根系，置于液氮中冷凍，-80℃保存?zhèn)溆?。石系?號在試驗(yàn)田常規(guī)種植，取三葉一心的根莖葉，以及開花期的花瓣、不同時(shí)期的胚珠和纖維，液氮速凍后保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2GaNCED3基因克隆及植物表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)亞洲棉基因組序列數(shù)據(jù)庫(https://www.cottongen.org/species/Gossypium_arboreum/bgi-A2_genome_v2.0)中GaNCED3基因(Cotton_A_27981)序列設(shè)計(jì)引物(表1)，使用Eastep?Super總RNA提取試劑盒提取石系亞1號葉片總RNA，PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect real time)試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板，用于擴(kuò)增目的基因。擴(kuò)增反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參照LATag酶使用說明書，反應(yīng)體系總體積為50 μL。PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，切膠回收目的片段，采用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和SacⅠ雙酶切上述PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pBI121，利用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBI121-GaNCED3，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(Agrobacterium)GV3101，挑陽性菌落進(jìn)行測序。

1.2.3GaNECD3表達(dá)分析 參照1.2.2的方法，取石系亞1號子葉、胚軸、胚根、葉、莖、根、花瓣、胚珠和纖維組織以及干旱處理0、1、3、6和12 h的葉片和根等組織提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板。設(shè)計(jì)GaNCED3基因特異引物(表1)，按照TB GreenTMPremix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)試劑盒說明，在CFX96 TouchTM熒光定量PCR儀(Bio-rad，美國)上進(jìn)行qRT-PCR分析。以陸地棉組蛋白基因Histone3作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，采用2-△△CT法[35]對基因相對表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.2.4GaNCED3過表達(dá)擬南芥株系的獲得 采用蘸花法，將包含重組質(zhì)粒pBI121-GaNCED3的農(nóng)桿菌GV3101侵染野生型(Col-0)擬南芥花序[36]。播種收獲的T0代種子于含有50 mg·L-1卡那霉素的1/2 MS固體篩選培養(yǎng)基上，將正常生長的陽性植株轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)杯中種植并收獲T1代種子。T1代種子在篩選培養(yǎng)基上播種，選擇符合3∶1分離比的陽性植株收獲T2種子，之后繼續(xù)篩選，直到獲得純合轉(zhuǎn)基因株系，用于候選功能驗(yàn)證試驗(yàn)。提取每一代抗生素篩選陽性的植株葉片DNA，以表達(dá)載體上nptII基因序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR檢測。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥抗旱性分析 篩選到的純合轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥的種子常規(guī)消毒后，點(diǎn)播于含100、200和300 mmol·L-1甘露醇的MS培養(yǎng)基和對照MS培養(yǎng)基上，每個(gè)株系點(diǎn)播30粒種子，3個(gè)重復(fù)。經(jīng)4℃春化2 d后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱(22℃，16 h光照/8 h黑暗)正常培養(yǎng)，種子露白視為種子已萌發(fā)，種子萌發(fā)后其子葉能順利平展并呈現(xiàn)綠色的視為綠苗，培養(yǎng)第12天時(shí)統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率和綠苗率。純合轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥的種子常規(guī)消毒后，點(diǎn)播于對照MS培養(yǎng)基上生長7 d，選取初始根長基本一致的幼苗移到含300 mmol·L-1甘露醇的MS培養(yǎng)基和對照MS培養(yǎng)基上，并行排列，7 d后統(tǒng)計(jì)根長。在MS培養(yǎng)基上生長7 d的不同株系擬南芥幼苗移入含營養(yǎng)土∶蛭石=2∶1的營養(yǎng)缽中，在培養(yǎng)箱(22℃，16 h光照/8 h黑暗)繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d左右澆一次水，3周后停止?jié)菜?，觀察統(tǒng)計(jì)擬南芥表型變化，12 d后統(tǒng)計(jì)存活率。停止?jié)菜? d取樣測定MDA和游離脯氨酸含量，以正常澆水組為對照。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥中脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)分析 將轉(zhuǎn)基因株系和野生型擬南芥的種子消毒并播種在添加300 mmol·L-1甘露醇的培養(yǎng)基上，生長2周后，分別提取不同株系擬南芥的整株總RNA并反轉(zhuǎn)錄cDNA。設(shè)計(jì)脅迫響應(yīng)基因DREB1A(dehydration-responsiveelement-bindingfactor1A)，RD29A(responsivetodehydration29A)，COR15A(coldregulated15A)和SOS1(saltoverlysensitive1)的特異引物(表1)，以擬南芥Actin2作為內(nèi)參基因，qRT-PCR檢測脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)。qRT-PCR檢測及表達(dá)量分析參照1.2.3進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 GaNCED3基因克隆和特征分析

