基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的痛瀉要方治療胃潰瘍分子機(jī)制研究*

洪耀南 許佳燁 潘曉豪 余王琴

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053

2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053

本研究通過運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探究痛瀉要方治療胃潰瘍（GU）的分子機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 收集藥物潛在活性成分及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)：痛瀉要方包含陳皮、白芍、白術(shù)、防風(fēng)4味中藥。我們通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)在線平臺(tái)(TCMSP)，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥0.3，類藥性指數(shù)(drug-like‐ness，DL)≥0.18為臨界值篩選出各味中藥活性成分與靶點(diǎn)。

1.2 中藥活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)與靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化：根據(jù)從TCMSP中篩選出的中藥活性成分及靶基因，并通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫、TargetNet數(shù)據(jù)庫進(jìn)行補(bǔ)充。同時(shí)，將3個(gè)數(shù)據(jù)庫中查詢到的靶基因進(jìn)行匯總?cè)ブ亍?/p>

1.3 獲取胃潰瘍的相關(guān)基因：通過TTD、OMIM、Gene‐Cards三大數(shù)據(jù)庫，以“gastric ulcer”為關(guān)鍵詞進(jìn)行快速檢索得到已知的GU相關(guān)疾病靶標(biāo)。

1.4 中藥活性成分——靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：將中藥成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)上傳到在線網(wǎng)站Venny 2.1.0中，以VENN圖的形式展現(xiàn)出來，其中交集部分為痛瀉要方治療GU的潛在靶點(diǎn)。并通過Cytoscape 3.7.2軟件，以網(wǎng)絡(luò)圖的形式展現(xiàn)相互作用的關(guān)系。

1.5 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)篩選核心基因：將靶標(biāo)集合輸入在線STRING 11.0數(shù)據(jù)庫,設(shè)置置信度=0.400，獲取靶標(biāo)蛋白的相互作用信息，用獲得的相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.6 GO富集分析和KEGG通路富集分析：借助R×64 4.0.5軟件以及Bioconductor生物信息軟件包對(duì)痛瀉要方治療胃潰瘍的藥效靶點(diǎn)進(jìn)行GO分子功能分析，根據(jù)P value進(jìn)行排序，最后繪制出排序前10位生物過程(biological process，BP)、細(xì)胞組分(cellular com‐ponent,CC)、分子功能(molecular function，MF)的GO分子功能柱狀圖。利用R語言進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，根據(jù)P value進(jìn)行排序，繪制前20位KEGG功能富集分析圖氣泡圖，并利用KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)篩選出的信號(hào)通路進(jìn)行可視化。

1.7 潛在活性成分-核心靶點(diǎn)分子對(duì)接驗(yàn)證：利用AutoDock Vina(v1.1.2)對(duì)痛瀉要方活性成分和胃潰瘍相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證其相互作用活性，并利用Pymol對(duì)結(jié)合能較低的幾個(gè)組合可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 痛瀉要方的活性成分、靶點(diǎn)檢索與篩選：通過TC‐MSP數(shù)據(jù)庫檢索，以O(shè)B≥0.30，DL≥0.18為臨界值篩選共得出痛瀉要方中的40個(gè)活性成分（去重），其中陳皮5個(gè)，白芍13個(gè)，白術(shù)7個(gè)，防風(fēng)18個(gè)。將TCMSP檢索與Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫、TargetNet數(shù)據(jù)庫中查詢到的靶點(diǎn)經(jīng) Uniprot數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化注釋后進(jìn)行匯總?cè)ブ?，共得?42個(gè)靶點(diǎn)。

2.2 胃潰瘍靶點(diǎn)檢索及獲取交集靶點(diǎn)：通過TTD、OMIM、GeneCards 3個(gè)數(shù)據(jù)庫共檢索收集到672個(gè)胃潰瘍靶點(diǎn)。其中交集部分為痛瀉要方治療胃潰瘍的潛在靶點(diǎn)，見圖1。

圖1 痛瀉要方中藥活性成分靶點(diǎn)與胃潰瘍靶點(diǎn)VENN圖

2.3 痛瀉要方中藥活性成分——靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：通過Cytoscape 3.7.2軟件，以網(wǎng)絡(luò)圖的形式展現(xiàn)痛瀉要方中藥成分與交集靶點(diǎn)相互作用的關(guān)系。圖中478個(gè)節(jié)點(diǎn),2420條邊，其中來源于化合物的有36個(gè)，來源于基因的有442個(gè)，見圖2；經(jīng)統(tǒng)計(jì)，degree較高的有效成分為川陳皮素(nobiletin)、漢黃芩素（wogonin）、順式-11,14-二十碳二烯酸甲酯(methyl icosa-11,14-die‐noate)、柚 皮 素 (naringenin)、亞油酸乙酯(Mande‐nol)等。

