高能重離子束和X射線輻射水稻幼苗的當(dāng)代生物學(xué)效應(yīng)研究

許超麗 劉 霄 任維賓 杜 艷 王圓夢(mèng) 李 燕 司懷軍 周利斌,3,*

(1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2 中國科學(xué)院近代物理研究所生物物理室，甘肅 蘭州 730030；3 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；5 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)西南作物基因資源發(fā)掘與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130)

水稻(Oryzasativa)作為世界上最主要的糧食作物之一[1]，其新品種的選育與創(chuàng)新對(duì)世界糧食安全有著重要意義。隨著輻射技術(shù)在水稻育種中的廣泛應(yīng)用，對(duì)其誘變機(jī)理的研究也日漸增多。物理誘變育種常用的電離輻射包括X射線、γ射線、快中子及重離子束等[2]。電離輻射能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)，包括刺激效應(yīng)、生理損傷以及遺傳突變等[3]。然而，目前在輻射機(jī)理、突變篩選及相關(guān)分子機(jī)制等方面的基礎(chǔ)研究報(bào)道相對(duì)較少，因此對(duì)不同類型輻射誘變機(jī)理的研究能夠更好地了解輻射對(duì)植物造成的當(dāng)代生理損傷及后代遺傳突變情況。同時(shí)，加強(qiáng)輻射品質(zhì)與誘變分子機(jī)理的研究可以為水稻高效誘變育種提供一定的理論基礎(chǔ)。

高能重離子束輻射被認(rèn)為是一種高效的物理誘變技術(shù)[4]。重離子束在水稻育種中的實(shí)用性及有效性是由于其具有傳能線密度(linear energy transfer，LET)大和相對(duì)生物學(xué)效應(yīng)(relative biological effectiveness，RBE)高等物理學(xué)及生物學(xué)特征[5]，在育種過程表現(xiàn)出突變率高[6]、突變譜廣[7]和育種周期相對(duì)較短等特點(diǎn)[8]。重離子束輻射對(duì)水稻生長發(fā)育的影響已有報(bào)道。王佳琪等[9]研究表明，碳離子束輻射不同粳稻干種子后，其發(fā)芽率和存活率存在差異，即不同品種粳稻的輻射敏感性不同；Xu等[10]利用不同能量的重離子輻射3個(gè)品種的水稻干種子，發(fā)現(xiàn)低能氮離子和中能碳離子束輻射對(duì)發(fā)芽率、存活率、苗高等當(dāng)代生物學(xué)指標(biāo)的影響不同。X射線是一種低LET輻射，通常由電子加速器加速的電子撞擊金屬靶產(chǎn)生，具有操作簡(jiǎn)便、使用成本較低、無需使用放射源等特點(diǎn)[11]，在誘變育種中也有廣泛應(yīng)用。高能重離子束屬帶電粒子輻射，X射線屬電磁波，兩者與物質(zhì)相互作用的原理不同，輻射誘導(dǎo)的植物生理生化變化及遺傳突變也各不相同。已有研究表明，在植物誘變育種操作中，X射線單位劑量的誘變效率較重離子束低約10倍[12]。

植物經(jīng)電離輻射處理后，其生理生化改變及分子響應(yīng)過程較為復(fù)雜，研究植物經(jīng)輻射處理后的形態(tài)學(xué)及生理學(xué)改變，能夠更好地了解農(nóng)作物對(duì)不同類型電離輻射的響應(yīng)機(jī)制。前人研究多關(guān)注于輻射干種子對(duì)植物生長的影響，Zhang等[13]將粳稻和秈稻種子進(jìn)行γ輻射，發(fā)現(xiàn)秈稻比粳稻更耐受輻射。關(guān)于重離子束輻射植物幼苗的誘變效應(yīng)研究，Hase等[14]對(duì)擬南芥種子和幼苗分別進(jìn)行碳離子束輻射，發(fā)現(xiàn)干種子的突變率是幼苗的1.4～1.9倍。對(duì)水稻幼苗進(jìn)行輻射處理所產(chǎn)生的當(dāng)代損傷效應(yīng)的研究較少，關(guān)于高能碳離子束和X射線兩種不同類型電離輻射對(duì)水稻幼苗生理損傷的比較研究更是鮮有報(bào)道。因此，本研究以水稻幼苗為起始材料，以高能碳離子束進(jìn)行誘變處理，以低LET輻射的代表X射線處理為誘變參照，研究不同類型電離輻射處理對(duì)水稻生長、發(fā)育以及生理損傷的影響，以期為不同類型電離輻射誘變水稻時(shí)，輻射劑量及樣品初始狀態(tài)的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

