清濕熱通絡(luò)方對(duì)高尿酸血癥小鼠血清炎癥因子表達(dá)的影響*

周 穎 文笑游 柳 磊 陳茜蕓 曾慧蓮 董維維

象山縣中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)療健康集團(tuán) 浙江 象山 315700

高尿酸血癥作為常見(jiàn)的慢性疾病，可誘發(fā)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、心血管疾病、慢性腎臟病、代謝綜合征與高血壓等疾病[1]。研究顯示，高尿酸血癥患者體內(nèi)尿酸鈉（MSU）晶體能通過(guò)刺激T細(xì)胞、血小板、滑膜細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等相關(guān)細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，使體內(nèi)白細(xì)胞計(jì)數(shù)和白細(xì)胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-18（Interleukin-18，IL-18）、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎癥因子水平增高，參與高尿酸血癥的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程[2，3]。因此，臨床認(rèn)為開(kāi)展抗炎治療，通過(guò)控制高尿酸血癥患者體內(nèi)炎癥因子水平，能有效緩解癥狀，減緩病情進(jìn)展[4]?；诖?，本研究采用清濕熱通絡(luò)方治療高尿酸血癥，分析清濕熱通絡(luò)方對(duì)高尿酸血癥小鼠血清IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α表達(dá)的影響，以期為臨床治療提供參考。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與藥物：準(zhǔn)備40只SPF級(jí)的雄性昆明種小鼠開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，體質(zhì)量28～36g，平均體質(zhì)量為（32.39±4.28）g，由杭州子源實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（浙）2019-0004；屏障環(huán)境內(nèi)相對(duì)溫度為20～25℃，相對(duì)濕度為40%～70%；本研究嚴(yán)格依據(jù)動(dòng)物倫理原則開(kāi)展。清濕熱通絡(luò)方藥物組成：柴胡、黃芩、白芍、桃仁、紅花、忍冬藤、牛膝各10g，薏苡仁、土茯苓各30g，蒼術(shù)15g，黃柏6g。加水煎煮2遍后混勻，旋蒸濃縮、干燥、粉碎后制成干粉。立加利仙（生產(chǎn)企業(yè)：昆山龍燈瑞迪制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20010790）。炎癥因子試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：20210814）購(gòu)自中國(guó)深圳華大基因股份有限公司。

1.2 造模及分組給藥方法：將40只SPF級(jí)的雄性昆明種小鼠進(jìn)行3d適應(yīng)性飼養(yǎng)后，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分成空白組、對(duì)照組、苯溴馬隆組、中藥組4組，每組10只。對(duì)照組和苯溴馬隆組、中藥組小鼠均腹腔注射氧嗪酸鉀混懸液300mg/（kg·d），并于1h后給予酵母膏灌胃，酵母膏用量為30000mg/（kg·d），均為每日1次，持續(xù)14d，以完成高尿酸血癥造模。完成造模后隔天，給予空白組與對(duì)照組小鼠0.9%NaCl 10mL/(kg·d)灌胃處理，苯溴馬隆組小鼠用苯溴馬隆溶液20mg/（kg·d）灌胃，而中藥組小鼠用清濕熱通絡(luò)方10mg/（kg·d）灌胃，均為1次/d，持續(xù)14d。試驗(yàn)期間對(duì)各組小鼠的飲食、活動(dòng)狀態(tài)、尿液和毛發(fā)等情況進(jìn)行觀察。在第28d灌胃給藥1h后，取各組小鼠的眼球血，放入4℃冰箱內(nèi)保存，待測(cè)。同時(shí)，完成采血后將各組小鼠脫頸處死，并對(duì)腹部進(jìn)行消毒備皮，將腹壁剖開(kāi)，使腹腔內(nèi)臟器暴露，找到腎臟，對(duì)腎周筋膜組織、脂肪組織實(shí)施游離處理，將雙側(cè)腎臟快速取下，并將血跡洗去，再將腎臟切開(kāi)，取腎組織2塊，用4%多聚甲醛實(shí)施固定，后開(kāi)展組織修剪及脫水處理、透明處理、包埋處理，將腎臟組織切成4mm厚的切片，并將切片烘干，實(shí)施脫蠟和梯度酒精水化、HE染色處理，用鹽酸乙醇實(shí)施分化處理，經(jīng)蒸餾水洗滌，返藍(lán)10min，再開(kāi)展伊紅復(fù)染及封片、鏡檢處理，觀察各組小鼠的腎臟組織形態(tài)表現(xiàn)。