以亞洲棉石系亞1號基因組序列Cottton_A_27981為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物，利用逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)擴(kuò)增技術(shù)克隆了亞洲棉GaNCED3基因，經(jīng)測序比對，確定其開放閱讀框(open reading frame, ORF)序列全長為1 794 bp，編碼蛋白質(zhì)包含597個(gè)氨基酸，分子量為65.48 kDa，等電點(diǎn)為6.58。該基因序列與參考基因組序列Cottton_A_27981的相似性為100%，該基因編碼蛋白與擬南芥NCED家族中的AtNCED3蛋白同源性為72%。該基因定位于第7號染色體，其基因結(jié)構(gòu)僅包含1個(gè)外顯子，無內(nèi)含子。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primers used in this study

2.2 GaNCED3基因表達(dá)分析

選取石系亞1號植株的不同組織檢測了GaNCED3基因的表達(dá)模式。在營養(yǎng)器官中，GaNCED3基因在根和莖中的表達(dá)量較高，顯著高于對照子葉。在生殖器官中，花瓣和5～25 DPA(開花后天數(shù)，days post-anthesis)纖維中的表達(dá)量顯著高于子葉(圖1)。在PEG干旱脅迫處理的根和葉中，該基因上調(diào)表達(dá)，在脅迫處理3 h的根中表達(dá)量最高，達(dá)到了對照根中的27.6倍(圖2)，表明GaNCED3可能在棉花干旱響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

注：*表示子葉與其他樣本之間存在顯著差異(P<0.05)。Note: * indicated significant difference between cotyledon and other samples at 0.05 level.圖1 GaNCED3基因組織表達(dá)分析Fig.1 Expression analysis of GaNCED3 in different tissues of G. arboreum

注：*表示0 h和其他干旱處理時(shí)間之間存在顯著差異(P<0.05)。Note: * indicated significant difference between 0 h and other drought stress times at 0.05 level.圖2 GaNCED3在干旱脅迫下的亞洲棉葉和根中的表達(dá)變化Fig.2 Expression analysis of GaNCED3 under drought stress in leaves and roots of G. arboreum

2.3 甘露醇干旱脅迫下轉(zhuǎn)GaNCED3基因擬南芥種子的萌發(fā)率、綠苗率和根長分析

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pBI121-GaNCED3采用沾花法轉(zhuǎn)化野生型Col-0擬南芥，采用抗生素篩選(圖3-A)和PCR檢測(圖3-B)相結(jié)合的手段，獲得純合轉(zhuǎn)基因擬南芥株系5個(gè)，分別是OE-1、OE-13、OE-16、OE-27和OE-28。qRT-PCR檢測5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中GaNCED3基因的表達(dá)水平(圖3-C)，選取GaNCED3基因表達(dá)量高的轉(zhuǎn)基因擬南芥純合株系OE-1、OE-16和OE-27，用于GaNCED3基因抗旱功能驗(yàn)證。

將野生型(wildtype, WT)和3個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥純系(OE-1、OE-16、OE-27)的種子經(jīng)無菌處理后，播種在含不同濃度甘露醇(100、200和300 mmol·L-1)的培養(yǎng)基上，以MS空白培養(yǎng)基為對照。培養(yǎng)第12天時(shí)，統(tǒng)計(jì)露白的種子數(shù)量和綠苗數(shù)量，統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率和綠苗率。

注：A： 篩選卡那霉素抗性植株；B： 利用nptII基因特異引物進(jìn)行轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測；C： 擬南芥轉(zhuǎn)基因株系中GaNCED3基因的表達(dá)水平。*表示W(wǎng)T與其他樣本之間存在顯著差異(P<0.05)。Note: A: Screening of kanamycin resistant plantlets. B: PCR identification of transgenic plants using specific primer of nptII gene. C: Expression analysis of GaNCED3 in Arabidopsis overexpression lines. * indicates significant difference between WT and other samples at 0.05 level.圖3 GaNCED3轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定Fig.3 Identification of GaNCED3 transgenic Arabidopsis lines