粳稻(OryzasativasspJaponica)Kitaake是日本特早熟品種，也是水稻研究的模式物種，從播種至開花平均僅需52個(gè)生育日。本研究中水稻材料源自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)西南作物基因資源發(fā)掘與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 樣品制備

試驗(yàn)于2021年4月進(jìn)行，選取無病害、飽滿度一致且同一批次的Kitaake水稻種子進(jìn)行萌發(fā)，將水稻干種子置于濃度為3%的過氧化氫溶液中，消毒30 min后用去離子水沖洗3～5次，然后置于含濕潤濾紙直徑90 mm圓形培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)5 d，其中1～4 d置于無光照恒溫培養(yǎng)箱(32℃)中萌發(fā)，后移至光照培養(yǎng)間(溫度為28～30℃，光周期光/暗為14/10 h，光強(qiáng)為250 μmol·m-2·s-1)中生長1 d。選取萌發(fā)一致的幼苗置于有濕潤濾紙的35 mm圓形培養(yǎng)皿中，室溫下進(jìn)行輻射處理。

1.3 輻射處理

對(duì)5日齡幼苗進(jìn)行輻射處理，高能12C6+束流由中國科學(xué)院近代物理研究所蘭州重離子研究裝置(Heavy Ion Research Facility in Lanzhou，HIRFL)提供，能量為80.55 MeV·u-1，LET為34 keV·μm-1，劑量率約為60 Gy·min-1，輻射劑量分別為5、10、15、20、25、30、40 Gy。X射線輻射處理采用X-RAD255 X射線輻照儀(Precision X-Ray，美國)進(jìn)行，劑量率約為6.5 Gy·min-1，輻射劑量分別為10、20、30、40、50、60、80 Gy。對(duì)照置于與處理組相同的環(huán)境條件下但不進(jìn)行輻射處理。

1.4 輻射后培養(yǎng)

輻射后將幼苗立即轉(zhuǎn)移至水培盒中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：純水培養(yǎng)2 d，1/4×營養(yǎng)液培養(yǎng)3 d，1/2×營養(yǎng)液培養(yǎng)3 d，1×營養(yǎng)液(Coolaber營養(yǎng)液：1 000×硅酸鈉，1 000×大量元素微量元素混合液，1 000×鐵鹽，1 000×鈣鹽)進(jìn)行培養(yǎng)，水培盒置于光照培養(yǎng)間中。40 d后隨機(jī)選取部分植株進(jìn)行插秧種植，種植于直徑為20 cm花盆中，每盆3株。

1.5 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.5.1 營養(yǎng)生長時(shí)期形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定 對(duì)輻射處理后6 d的植株進(jìn)行根長和芽長測(cè)定。根長為從根尖到幼苗底部的距離，芽長為幼苗底部到芽尖的距離，相對(duì)根長=處理組平均根長÷對(duì)照平均根長×100%。每組處理選取20～30棵幼苗進(jìn)行數(shù)碼拍照并使用Image J軟件測(cè)量長度。