圖2 痛瀉要方活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：將交集靶點(diǎn)通過STRING 11.0軟件，構(gòu)建 PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖3。共得到509對(duì)蛋白互作關(guān)系，涉及52個(gè)蛋白靶點(diǎn)。其中IL-6、TP53、AKT1、PTGS2、CASP3、TNF、JUN、MAPK1、CCND1、EGFR的度值排名較靠前，故認(rèn)為是這幾個(gè)靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)。

圖3 痛瀉要方治療胃潰瘍的PPI網(wǎng)絡(luò)模型

2.5 痛瀉要方治療胃潰瘍的基因GO富集分析與KEGG富集分析：經(jīng)過GO富集分析（圖4）共得到1505條富集結(jié)果，其中生物過程（BP）1402個(gè)，主要涉及對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)活性氧的反應(yīng)、對(duì)營養(yǎng)水平的反應(yīng)等生物過程進(jìn)行調(diào)節(jié)；細(xì)胞組分（CC）22個(gè)，主要涉及囊腔、膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等細(xì)胞組分；分子功能（MF）81個(gè)，主要涉及磷酸酶結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合等。

圖4 痛瀉要方治療胃潰瘍的GO富集分析

對(duì)篩選出的靶蛋白進(jìn)行KEGG通路富集分析，共獲得83條富集結(jié)果。KEGG富集分析關(guān)鍵蛋白模塊的相關(guān)通路排名在前20位的通路繪制氣泡圖，其中參與調(diào)控胃潰瘍的信號(hào)通路包括糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號(hào)通路（AGE-RAGE signaling pathway indiabetic com‐plications）、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化（lipid and ath‐erosclerosis）、乙型肝炎（Hepatitis B）等，見圖5。并對(duì)其中關(guān)聯(lián)度較高的糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號(hào)通路進(jìn)行可視化分析，見圖6。

圖5 痛瀉要方治療胃潰瘍的KEGG通路富集氣泡圖

圖6 信號(hào)通路圖

2.6 潛在活性成分-核心靶點(diǎn)分子對(duì)接驗(yàn)證：選取活性成分前5位的川陳皮素(nobiletin)、漢黃芩素（wogo‐nin）、順式-11,14-二十碳二烯酸甲酯(methyl icosa-11,14-dienoate)、柚皮素(naringenin)、亞油酸乙酯(Mandenol)，分別與位于前5位的核心基因IL-6、TP53、AKT1、PTGS2、CASP3進(jìn)行分子對(duì)接，見表1。結(jié)果表明，川陳皮素、漢黃芩素、柚皮素與IL-6、TP53、AKT1、PTGS2、CASP3的結(jié)合能均≤-5.0kcal/mol，具有較好的結(jié)合力，見圖7。提示川陳皮素、漢黃芩素、柚皮素可能在痛瀉要方治療對(duì)胃潰瘍中發(fā)揮了重要作用。

表1 痛瀉要方中藥活性成分與胃潰瘍核心靶基因結(jié)合能

圖7 化學(xué)成分與靶點(diǎn)的分子對(duì)接圖

3 討論

胃潰瘍臨床表現(xiàn)為慢性、周期性上腹部疼痛，故諸多醫(yī)家將胃潰瘍歸于中醫(yī)學(xué)“胃脘痛”范疇，因胃潰瘍兼有腹部脹滿、惡心等癥狀，又與“痞滿”“嘔吐”等關(guān)系密切。胃脘痛首見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，對(duì)其發(fā)病原因、伴隨癥狀等均有詳細(xì)描述，如《靈樞》云：“脾足太陰之脈……入腹屬脾絡(luò)胃……是動(dòng)則病舌本強(qiáng)，食則嘔，胃脘痛，腹脹善噫?！倍阶鰹楠?dú)立病名存在則見于李東垣的《蘭室秘藏·胃脘痛門》。肝主疏泄，脾主運(yùn)化，若肝氣疏泄功能太過、不及或障礙，橫逆脾胃，可見脾氣虛弱，不能運(yùn)化水谷；胃失和降，氣機(jī)不暢，日久則氣滯血瘀或氣虛血瘀，肉敗血腐，形成潰瘍，重則血不循經(jīng)，外溢出血。因此胃潰瘍是正虛邪實(shí)、虛實(shí)夾雜的復(fù)雜病證，與肝脾關(guān)系密切。

臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，當(dāng)今社會(huì)競(jìng)爭激烈、人們常處于精神緊張的狀態(tài)，長期緊張、焦慮可導(dǎo)致精神抑郁，誘發(fā)胃潰瘍的發(fā)生，早在1962年Susser等[1]就提出“都市化”的生活模式可能會(huì)導(dǎo)致胃潰瘍的發(fā)生率升高。因此，胃潰瘍患者不僅消化吸收功能差，且常有精神方面調(diào)節(jié)失衡，表現(xiàn)為感受性及情緒興奮性過強(qiáng)，不易平復(fù)。這些表象與中醫(yī)學(xué)對(duì)胃潰瘍肝郁脾虛的病機(jī)認(rèn)識(shí)不謀而合。

痛瀉要方出自《景岳全書》，由陳皮、白芍、白術(shù)、防風(fēng)4味藥組成，具有調(diào)和肝脾、祛濕止瀉之功效[2]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探究其治療胃潰瘍的作用機(jī)制，共篩選得到40個(gè)活性成分及442個(gè)靶點(diǎn)，經(jīng)活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)篩選出痛瀉要方在治療胃潰瘍中發(fā)揮作用的主要成分：川陳皮素、漢黃芩素、順式-11,14-二十碳二烯酸甲酯、柚皮素、亞油酸乙酯等?，F(xiàn)代研究表明，川陳皮素、漢黃芩素、柚皮素等具有良好的抗癌、抗氧化、抗炎、抗血栓形成的作用[3]，而抗氧化、抗炎等作用對(duì)胃潰瘍的治療具有重要意義。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊箢A(yù)測(cè)得到IL-6、TP53、AKT1、PTGS2、CASP3、TNF等核心靶基因。研究表明，病理?xiàng)l件下，IL-6可刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生活性氧自由基、溶酶體酶等產(chǎn)物,并在潰瘍的發(fā)生過程中起重要作用，且IL-6的高表達(dá)能夠促使炎癥的持續(xù)發(fā)生，最終導(dǎo)致胃黏膜損傷和胃潰瘍的產(chǎn)生[4]；TP53的表達(dá)可調(diào)控細(xì)胞的生長與增殖，高表達(dá)會(huì)引起胃黏膜的炎癥反應(yīng)和胃潰瘍的產(chǎn)生[5]；前列腺素G/H合成酶（PTGS）可將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素H2，產(chǎn)生的前列腺素介導(dǎo)生理應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致感染和炎癥等[6]。

在篩選得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的核心靶點(diǎn)中，AKT1為其中重要蛋白之一。通過分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)其與痛瀉要方主要成分的結(jié)合能均≤-5.0kcal/mol，具有較好的結(jié)合力，提示AKT1可能在痛瀉要方治療胃潰瘍中發(fā)揮了重要作用。AKT1為AKT三個(gè)成員之一，為PI3K/AKT信號(hào)通路中的重要靶點(diǎn)之一，可通過AKT的磷酸化和去磷酸化等作用，影響下游效應(yīng)因子，參與多種細(xì)胞過程[7]。在我們的研究中，AKT參與了排名前10的GO富集分析的所有生物過程，包括對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)活性氧的反應(yīng)等；在排名前20的KEGG富集分析中參與了糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號(hào)通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、乙型肝炎等18條信號(hào)通路。

現(xiàn)代研究表明，正常胃黏膜中AKT主要分布于黏膜肌層周圍的胃底腺細(xì)胞質(zhì)中，而在胃潰瘍組織中主要分布于潰瘍邊緣與肉芽組織之中[8]。在胃潰瘍的發(fā)生發(fā)展過程中，PI3K/AKT信號(hào)通路會(huì)被激活，胃組織AKT表達(dá)水平上升,促進(jìn)炎癥因子表達(dá)；而在胃潰瘍修復(fù)的過程中，AKT的mRNA及蛋白表達(dá)水平均降低[9]，說明AKT與胃潰瘍整個(gè)過程都存在一定的聯(lián)系，可能是對(duì)胃潰瘍的發(fā)生發(fā)展及治療預(yù)后都有著主要作用。

綜上所述，本研究通過運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接，預(yù)測(cè)了痛瀉要方治療胃潰瘍的主要作用靶點(diǎn)及多成分、多靶點(diǎn)、多通路作用機(jī)制。接下來，我們也將圍繞痛瀉要方治療胃潰瘍的活性成分和作用靶點(diǎn)及其相關(guān)通路進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，為臨床治療胃潰瘍提供科學(xué)依據(jù)。