IGF-1和IGF-2在成年牦牛皮膚毛囊生長周期中的表達與定位

魏鵬強 崔 燕,2,* 余四九,2 李仕杰 牛靜勇 張 虔

(1 甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070；2 甘肅省牛羊胚胎工程研究中心，甘肅 蘭州 730070；3 天?？h動物疫病預防控制中心，甘肅 天祝 733200)

牦牛(Bosgrunniens)是我國青藏高原特有的珍稀牛種之一，對促進牧民經(jīng)濟和文化繁榮發(fā)揮著重要的作用。牦牛長期生活在海拔3 000 m以上高寒、低氧、紫外輻射強的嚴酷環(huán)境中[1]。皮膚作為機體與外界環(huán)境接觸的第一道屏障，具有阻斷外來物質(zhì)入侵、防止理化損傷、感受外界刺激、分泌活性物質(zhì)以及調(diào)節(jié)體溫等重要生理功能[2]。毛囊是哺乳動物皮膚的附屬結(jié)構(gòu)之一，由神經(jīng)外胚層和中胚層發(fā)育形成，外胚層毛囊干細胞形成毛囊的所有上皮成分，而中胚層細胞將發(fā)育成毛囊真皮乳頭和結(jié)締組織鞘[3-4]。哺乳動物出生后，毛囊具有終生呈周期性生長的特性，即經(jīng)歷活躍的毛囊生長期、凋亡介導的退行期和相對靜止的休止期[5]。毛囊干細胞、毛乳頭細胞、毛母質(zhì)細胞及脂肪細胞等均參與了毛囊的周期性生長[6]。毛囊貫穿于哺乳動物皮膚的表皮和真皮，其中毛囊干細胞位于毛囊壁及毛囊隆突部，而毛乳頭細胞位于皮膚真皮，表皮部位的毛囊干細胞與真皮部位的毛乳頭細胞之間信號交流是啟動毛囊再生的關(guān)鍵[7]。相關(guān)文獻報道，胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors,IGFs)是該信號傳導的重要分子之一，對調(diào)節(jié)皮膚發(fā)育和毛囊周期平衡非常重要[8]。同時，IGFs作為低氧靶基因，在正常條件下可促進細胞分化，在缺氧條件下可刺激增殖[9-10]。牦牛世代生活在高寒低氧環(huán)境下，可作為研究IGFs促進細胞增殖的重要模式動物[11]。

胰島素樣生長因子包含2個配體，分別是胰島素樣生長因子1(IGF-1)和胰島素樣生長因子2(IGF-2)，以及2個受體(IGF1R和 IGF2R)，6個高親和力結(jié)合蛋白(IGFBP1～6)[10]。研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1是調(diào)節(jié)毛囊有絲分裂和生長分化的重要因子，其信號轉(zhuǎn)導通路具有影響毛囊增殖、組織重塑、毛發(fā)生長周期轉(zhuǎn)換和毛囊分化的作用[12]。體外試驗表明，外源性IGF-1可以顯著促進體外培養(yǎng)的毛囊生長,影響毛囊的形態(tài)發(fā)育[13-15]。IGF-2是胚胎期的重要調(diào)節(jié)因子，在細胞的增殖、分化，程序性細胞死亡和轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要作用[16]。毛囊一般在晚期胚胎發(fā)生時被誘導形成[17]。最新研究證明，羔羊的皮毛主要在胚胎期發(fā)育，從95 d胎齡到出生前幾天是初級毛囊和次級毛囊高度發(fā)育的時期[18]。而之前的研究發(fā)現(xiàn)，IGF-2能促進胚胎期毛囊發(fā)育，從而促進毛囊的生成[19]。綜上所述，IGF-1在多種體外培養(yǎng)的毛囊上發(fā)揮重要作用，其主要功能是促進毛囊生長并維持毛囊的生長期。而IGF-2是胚胎發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，在晚期胚胎毛囊的形成中發(fā)揮重要作用。目前有關(guān)IGF-1和IGF-2對成年牦牛皮膚毛囊生長周期轉(zhuǎn)換的影響仍鮮見報道。因此，本研究采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)、蛋白免疫印跡(Western blot)和免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)3種方法，分別從基因和蛋白水平檢測成年牦牛毛囊生長周期中IGF-1和IGF-2的基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達情況，以期為牦牛出生后毛囊生長轉(zhuǎn)換的分子調(diào)控機制研究提供一定的基礎資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗動物來自天祝藏族自治縣屠宰場的健康成年牦牛，依據(jù)Yang等[20]對牦牛毛囊周期的劃分，選擇毛囊處于生長期、退行期和休止期的牦牛(各10頭，3～6歲)。分別取其頸部皮膚，一部分樣品固定于4%的多聚甲醛溶液中，用于IHC試驗；另一部分樣品迅速放置于液氮中，之后移至-80℃冰箱保存，用于qRT-PCR和Western blot試驗。