1.5.2 生殖發(fā)育時(shí)期形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定 在植株成熟后，對(duì)植株株高、分蘗數(shù)、結(jié)實(shí)率以及千粒重進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。株高：從根部到植株頂端最長葉的長度；分蘗數(shù)：從水稻基部數(shù)水稻分蘗個(gè)數(shù)；結(jié)實(shí)率：每株選取10穗，結(jié)實(shí)率=實(shí)粒數(shù)/總粒數(shù)×100%；千粒重：用于統(tǒng)計(jì)育性的所有種子的重量，并換算為千粒重。每組均測(cè)定6株單株。

1.5.3 光合作用指標(biāo)的測(cè)定 輻射后第30天對(duì)植株進(jìn)行葉綠素含量測(cè)定，3株水稻混合取樣，取樣部位為新鮮水稻嫩葉距葉尖3～8 cm處。用乙醇提取法[15]測(cè)定葉片葉綠素含量。根據(jù)公式計(jì)算葉片單位鮮重的葉綠素a(chlorophyll a，Chla)、葉綠素b(chlorophyll b，Chlb)和總?cè)~綠素(total chlorophyll)含量。輻射后第30天，對(duì)植株進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定，使用3～4 株水稻葉片混合測(cè)定，先將水稻暗適應(yīng)20 min，選取植株第一、第二葉的距葉尖5～10 cm部位進(jìn)行活體檢測(cè)，用DUAL-PAM-100型葉綠素?zé)晒鈨x(Walz，德國)在黑暗的環(huán)境中檢測(cè)，并記錄光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)最大光化學(xué)量子產(chǎn)量值(maximum photochemical efficiency,Fv/Fm)以及有效光化學(xué)量子產(chǎn)量值[actual photochemical efficiency，Y(Ⅱ)]。

1.5.4 抗氧化酶活性指標(biāo)的測(cè)定 輻射后6、24、72 h對(duì)20 Gy高能碳離子束及40 Gy X射線處理組幼苗地上部分和根分別取樣，未輻射組為對(duì)照，稱量鮮重后液氮快速冷凍，并置于-80℃冷凍保存，用于后續(xù)抗氧化系統(tǒng)的分析?？寡趸富钚詼y(cè)定：過氧化物酶(peroxidase，POD)活性，采用愈創(chuàng)木酚法在470 nm波長下檢測(cè)吸光值；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，采用氮藍(lán)四唑(nitro-blue tetrazolium，NBT)光化學(xué)還原法在560 nm波長下檢測(cè)吸光值；過氧化氫酶(catalase，CAT)活性，采用過氧化氫分解法在240 nm波長下檢測(cè)光密度[16]。

1.5.5 遺傳物質(zhì)多態(tài)性分析 水稻抽穗后，取主穗旗葉進(jìn)行遺傳物質(zhì)多態(tài)性的分析，以對(duì)照組單株水稻的基因組DNA為材料，使用CTAB法[17]提取主穗旗葉的DNA，并于-20℃條件下保存?zhèn)溆?。利用?jiǎn)單重復(fù)間序列(inter-simple sequence repeat，ISSR)進(jìn)行DNA多態(tài)性檢測(cè)，共選用UBC系列引物29條(引物來源：University of British Columbia)進(jìn)行條帶擴(kuò)增；檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，選取擴(kuò)增條帶數(shù)多、穩(wěn)定和條帶清晰的引物用于后續(xù)研究，PCR擴(kuò)增后，使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，設(shè)置電壓為110 V，時(shí)間為40 min，電泳完成后使用紫外凝膠系統(tǒng)成像，并進(jìn)行多態(tài)性條帶統(tǒng)計(jì)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。差異顯著性分析使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差(One-way ANOVA)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，采用Duncan’s test；兩組均值比較采用Student t-test檢驗(yàn)。使用Origin軟件、Excel 2016軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高能碳離子束和X射線輻射對(duì)水稻幼苗生長發(fā)育的影響