由圖4-A～C可知，隨著甘露醇濃度的增加，擬南芥種子的萌發(fā)和生長受到了不同程度的抑制。在對照和100 mmol·L-1甘露醇處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥純合株系OE-1、OE-16和OE-27的萌發(fā)率和綠苗率略高于野生型，差異不顯著。在200 mmol·L-1甘露醇條件下，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的萌發(fā)率雖略高于野生型，但無顯著差異，但轉(zhuǎn)基因株系的綠苗率顯著高于野生型。在300 mmol·L-1甘露醇條件下，轉(zhuǎn)基因和對照野生型株系的種子萌發(fā)均受到明顯抑制，但轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的種子萌發(fā)率顯著高于野生型，表明轉(zhuǎn)GaNCED3基因提高了擬南芥種子和苗期的抗旱性。

選取在MS培養(yǎng)基上生長7 d、初始根長基本相等的幼苗移至含有300 mmol·L-1甘露醇的培養(yǎng)基上并平行排列，培養(yǎng)7 d后統(tǒng)計(jì)根長，結(jié)果如圖4-D、E所示。在對照處理CK中，各個(gè)轉(zhuǎn)基因株系和野生型擬南芥根長的差異未達(dá)到顯著水平，但在含甘露醇的干旱脅迫培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，轉(zhuǎn)基因株系的根長均顯著高于野生型，說明轉(zhuǎn)GaNCED3基因的擬南芥株系對干旱脅迫的抵抗力更高。

2.4 自然干旱下轉(zhuǎn)GaNCED3基因擬南芥植株表型變化及生理指標(biāo)分析

將MS培養(yǎng)基上生長7 d的擬南芥移至營養(yǎng)土中培養(yǎng)3周后停止?jié)菜M(jìn)行自然干旱處理，12 d后觀察記錄植株表型變化。從圖5-A可以看出，正常培養(yǎng)條件下，野生型擬南芥與轉(zhuǎn)基因植株表型無明顯差異。干旱處理12 d后，野生型擬南芥葉片嚴(yán)重萎蔫、失水皺縮甚至整株死亡，而轉(zhuǎn)基因株系中大多數(shù)植株能夠存活，部分植株葉片顏色變深，呈紫紅色，部分葉片萎蔫，這表明轉(zhuǎn)GaNCED3基因擬南芥的抗旱能力比野生型擬南芥更強(qiáng)。

自然干旱處理前和處理后10 d，分別取樣測定MDA和游離脯氨酸含量，以正常澆水組為對照。圖5-B、C結(jié)果顯示，正常澆水條件下，轉(zhuǎn)基因和野生型植株葉片中的MDA含量和游離脯氨酸含量差異不顯著(P>0.05)。自然干旱處理8 d后，野生型植株葉片MDA含量顯著高于轉(zhuǎn)基因植株(P<0.05)，游離脯氨酸含量顯著低于轉(zhuǎn)基因植株(P<0.05)，這表明轉(zhuǎn)GaNCED3基因的擬南芥植株對干旱脅迫的耐性高于野生型植株。

2.5 甘露醇模擬干旱脅迫下擬南芥脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)分析

轉(zhuǎn)基因株系和野生型擬南芥在添加300 mmol·L-1甘露醇的培養(yǎng)基上生長2周后，取整株提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，檢測脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)。由圖6可知，在正常澆水條件下，轉(zhuǎn)基因株系中DREB1A、RD29A、COR15A和SOS1基因表達(dá)量均高于野生型。干旱處理后，DREB1A、RD29A和COR15A基因在3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系和野生型擬南芥中均明顯上調(diào)表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因株系中上調(diào)倍數(shù)更高。SOS1基因表達(dá)量在干旱處理后較對照略上調(diào)，但株系間差異不顯著。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因擬南芥中GaNCED3基因可能主要通過激活DREB1A、RD29A和COR15A等非生物脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)來調(diào)控轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性。