1.2 主要試劑及儀器

IGF-1抗體(DF-6096)，美國Affinity公司；IGF-2抗體(ab-9574)，英國Abcam公司；β-actin(bs-0061R)、二抗(bs-0295G-HRP)，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；TriQuick總RNA提取試劑盒、RIPA組織裂解液，北京索萊寶科技有限公司；鏈霉卵白素-生物素法檢測(streptavidin peroxidase,SP)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；EVO-M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒，長沙艾科瑞生物工程有限公司；Light Cycler 96實時熒光定量PCR儀，瑞士Roche公司；DP71顯微照相裝置，日本Olympus公司；Q5000紫外分光光度計，美國Quawell公司；HI1220烘片機，上海徠卡儀器有限公司。

1.3 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

1.3.1 引物設計與合成 根據(jù)GenBank中已報道的野牦牛(Bosmutus)IGF-1、IGF-2基因序列以及β-actin內(nèi)參基因序列，采用Primer Premier 6.0軟件設計特異性引物，由北京華大基因合成。引物序列見表1。

表1 目的基因和內(nèi)參基因引物序列Table 1 Primer sequences of target and house-keeping genes

1.3.2 總RNA提取和cDNA合成 取毛囊生長期、退行期和休止期頸部皮膚，研磨后置于冰盒上，用TriQuick總RAN提取試劑盒Reagent法提取總RNA，使用紫外分光光度計測定其濃度和純度。將提取的不同時期RNA濃度均調(diào)到300 ng·μL-1，按照EVO-M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行PCR擴增和qRT-PCR試驗。

1.3.3 qRT-PCR檢測 以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進行qRT-PCR擴增。反應總體系20 μL：10 μL SYBR Green Mix,7 μL ddH2O,2 μL cDNA,上下游引物各0.5 μL。反應程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸15 s,共40個循環(huán)；72℃延伸5 min。每個樣品做4個重復，反應結(jié)束后利用Light Cycler 96分析其熔解曲線判定樣品擴增的特異性，獲取每個樣品的循環(huán)數(shù)閾值(cycle threshold value,CT)，運用2-ΔΔCT法進行分析。

1.4 蛋白免疫印跡(Western blot)

1.4.1 蛋白樣品制備 將采取的毛囊生長期、退行期和休止期頸部皮膚分別研磨，各稱取0.1 g于離心管中，分別加入1 mL高效RIPA(radio immunoprecipitation assay)組織裂解液和10 μL苯甲基磺酰氟(phenylm methane sulfonyl fluoride,PMSF)，放置搖床2 h使組織充分裂解，于4℃、12 000×g條件下離心10 min，吸取上清液至新的離心管，用紫外分光光度計測定蛋白濃度。將提取的毛囊生長期、退行期和休止期蛋白樣品與4×SDS-PAGE loading buffer按3∶1的比例混合配置蛋白工作液，金屬浴(100℃)變性10 min。

1.4.2 Western blot檢測 用等量變性的蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)上，5%脫脂奶粉室溫封閉3 h,一抗(IGF-1,1∶1 000稀釋；IGF-2,1∶200稀釋；β-actin,1∶2 500稀釋)孵育，4℃過夜。用磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate buffer solution tween,PBST)清洗PVDF膜，二抗(Goat Anti-Rabbit IgG/HRP,1∶2 500稀釋)孵育，室溫1 h，用PBST清洗PVDF膜，電化學發(fā)光液(electro-chemi-luminescence，ECL)顯色并觀察結(jié)果。用Image J軟件測定各條帶灰度值。

1.5 免疫組織化學檢測(IHC)

1.5.1 組織切片制備 從4%多聚甲醛固定液中取出毛囊生長期、退行期和休止期的皮膚組織，經(jīng)沖塊、脫水、透明、浸蠟和包埋，制成4 μm厚的石蠟切片，置于烘片機上，60℃烘烤6 h。