由圖1可知，兩種輻射根長和苗高都隨輻射劑量的增加，整體呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。對(duì)于高能碳離子束輻射處理組，根長在輻射劑量為15 Gy時(shí)比對(duì)照顯著降低25.42%(圖1-A)；而對(duì)于苗高，輻射劑量為5 Gy時(shí)與對(duì)照相比顯著降低(圖1-B)，表明地上部分對(duì)輻射的響應(yīng)較根部更為敏感。對(duì)于X射線輻射組，根長在輻射劑量為20 Gy時(shí)與對(duì)照相比顯著降低21.02%；苗高在輻射劑量為10 Gy時(shí)與對(duì)照相比顯著增加7.38%(圖1-C)，這可能與低劑量輻射對(duì)植株的刺激效應(yīng)有關(guān)[18]；然而輻射劑量到20 Gy后一直呈降低趨勢(shì)(圖1-D)。

水稻植株的生長需要完整、強(qiáng)大的根系來吸收水分和無機(jī)鹽，從而為植株積累養(yǎng)分，以供植株正常的生長發(fā)育。據(jù)圖1計(jì)算可知，在高能碳離子束輻射劑量為20 Gy、X射線輻射劑量為40 Gy時(shí)，植株的相對(duì)根長最為接近，分別為69.54%和 68.53%。這兩個(gè)劑量處理下水稻根部未完全受損，幼苗可以生長，并且與對(duì)照相比其根長又顯著降低，因此選擇這兩個(gè)劑量進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 高能碳離子束和X射線輻射對(duì)水稻主要農(nóng)藝性狀的影響

2.2.1 高能碳離子束和X射線輻射對(duì)水稻株高、分蘗數(shù)的影響 由于40 Gy高能碳離子束和80 Gy X射線輻射處理，使得水稻幼苗受到嚴(yán)重?fù)p傷而生長停滯，故無法進(jìn)行主要農(nóng)藝性狀的統(tǒng)計(jì)分析。由圖2可知，兩種不同類型的電離輻射處理對(duì)成熟后水稻的株高影響不大，僅發(fā)現(xiàn)15 Gy高能碳離子束輻射處理組株高較對(duì)照略有增加且差異顯著，其余各劑量的處理組與對(duì)照組相比均無顯著性差異(圖2-A)；所有X射線輻射處理組與對(duì)照組的株高均無顯著性差異(圖2-C)。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)輻射處理水稻幼苗后，其成熟期植株的各處理組間分蘗數(shù)差異較大。總體來看，在高能碳離子束輻射組中，不同劑量處理組之間的水稻分蘗數(shù)較對(duì)照無顯著性差異(圖2-B)；而在X射線輻射組中，與對(duì)照相比，輻射劑量為50、60 Gy時(shí)，分蘗數(shù)顯著和極顯著增加(圖2-D)?？芍赬射線輻射處理下，較高的劑量對(duì)水稻植株分蘗能力造成了影響。

2.2.2 高能碳離子束和X射線輻射對(duì)水稻結(jié)實(shí)率、千粒重的影響 高能碳離子束和X射線輻射水稻幼苗的結(jié)實(shí)率、千粒重從整體上與對(duì)照相比呈下降趨勢(shì)。由表1可知，高能碳離子束輻射劑量為5、10 Gy時(shí)，結(jié)實(shí)率及千粒重與對(duì)照相比無顯著差異，15 Gy時(shí)出現(xiàn)顯著降低，由于輻射處理組各單株有較大差異，導(dǎo)致出現(xiàn)特例，在輻射劑量為20 Gy時(shí)統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異不顯著。由表2可知，輻射的水稻幼苗經(jīng)10、20、30 Gy X射線處理后，其結(jié)實(shí)率及千粒重與對(duì)照相比均無顯著差異，在輻射劑量達(dá)到40 Gy后出現(xiàn)下降，且差異極顯著，40 Gy X射線處理組的結(jié)實(shí)率不足對(duì)照組的50%。50、60 Gy的X射線輻射對(duì)水稻的生殖發(fā)育造成了嚴(yán)重的影響，造成M1植株的不育，無法產(chǎn)生后代。