3 討論

NCED基因家族編碼9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶，結(jié)構(gòu)特征高度保守。相關(guān)研究結(jié)果顯示，棉花NCED基因共7個(gè)成員，包括3個(gè)NCED3基因(NCED3a、NCED3b、NCED3c)、3個(gè)NCED5基因(NCED5a、NCED5b、NCED5c)和1個(gè)NCED6基因。基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)GhNCED3a_A/D和GhNCED3c_A/D對干旱響應(yīng)強(qiáng)烈[34]。此外，利用亞洲棉干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對NCED基因進(jìn)行表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)1個(gè)在干旱脅迫后顯著上調(diào)表達(dá)的NCED基因——GaNCED3a(Cotton_A_27981)。本研究克隆的GaNCED3基因與已公布的亞洲棉基因組中的NCED3a基因(Cottton_A_27981)核酸序列相似度為100%，編碼蛋白與擬南芥AtNCED3蛋白同源性最高，表明NCED3在植物進(jìn)化過程中具有較高的保守性。

已有研究表明，NCED是ABA生物合成途徑中的關(guān)鍵限速酶，其表達(dá)模式與體內(nèi)ABA水平關(guān)系密切[37-38]。水稻OsNCED3、黃冠梨(PyrusbretschneideriXuehuali ×P.pyrifoliaShinsseiki)PbpNCED3和煙草NCED3等基因干旱脅迫下的表達(dá)量變化和內(nèi)源ABA含量變化趨勢一致，二者含量都隨著干旱的加重而增加[14,24,39]。木薯(ManihotesculentaCrantz)MeNCED3、擬南芥AtNCED3和小麥(Triticumaestivum)TaNCED基因的表達(dá)均能被PEG處理顯著誘導(dǎo)[12,40-41]。本研究中，GaNCED3在根中高表達(dá)，這與擬南芥AtNCED3、木薯MeNCED3的組織表達(dá)特性相似[12,40]，與陸地棉GhNCED基因在莖葉中高表達(dá)、在根中表達(dá)量低的表達(dá)特性不同[32]。然而，GhNCED基因能夠被干旱脅迫強(qiáng)烈誘導(dǎo)，且在脅迫6 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大[32]，這與本研究中GaNCED3受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)量快速升高的結(jié)果相似，表明棉花部分NCED基因參與了干旱脅迫應(yīng)答。喻娟等[33]克隆1個(gè)逆境誘導(dǎo)表達(dá)基因GhNCED2并轉(zhuǎn)化煙草，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草中GhNCED2表達(dá)呈現(xiàn)典型的響應(yīng)逆境脅迫的特征，干旱、鹽堿及低溫脅迫均能誘導(dǎo)GhNCED2的大量表達(dá)，暗示著NCED基因不僅在抗旱方面發(fā)揮重要作用，在提高植物對多種逆境的抗性方面也具有重要的應(yīng)用前景。

本研究將GaNCED3基因過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥，模擬干旱處理發(fā)現(xiàn)，GaNCED3基因過表達(dá)株系抗旱性比野生型更強(qiáng)，這與擬南芥AtNCED3、水稻OsNCED3、煙草NtNCED3基因在干旱響應(yīng)中發(fā)揮的功能相似[28,42-43]。MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，與膜脂過氧化作用密切相關(guān)。脯氨酸具有親水性，對于穩(wěn)定植物細(xì)胞和組織內(nèi)的代謝過程具有重要作用。在逆境條件下，植物體內(nèi)MDA和脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性。本研究中，MDA含量和游離脯氨酸含量測定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因株系細(xì)胞損傷和質(zhì)膜過氧化程度低于野生型，可能是由于轉(zhuǎn)GaNCED3擬南芥對干旱脅迫產(chǎn)生的大量活性氧等有害物的清除能力更強(qiáng)，有效提高了多胺、過氧化物酶等保護(hù)性物質(zhì)含量，使植株對干旱脅迫的抗性水平更高。然而，轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中GaNCED3的表達(dá)量與ABA含量和重要抗旱基因的關(guān)系、調(diào)控干旱響應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究，以闡明GaNCED3在干旱脅迫下的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

4 結(jié)論

本研究克隆了亞洲棉干旱誘導(dǎo)表達(dá)基因GaNCED3，過表達(dá)擬南芥提高了植株干旱脅迫下的萌發(fā)率，降低了細(xì)胞的損傷程度和過氧化水平，提高了轉(zhuǎn)基因植株對干旱脅迫的抗性。本研究通過GaNCED3表達(dá)特性和轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性分析，驗(yàn)證了GaNCED3基因在植物干旱脅迫響應(yīng)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。