1.5.2 免疫組織化學染色 (1)下行酒精脫蠟至水，在pH值6.0的0.01 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液中微波加熱修復抗原15 min，自然冷卻至室溫。(2)滴加3%過氧化氫溶液(SP試劑盒試劑1)，37℃作用15 min。(3)滴加正常山羊血清(SP試劑盒試劑2)，室溫封閉15 min。(4)一抗(IGF-1,1∶400稀釋；IGF-2,1∶500稀釋)孵育，4℃過夜。(5)復溫30 min，生物素標記山羊抗兔IgG(SP試劑盒試劑3)孵育，37℃作用15 min。(6)辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(SP試劑盒試劑4)孵育，37℃作用15 min。(7)DAB顯色液適度顯色，后用自來水沖洗10 min終止顯色。(8)蘇木精復染1.5 min，鹽酸酒精分化，自來水返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以上步驟除第三步外，其余各步驟間均用PBS洗3次(3 min/次)。陰性對照用PBS代替一抗，其余步驟不變。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用平均值±標準差(Mean±SD)表示，以單因素方差分析ANOVA(SPSS 25.0)進行統(tǒng)計學分析，P<0.05為差異顯著，P> 0.05為差異不顯著。用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 qRT-PCR檢測IGF-1和IGF-2基因的表達

PCR擴增結(jié)果顯示，IGF-1 (圖1-A)、IGF-2 (圖1-B)和β-actin(圖1-C) 基因擴增產(chǎn)物大小分別為118、110和80 bp，各個基因的擴增產(chǎn)物大小與預期片段大小相符，引物特異性強，可用于后續(xù)qRT-PCR試驗。qRT-PCR結(jié)果顯示，IGF-1基因的相對表達水平在毛囊生長期最高，退行期次之，休止期最低。差異分析顯示，IGF-1基因在生長期的相對表達水平顯著高于退行期和休止期(圖1-D)。IGF-2基因在毛囊生長周期中的相對表達水平與IGF-1基因相似，其在毛囊生長期的相對表達水平顯著高于退行期和休止期(圖 1-E)。

2.2 Western blot檢測IGF-1和IGF-2蛋白的表達

2.2.1 毛囊生長周期中IGF-1蛋白的相對表達 IGF-1蛋白在毛囊生長期皮膚表達水平最高，在退行期和休止期表達水平較低。差異分析結(jié)果顯示，IGF-1蛋白在毛囊生長期皮膚的表達顯著高于退行期和休止期(圖2)。

注：A～C：IGF-1,IGF-2和β-actin基因擴增產(chǎn)物,M：GL 2000 DNA 分子標記,1：生長期,2：退行期,3：休止期；D：IGF-1的相對表達水平；E：IGF-2的相對表達水平。不同小寫字母表示不同時期之間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: A-C: IGF-1,IGF-2 and β-actin gene amplification products. M: GL 2000 DNA Marker. 1: Anagen. 2: Catagen. 3: Telogen. D: Relative expression levels of IGF-1. E: Relative expression levels of IGF-2. Different lowercase letters indicate significant differences between different periods at 0.05 level. The same as following.圖1 毛囊生長周期中IGF-1及IGF-2的相對表達水平Fig.1 Relative expression levels of IGF-1 and IGF-2 in hair follicle growth cycle

注：A: Western blot結(jié)果；B: IGF-1蛋白的相對表達水平。Note: A: Western blot results. B: Relative expression levels of IGF-1 protein. 圖2 毛囊生長周期中IGF-1蛋白的相對表達水平Fig.2 Relative expression levels of IGF-1 protein in hair follicle growth cycle

2.2.2 毛囊生長周期中IGF-2蛋白的相對表達 IGF-2蛋白在毛囊生長期皮膚表達水平最高，在退行期和休止期表達水平較低。差異分析結(jié)果顯示，IGF-2蛋白在毛囊生長期皮膚的表達顯著高于退行期和休止期(圖 3)。

注：A: Western blot結(jié)果；B: IGF-2蛋白的相對表達水平。Note: A: Western blot results. B: Relative expression levels of IGF-2 protein.圖3 毛囊生長周期中IGF-2蛋白的相對表達Fig.3 Relative expression levels of IGF-2 protein in hair follicle growth cycle

2.3 IHC檢測IGF-1和IGF-2在皮膚毛囊的定位表達

2.3.1 IGF-I在皮膚毛囊生長周期的定位表達 在毛囊生長周期轉(zhuǎn)換過程中，IGF-1主要表達于皮膚表皮、毛囊外根鞘和毛母質(zhì)細胞，在毛乳頭細胞和毛囊內(nèi)根鞘不表達。棕黃色表示IGF-1的陽性表達產(chǎn)物(圖4)。