2.3 高能碳離子束和X射線輻射對(duì)水稻葉片光合作用的影響

2.3.1 高能碳離子束和X射線輻射對(duì)水稻葉片葉綠素含量的影響 由圖3可知，20 Gy高能碳離子束處理下，水稻葉片中Chla、Chlb和總?cè)~綠素的含量與對(duì)照相比均無顯著差異；在40 Gy X射線處理下，葉片中Chla、Chlb和總?cè)~綠素的含量較對(duì)照均極顯著提高。表明在根長抑制相似的情況下，經(jīng)X射線輻射的水稻幼苗在處理后第30天，葉片中光合色素積累多，植株的光合作用能力強(qiáng)。

注： 不同小寫字母表示不同輻射劑量之間差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant differences among different irradiation does at 0.05 level.圖1 高能碳離子束(A、B)和X射線(C、D)輻射對(duì)水稻幼苗根長和苗高的影響Fig.1 Effects of high-energy carbon ion beam(A、B) and X-rays(C、D) radiations on the root length and seedling height of rice

注：*表示與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)；**表示與對(duì)照相比差異極顯著(P<0.01)。下同。Note:* means significant difference between treatments and control at 0.05 level. ** means extremely significant difference between treatments and control at 0.01 level. The same as following.圖2 高能碳離子束(A、B)和X射線(C、D)輻射對(duì)水稻株高及分蘗數(shù)的影響Fig.2 Effect of high-energy carbon ion beam(A、B) and X-ray(C、D) radiations on rice plant height and number of tillers

表1 高能碳離子束輻射對(duì)水稻結(jié)實(shí)率、千粒重的影響Table 1 Effects of high-energy carbon ion beam radiation on rice fertility and thousand-grain weight

表2 X射線輻射對(duì)水稻育性、千粒重的影響Table 2 Effect of X-ray radiation on rice fertility and thousand-grain weight

注：NS表示對(duì)照與輻射處理間無顯著差異；**表示對(duì)照與輻射處理間差異極顯著(P<0.01)。C-Control表示高能碳離子束處理組的對(duì)照，C-20 Gy表示高能碳離子束輻射處理劑量為20 Gy；X-Control表示X射線處理組的對(duì)照；X-40 Gy表示X射線輻射處理劑量為40 Gy。Note: NS means no significant difference among Control and irradiation treatments. ** means significant difference at 0.01 level among Control and irradiation treatments. C-Control represents the control of the high-energy carbon ion beam treatment group. C-20 Gy represents the high-energy carbon ion beam radiation treatment dose of 20 Gy. X-Control represents the control of the X-ray treatment group. X-40 Gy represents the X-ray radiation treatment dose of 40 Gy. 圖3 高能碳離子束和X射線輻射對(duì)水稻葉片綠素含量的影響Fig.3 Effect of high-energy carbon ion beam and X-ray radiation on the chlorophyll content of rice leaves

2.3.2 高能碳離子束和X射線輻射對(duì)水稻葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響 由表3可知，40 Gy X射線處理組Fv/Fm值較對(duì)照顯著降低，20 Gy高能碳離子束則無顯著變化，表明水稻葉片PSⅡ最大光能利用能力與所受的輻射類型相關(guān)。

2.4 高能碳離子束和X射線輻射對(duì)水稻幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響

由圖4可知，經(jīng)高能碳離子束輻射后，水稻幼苗地上部分抗氧化酶活性整體高于根系，根系SOD活性在輻射處理后6、24、72 h出現(xiàn)先上升后下降再上升的波動(dòng)，地上部分SOD活性僅在輻射處理后72 h出現(xiàn)顯著上升(圖4-A)。POD活性無論是根系還是地上部分都隨著輻射后時(shí)間延長呈上升趨勢(shì)(圖4-C)。根系CAT活性在輻射后6 h出現(xiàn)一個(gè)峰值；而在芽中，CAT活性在輻射后24 h出現(xiàn)顯著降低，到72 h時(shí)又升高(圖4-E)。