1.3 血清學(xué)指標(biāo)：觀察并對(duì)比4組小鼠的血清尿酸、肌酐、炎癥因子（IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α）表達(dá)水平。從冰箱取出各組小鼠的血液標(biāo)本，靜置2h，開(kāi)展4000r/min低溫離心處理10min，留取血清。通過(guò)全自動(dòng)生化分析儀對(duì)各組小鼠的血清尿酸、肌酐水平進(jìn)行檢測(cè)，并經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對(duì)各組小鼠的血清IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平實(shí)施檢測(cè)，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：選擇SPSS 24.0軟件工具包校對(duì)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用n（%）描述，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠的血清尿酸和肌酐水平比較：對(duì)照組、苯溴馬隆組、中藥組小鼠的血清尿酸、肌酐水平均高于空白組（P＜0.05）；苯溴馬隆組、中藥組小鼠的尿酸、肌酐水平均低于對(duì)照組，且中藥組低于苯溴馬隆組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 4組小鼠血清尿酸、肌酐水平比較（±s，μmol/L）

表1 4組小鼠血清尿酸、肌酐水平比較（±s，μmol/L）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與對(duì)照組比較，#P＜0.05；與苯溴馬隆組比較，△P＜0.05。

肌酐43.16±10.47 72.36±13.18*64.82±10.23*#54.79±11.58*#△組別空白組對(duì)照組苯溴馬隆組中藥組例數(shù)10 10 10 10尿酸245.73±38.65 598.94±53.89*432.58±43.17*#315.91±41.52*#△

2.2 4組小鼠的血清炎癥因子水平比較：對(duì)照組、苯溴馬隆組、中藥組小鼠的血清IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平均高于空白組（P＜0.05）；苯溴馬隆組、中藥組小鼠的IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平均低于對(duì)照組，且中藥組低于苯溴馬隆組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 4組小鼠血清炎癥因子水平比較（±s，n=10）

表2 4組小鼠血清炎癥因子水平比較（±s，n=10）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與對(duì)照組比較，#P＜0.05；與苯溴馬隆組比較，△P＜0.05。

TNF-α（ng/mL）152.86±10.43 270.91±14.52*229.73±13.82*#180.58±12.24*#△組別空白組對(duì)照組苯溴馬隆組中藥組IL-1β（mg/L）15.70±3.04 42.26±2.85*33.67±2.43*#22.39±3.12*#△IL-6（ng/L）78.58±6.45 151.37±7.94*122.69±7.32*#93.94±6.81*#△IL-18（mg/L）17.48±2.93 51.57±3.08*36.29±3.11*#24.69±3.25*#△

2.3 4組小鼠的腎臟組織形態(tài)表現(xiàn)：空白組小鼠的腎臟組織細(xì)胞間呈整齊排列，腎小管和腎小球的結(jié)構(gòu)飽滿且清晰，小管上皮細(xì)胞形態(tài)正常且著色均勻；對(duì)照組小鼠的腎臟組織內(nèi)能發(fā)現(xiàn)腎小球略萎縮，腎小管呈大量空泡樣改變，并可見(jiàn)小管上皮細(xì)胞核分裂，間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；苯溴馬隆組小鼠的腎臟病變?nèi)悦黠@，腎小管空泡變性，間質(zhì)可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；中藥組小鼠的腎臟病變明顯好轉(zhuǎn)，能見(jiàn)少數(shù)腎小管空泡變性，其他功能顯著改善。見(jiàn)圖1。