注：A～C: 毛囊生長期皮膚縱切；D～F: 毛囊退行期皮膚縱切；G～I: 毛囊休止期皮膚縱切；J～L: 陰性對照。EP: 表皮；ORS: 外根鞘；IRS: 內(nèi)根鞘；HM: 毛母質(zhì)；DP: 毛乳頭。Note: A～C: Longitudinal incision of skin in anagen. D～F: Longitudinal incision of skin in catagen. G～I: Longitudinal incision of skin in telogen. J～L: Negative control. EP: Epidermis. ORS: Outer root sheath. IRS: Inner root sheath. HM: Hair matrix. DP: Dermal papilla.圖4 IGF-1在皮膚毛囊生長周期的定位表達Fig.4 Localization and expression of IGF-1 in the growth cycle of skin hair follicles

2.3.2 IGF-2在皮膚毛囊生長周期的定位表達 IGF-2在毛囊生長的各個周期皮膚中表達同IGF-1相似，主要表達于皮膚表皮、毛囊外根鞘和毛母質(zhì)細胞，在毛乳頭細胞和毛囊內(nèi)根鞘不表達。棕黃色表示IGF-2的陽性表達產(chǎn)物(圖5)。

注：A～C: 毛囊生長期皮膚縱切；D～F: 毛囊退行期皮膚縱切；G～I: 毛囊休止期皮膚縱切；J～L: 陰性對照。EP: 表皮；ORS: 外根鞘；IRS: 內(nèi)根鞘；HM: 毛母質(zhì)；DP: 毛乳頭。Note: A～C: Longitudinal incision of skin in anagen. D～F: Longitudinal incision of skin in catagen. G～I: Longitudinal incision of skin in telogen. J～L: Negative control. EP: Epidermis. ORS: Outer root sheath. IRS: Inner root sheath. HM: Hair matrix. DP: Dermal papilla.圖5 IGF-2在皮膚毛囊生長周期的定位表達Fig.5 Localization and expression of IGF-2 in the growth cycle of skin hair follicles

3 討論

早在1962年，Davis[21]就報道了哺乳動物被毛生長呈周期性變化，生長期中毛囊細胞快速增殖分化，與退行期和休止期相互交替，形成周期性循環(huán)。Yang等[20]對毛囊生長周期中毛囊的數(shù)量及形態(tài)變化進行了詳細研究，發(fā)現(xiàn)生長期毛囊群結(jié)構(gòu)逐漸清晰完整，毛囊數(shù)量明顯增加；退行期毛囊群開始變得不完整，毛囊的數(shù)量開始減少，毛干開始脫落；休止期毛囊群結(jié)構(gòu)松散，只留下退化的外根鞘空腔。研究表明，大量生長因子和激素都參與調(diào)控毛囊的周期性循環(huán)和形態(tài)學變化，其調(diào)控機制錯綜復雜[22]。目前，IGFs已被證明廣泛分布在毛囊、毛乳頭及真皮纖維細胞內(nèi)，對毛囊的上皮和真皮均有刺激作用[23]。本試驗在此基礎上探討IGF-1和IGF-2對毛囊生長周期轉(zhuǎn)換的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IGF-1和IGF-2在毛囊生長期、退行期和休止期的表達存在差異性，由此推測，IGF-1和IGF-2與毛囊生長周期轉(zhuǎn)換密切相關(guān)。

通過檢測IGF-1基因及蛋白在毛囊生長周期的表達，發(fā)現(xiàn)IGF-1在毛囊生長期皮膚中相對表達水平最高，在退行期和休止期顯著低于生長期。這與Bai等[24]在遼寧絨山羊毛囊組織的研究結(jié)果一致。此外，魏玉青[25]通過qRT-PCR技術(shù)對遼寧絨山羊皮膚中IGF-1的相對表達進行研究，發(fā)現(xiàn)IGF-1的表達水平與絨山羊毛發(fā)生長時期相關(guān)，在毛發(fā)生長旺盛時期高表達，在毛囊退行期和休止期明顯降低。劉逍等[26]在吉林白鵝毛囊發(fā)育過程中檢測IGF-1的表達情況，發(fā)現(xiàn)IGF-1在毛囊生長期相對表達水平最高。因此推測，IGF-1在毛囊生長期可能具有促進毛囊生長的作用。同時，通過檢測IGF-2基因及蛋白在毛囊生長周期的表達，發(fā)現(xiàn)IGF-2的表達模式與IGF-1相似，其在毛囊生長期的皮膚中表達量最高，在退行期和休止期表達較弱。Ward等[27]用注射法研究IGF-2對小鼠生長發(fā)育的長期影響，發(fā)現(xiàn)過表達的IGF-2導致小鼠皮膚過度生長。Baker等[28]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)缺乏編碼IGF-2的功能基因沒有改變出生后小鼠的生長速度或身體比例，但小鼠表現(xiàn)出表皮發(fā)育不良。另有研究表明，IGF-2在胎兒期毛囊形成過程中能夠促進毛囊的發(fā)育和生長[19]。上述研究都表明了IGF-2對胎兒期小鼠皮膚及毛囊的生長和發(fā)育有重要作用。然而，目前對IGF-2的研究都集中在胚胎期或胎兒期，對于其在成年動物機體皮膚及毛囊中發(fā)揮的作用尚不清楚。根據(jù)本研究IGF-2在毛囊生長周期的表達結(jié)果，提示IGF-2在毛囊周期轉(zhuǎn)換過程中可能具有促進毛囊生長的作用。