表3 高能碳離子束和X射線輻射的水稻葉片綠素?zé)晒馓卣鞅容^Table 3 Comparison of chlorophyll fluorescence characteristics of rice leaves irradiated by high-energy carbon ion beam and X-ray

經(jīng)X射線輻射處理水稻幼苗，根系SOD活性在處理后24 h出現(xiàn)峰值，到72 h時(shí)活性又下降至與對(duì)照無顯著差異；而地上部分SOD活性在處理后6、24、72 h與對(duì)照相比均無顯著差異(圖4-B)。根系的POD活性在處理后24 h出現(xiàn)峰值，到72 h時(shí)活性又下降；而地上部分的POD活性隨著處理后時(shí)間延長呈逐漸上升趨勢(shì)，并且每個(gè)時(shí)間點(diǎn)與前一時(shí)間點(diǎn)相比酶活性均顯著提升(圖4-D)。根和芽CAT活性變化趨勢(shì)大致相同，均表現(xiàn)為在輻射后6、24 h與對(duì)照相比無顯著差異，在72 h時(shí)活性顯著下降(圖4-F)。

2.5 碳離子束和X射線輻射對(duì)水稻旗葉遺傳物質(zhì)多態(tài)性的影響

本研究共使用了UBC系列的29條引物，其中10條引物被用于數(shù)據(jù)分析。由表4可知，在高能碳離子束輻射下，10條引物共擴(kuò)增出95條條帶，平均每條引物擴(kuò)增出9.5條條帶，其中25條為多態(tài)性條帶，占擴(kuò)增條帶總數(shù)的29.31%，其中UBC840產(chǎn)生的多態(tài)條帶百分比最高(83.3%)，UBC887和UBC889引物未產(chǎn)生多態(tài)條帶。由表5可知，在X射線輻射下，10條ISSR引物共擴(kuò)增出了92條條帶，平均每條引物擴(kuò)增出9.2條條帶，其中33條為多態(tài)性條帶，占擴(kuò)增條帶總數(shù)的37.76%，其中UBC890產(chǎn)生的多態(tài)條帶百分比最高(62.50%)，UBC886和UBC889引物產(chǎn)生多態(tài)條帶百分比最低(20.00%)。表明高能碳離子束輻射和X射線輻射均影響了水稻旗葉的遺傳物質(zhì)多態(tài)性，其中經(jīng)過X射線輻射處理的多態(tài)率較高。

表4 高能碳離子束輻射水稻幼苗ISSR多態(tài)率分析Table 4 Analysis of ISSR polymorphism rate of rice seedling irradiated by high-energy carbon ion beam

表5 X射線輻射水稻幼苗ISSR多態(tài)率分析Table 5 Analysis of ISSR polymorphism rate of rice seedlings irradiated by X-ray

注：不同小寫字母表示根部差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示地上部分差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant differences in the roots,and different uppercase letters indicate significant differences in the shoot (P<0.05).圖4 高能碳離子束(A、C、E)和X射線(B、D、F)輻射對(duì)水稻幼苗SOD、POD、CAT活性的影響Fig.4 Effects of high-energy carbon ion beam(A、C、E) and X-ray(B、D、F) radiation on SOD,POD and CAT activity of rice seedlings