圖1 清濕熱通絡(luò)方對(duì)高尿酸血癥小鼠腎臟組織形態(tài)的影響（×400）

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，高尿酸血癥能引起脂肪代謝紊亂、糖代謝紊亂和氨基酸代謝紊亂，破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，加快動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖與遷移，損害血管功能，進(jìn)而誘發(fā)心血管疾病[5，6]。進(jìn)一步研究數(shù)據(jù)顯示，高尿酸血癥患者的血尿酸水平上調(diào)時(shí)，尿酸鹽結(jié)晶大量析出，并沉積于血管壁，破壞血管內(nèi)膜，導(dǎo)致血管內(nèi)膜出現(xiàn)慢性炎癥損傷[7-9]；與此同時(shí)，血尿酸水平增高能將單核細(xì)胞核因子（NF）-kB激活，大量釋放IL-6、TNF-α等炎癥因子，使血清內(nèi)炎癥因子表達(dá)水平增高，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，破壞血管功能，增加血管內(nèi)膜厚度，誘發(fā)痛風(fēng)、冠心病等疾病。因此，對(duì)高尿酸血癥介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)進(jìn)行有效抑制，對(duì)臨床防治冠心病等疾病存在重要意義[10，11]。

清濕熱通絡(luò)方主要由柴胡、黃芩、白芍、桃仁、紅花、忍冬藤、薏苡仁、蒼術(shù)、黃柏、牛膝、土茯苓組成[12]。方中柴胡能和解表里、疏肝解郁、升陽(yáng)，黃芩、忍冬藤、薏苡仁、黃柏具有清熱解毒、通絡(luò)除濕等功效，白芍能柔肝止痛、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、平抑肝陽(yáng)、斂陰止汗，桃仁、紅花、牛膝具有活血祛瘀、止痛等作用，蒼術(shù)能祛風(fēng)散寒、燥濕健脾，土茯苓能清熱利濕，搜剔濕熱之蘊(yùn)毒[13]。綜觀清濕熱通絡(luò)方，全方能夠有效發(fā)揮清熱解毒、除濕和通經(jīng)活絡(luò)等作用，在高尿酸血癥對(duì)證治療中具有良好的療效。本研究通過(guò)分析清濕熱通絡(luò)方對(duì)高尿酸血癥小鼠血清尿酸、肌酐、炎癥因子表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組、苯溴馬隆組、中藥組小鼠的血清尿酸、肌酐、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平均高于空白組，但苯溴馬隆組、中藥組小鼠的尿酸、肌酐、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平均低于對(duì)照組，且中藥組低于苯溴馬隆組；提示清濕熱通絡(luò)方能有效降低高尿酸血癥小鼠的血清尿酸、肌酐和炎癥因子水平，控制病情進(jìn)展。分析原因主要是由于方中柴胡、黃芩、紅花、忍冬藤、土茯苓等中藥存在顯著的抗炎、清熱作用，能改善微循環(huán)，抗血小板聚集和擴(kuò)張血管，降低心腦血管疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[14，15]。腎臟病理分析結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠的腎臟組織內(nèi)能發(fā)現(xiàn)腎小球發(fā)生萎縮，且腎小管出現(xiàn)擴(kuò)張，呈大量空泡樣改變，說(shuō)明腎臟出現(xiàn)病變；而中藥組小鼠的腎臟病變明顯好轉(zhuǎn)，能見(jiàn)灶性腎小管空泡變性，其他功能顯著改善；提示清濕熱通絡(luò)方對(duì)腎損傷存在顯著的保護(hù)作用。

綜上所述，清濕熱通絡(luò)方能減少高尿酸血癥患者血清IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α表達(dá)，降低血清尿酸、肌酐水平，進(jìn)而有效改善腎臟組織形態(tài)，保護(hù)患者腎臟，可為臨床防治和研究分子機(jī)制提供參考。