相關(guān)研究認為，毛乳頭是毛發(fā)再生的信號中心，毛囊的生長是外根鞘隆突部毛囊干細胞和真皮毛乳頭共同作用的結(jié)果[29]。在1990年Cotsarelis等[30]提出的隆突激活假設中，隆突部細胞在毛囊休止期后期被毛乳頭激活并遷出，沿著外根鞘向下遷移，在毛乳頭周圍分化形成毛母質(zhì)細胞。生長期毛母質(zhì)細胞分化能力增強，毛囊不斷向下增長，毛干不斷增長，隨著毛母質(zhì)細胞分化衰竭，毛囊逐漸進入退行期[31]。研究表明，IGF信號系統(tǒng)能促進毛囊干細胞遷移至毛乳頭周圍并增殖分化形成毛母質(zhì)細胞，再通過刺激毛母質(zhì)細胞增殖，從而促進毛囊的生長，抑制毛囊退行和休止[32-34]。本研究中，IHC結(jié)果顯示，IGF-1和IGF-2均在毛母質(zhì)細胞中有陽性表達，提示IGF-1和IGF-2均可能刺激毛母質(zhì)細胞的增殖分化。同時，前人研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1在毛囊生長周期中有調(diào)控角質(zhì)形成細胞增殖和分化的作用，而毛囊干細胞生成的外根鞘角質(zhì)形成細胞，具有促進毛發(fā)生長、抑制毛囊退行的作用[35-36]。結(jié)合IGF-1和IGF-2在皮膚表皮和毛囊外根鞘均有陽性表達的試驗結(jié)果，表明IGF-1和IGF-2可能具有促進角質(zhì)形成細胞增殖和分化能力。然而，本研究在毛囊內(nèi)根鞘并未檢測到IGF-1和IGF-2的表達。毛囊內(nèi)根鞘細胞是由毛母質(zhì)細胞自身分化的終末分化細胞[31]，不再分裂增殖，進一步提示IGF-1和IGF-2可能具有刺激毛囊上皮細胞增殖分化的作用。同時，在毛乳頭細胞也未檢測到IGF-1和IGF-2的表達。Weger等[37]在轉(zhuǎn)基因小鼠毛囊生長期的毛乳頭細胞中檢測到了IGF-1的表達，但其表達強度與IGF-1的劑量呈依賴關(guān)系。因此，IGF-1和IGF-2對毛囊毛乳頭刺激作用可能與自身濃度以及所處的生理環(huán)境有關(guān)。此外，胰島素樣生長因子IGF-1和IGF-2具有自分泌和旁分泌效應，并通過與I型IGF受體結(jié)合以旁分泌或自分泌的方式激活Ras/Raf/MAP 激酶和PI3k激酶/Akt通路發(fā)揮生物學效應[38-39]。而Tomita等[40]在角質(zhì)形成細胞中檢測到IGF-1受體的存在。同時，在皮膚組織中，IGF-1僅由真皮和毛乳頭的間充質(zhì)細胞合成[41]。綜上所述，IGF-1和IGF-2在毛囊周期的調(diào)控作用可能通過真皮乳頭釋放信號以旁分泌的方式結(jié)合到有特定I型IGF受體的上皮細胞，刺激毛囊上皮細胞的增殖和分化，從而促進毛囊的生長。

本研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1和IGF-2在毛囊生長周期轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮重要作用，并可能具有協(xié)同作用，且該過程可能通過刺激毛囊上皮細胞增殖分化從而促進毛囊生長。然而，毛發(fā)的不同步生長，不同物種之間皮膚解剖結(jié)構(gòu)以及生理的差異，對介導毛囊生長周期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵分子決定因素的識別以及調(diào)控機制仍需進一步研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，IGF-1和IGF-2在毛囊生長期皮膚中具有較高的表達，表明兩者與毛囊的生長密切相關(guān)，可能具有促進毛囊生長的作用。此外，IGF-1和IGF-2定位于皮膚表皮，毛囊外根鞘和毛母質(zhì)，提示其通過影響上皮細胞的活性來調(diào)控毛囊的周期轉(zhuǎn)換。