3 討論

輻射作為一種有效的物理誘變手段，能夠影響植物生長發(fā)育、造成損傷并產(chǎn)生突變。前人研究表明，相比于X射線、γ射線等低LET電離輻射，重離子束輻射植物具有對(duì)M1代的生理損傷輕的特點(diǎn)[19]。梅曼彤等[20]研究表明，高LET重離子能更有效地抑制水稻種子萌發(fā)、幼苗生長，降低當(dāng)代植株的結(jié)實(shí)率，程維民等[21]和楊瑰麗等[22]也證實(shí)了這一點(diǎn)。已有研究表明，與γ射線相比，重離子束輻射對(duì)水稻干種子的致死率及突變率有所不同[23]。本研究使用兩種不同類型的輻射處理水稻幼苗，對(duì)當(dāng)代損傷效應(yīng)進(jìn)行研究，結(jié)果表明兩種輻射處理在較短時(shí)期內(nèi)抑制了幼苗的生長，不論是經(jīng)高能碳離子束還是X射線輻射處理，隨輻射劑量的增加，水稻的根長和苗高整體呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)水稻幼苗存在低劑量輻射的刺激效應(yīng)。由于兩種輻射在植物體內(nèi)能量沉積的方式不同，即LET不同，在造成相同損傷的情況下，對(duì)應(yīng)的輻射劑量不同，表明輻射處理后在根長抑制相似的情況下，X射線的輻射劑量(40 Gy)大約是高能碳離子束輻射劑量(20 Gy)的2倍，即高能碳離子束對(duì)水稻幼苗根長抑制的RBE約為2[24]。

前人研究指出，水稻干種子經(jīng)輻射處理后，株高會(huì)隨著劑量的增加而下降[25]。而本研究中，輻射劑量的增加并未顯著影響存活植株的株高，表明在一定劑量范圍內(nèi)，水稻幼苗經(jīng)輻射處理后，存活植株的營養(yǎng)生長未受到輻射太大的影響，在表型上無顯著變化，Xu等[10]在碳離子束輻射水稻干種子研究中發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。此外，在本研究中，在較高劑量的X射線輻射下，存活植株的分蘗能力、結(jié)實(shí)率及千粒重都受到了極大的影響，表現(xiàn)為水稻分蘗數(shù)顯著增加，結(jié)實(shí)率及千粒重顯著降低，這與劉寶海等[26]的研究結(jié)果類似。推測(cè)是控制分蘗的基因受到的損傷在生長過程中無法完全自我修復(fù)或產(chǎn)生了生殖生長紊亂，導(dǎo)致水稻無效分蘗數(shù)增加，不斷消耗養(yǎng)分，影響有效分蘗的生長，進(jìn)而使水稻產(chǎn)量受到嚴(yán)重影響并造成M1植物育性下降甚至不育。

光合作用是植物特有的生理功能，其中葉綠素的生物合成受到多種因素的影響[27]。本研究中，40 Gy X射線輻射處理水稻幼苗后，經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng)，葉綠素含量顯著提高，說明40 Gy輻射在一定時(shí)間內(nèi)提高了水稻光合作用。在20 Gy高能重離子束輻射處理水稻幼苗后，其葉綠素含量相比對(duì)照并未出現(xiàn)顯著性差異。健康植物葉片的Fv/Fm值在0.80～0.85之間波動(dòng)，X射線處理組的Fv/Fm值較對(duì)照雖有顯著降低，但仍在正常值的范圍內(nèi)，說明植株健康。Y(Ⅱ)值可作為評(píng)價(jià)植物脅迫程度的指標(biāo)[28]。本研究表明，在兩種輻射處理中Y(Ⅱ)值都未出現(xiàn)顯著變化，說明在輻射后第30天水稻植株可正常生長。

植物體內(nèi)存在不同類型的抗氧化酶，抗氧化酶活性可以反映植物的抗氧化能力[29]。本研究中，水稻幼苗地上部分與地下部分抗氧化酶活性變化有很大差異，其中地上部分SOD活性在高能碳離子束輻射后72 h時(shí)顯著提高，可能是因?yàn)镾OD的合成通路被激活，在輻射處理后72 h時(shí)提高了SOD的表達(dá)量。地上部分POD活性隨著輻射后時(shí)間的延長顯著提高，植物抗氧化酶活性的提高可緩解脅迫帶來的膜過氧化損傷[30]。植物體內(nèi)過氧化物酶與光合作用、呼吸作用等代謝密切相關(guān)，能清除體內(nèi)的H2O2，維持活性氧代謝平衡[31]、保護(hù)膜結(jié)構(gòu)，從而在一定程度上緩解或抵御逆境脅迫。水稻幼苗經(jīng)兩種不同輻射處理后，3種抗氧化酶活性的變化趨勢(shì)不盡相同，但在抗氧化酶系統(tǒng)的共同作用下，能夠有效清除ROS的產(chǎn)生，將水稻體內(nèi)的自由基維持在正常水平。

ISSR作為一種有效的基因指紋技術(shù)，對(duì)確定水稻品種間遺傳變異和品種快速鑒定有較大價(jià)值[32]。本研究表明，高能碳離子束和X射線輻射均能誘發(fā)水稻M1植株遺傳物質(zhì)多態(tài)性的變化。其中，X射線輻射引起的水稻當(dāng)代基因組DNA的平均遺傳多態(tài)性高于碳離子束輻射，認(rèn)為這與X射線輻射對(duì)M1代造成的損傷更為嚴(yán)重有關(guān)。馮慧[33]研究表明，經(jīng)碳離子束輻射獲得的M1和M3代擬南芥基因組DNA的平均多態(tài)率均高于γ射線，這與本研究中高能碳離子束輻射水稻幼苗M1代遺傳多態(tài)性較低結(jié)果相反，這與誘變操作選取的物種及樣品的起始狀態(tài)均相關(guān)。在植物的誘變育種操作中，多數(shù)采用種子。種子是由多細(xì)胞構(gòu)成，在受輻射處理后，多數(shù)情況下僅是個(gè)別細(xì)胞發(fā)生突變，因此，存活的植株是由帶突變基因的細(xì)胞和未突變基因的細(xì)胞所組成[34]。本研究以水稻幼苗為材料進(jìn)行輻射誘變操作，其構(gòu)成的植株以及后代是否存在突變嵌合現(xiàn)象還需要進(jìn)一步研究。此外，了解不同電離輻射對(duì)水稻植株所產(chǎn)生的當(dāng)代生物學(xué)效應(yīng)，開展輻射誘變機(jī)理研究，可為水稻種質(zhì)創(chuàng)新提供更佳翔實(shí)的數(shù)據(jù)積累。未來將從多角度出發(fā)，進(jìn)一步對(duì)水稻不同生長時(shí)期及更多農(nóng)藝學(xué)性狀展開研究，從而為育種工作者提供更加高效、更加多樣化的誘變技術(shù)方法。

4 結(jié)論

植物對(duì)電離輻射的響應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的過程，不僅與輻射的類型、劑量有關(guān)，也與樣品所處的生理狀態(tài)相關(guān)。本研究結(jié)果表明高能重離子束和X射線輻射處理水稻Kitaake幼苗后，在具有相同生物學(xué)效應(yīng)下，植物對(duì)兩種類型電離輻射所產(chǎn)生的生理響應(yīng)不同。在較短時(shí)間內(nèi)，兩種輻射對(duì)幼苗的根及芽的抗氧化系統(tǒng)存在顯著影響。高能重離子束輻射對(duì)水稻的葉綠素含量和Fv/Fm值均無顯著影響；X射線輻射可增加水稻的葉綠素含量，降低Fv/Fm值。20 Gy高能碳離子束輻射組水稻幼苗ISSR多態(tài)率為29.31%，40 Gy X射線輻射處理水稻幼苗ISSR多態(tài)率為37.76%?？傮w而言，高能碳離子束輻射水稻幼苗所產(chǎn)生的當(dāng)代損傷效應(yīng)低于X射線處理，推薦的誘變劑量區(qū)間為：高能碳離子束20～30 Gy，X射線30～40 Gy。