ITP患兒免疫球蛋白、淋巴細胞亞群及Th17/Treg的表達分析

黃寶山，徐佳麗，姜 帥，李 蓉，張林美，李 莉

(1.江蘇省徐州市兒童醫(yī)院 221000；2.徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，江蘇徐州 221000)

免疫性血小板減少性紫癜(immune thrombocytopenic purpura，ITP)主要為血小板減少引起，發(fā)病機制涉及血管因素、脾臟因素、免疫因素及遺傳因素，患病后可表現(xiàn)為皮膚、黏膜出血，嚴重者可引起內(nèi)臟出血及顱內(nèi)出血，危急生命安全[1-2]。近幾年的研究顯示，免疫功能失調(diào)及相關細胞因子的紊亂可能參與ITP發(fā)生過程[3]。其中有報道顯示，巨噬細胞對血小板相關免疫球蛋白(platelet-associated immunoglobulin,PAIg)造成的吞噬、破壞是ITP發(fā)病的主要機制[4]。另有研究指出，T淋巴細胞異常分化而造成的細胞免疫調(diào)節(jié)機制異常亦為ITP的發(fā)病機制，其包括輔助性T細胞(helper T cells，Th)的失衡及調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Treg)的異常降低[5]。但目前臨床對于PAIg、淋巴細胞亞群及Th17/Treg失衡與ITP的發(fā)生及機制的研究較少。基于此，本研究探討ITP患兒PAIg、淋巴細胞亞群及Th17/Treg失衡情況，并分析其臨床價值，以期為ITP的臨床防治提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2018年9月至2021年9月徐州市兒童醫(yī)院收治的92例ITP患兒作為病例組。納入標準：(1)符合ITP診斷標準；(2)初次發(fā)?。?3)入組前均未經(jīng)治療；(4)臨床資料完整者。排除標準：(1)重要臟器功能不全者；(2)繼發(fā)性血小板減少癥；(3)血液疾病史者；(4)自身免疫性疾病患者。病例組中男42例，女50例，年齡4～13歲，平均(8.2±2.1)歲。另根據(jù)患兒性別、年齡為配伍原則，選取同期84例健康體檢兒童為對照組，其中男36例，女48例，年齡3～13歲，平均(8.1±2.2)歲。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

患兒入院后抽取肘靜脈血3 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，3 000 r/min離心，并將血清進行分離，取上清液于-80 ℃保存。(1)PAIg：PAIgG、PAIgA、PAIgM采用羅氏COBAS8000全自動生化免疫儀檢測(試劑盒購自北京中山生物技術有限公司)。(2)淋巴細胞亞群：CD3、CD4、CD8、CD19、CD16、CD56細胞采用流式細胞儀(EPICS ELITE型，美國BD公司)檢測，各淋巴細胞亞群的比例均采用SIMUL SET分析，其中CD3細胞為總T細胞，CD19細胞為總B細胞，CD4為Th，CD8為Treg，CD16和CD56為自然殺傷(natural killer，NK)細胞。(3)Th17/Treg：Th17及Treg比例采用流式細胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 兩組PAIg水平比較

病例組PAIgG、PAIgA、PAIgM水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組PAIg水平比較

2.2 兩組淋巴細胞亞群水平比較

病例組CD3、CD4、CD4/CD8、CD16+CD56水平低于對照組，CD8、CD19水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組淋巴細胞亞群水平比較

2.3 兩組Th17/Treg水平比較

病例組Th17、Treg及Th17/Treg水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 兩組Th17/Treg水平比較

2.4 相關性分析

Pearson相關性顯示，PAIgG、PAIgA、PAIgM、CD8、CD19與Th17、Treg均呈負相關，CD3、CD4、CD4/CD8、CD16+CD56與Th17、Treg、Th17/Treg均呈正相關(P<0.05)，見表4。

2.5 PAIg、淋巴細胞亞群及Th17/Treg對ITP的診斷價值

ROC曲線顯示，PAIgG、PAIgA、PAIgM、CD3、CD4、CD8、CD4/CD8、CD19、CD16+CD56、Th17、Treg及Th17/Treg診斷ITP具有一定準確性(AUC>0.7)，見表5、圖1～2。

圖1 PAIg及淋巴細胞亞群對ITP診斷的ROC曲線

表4 相關性分析

表5 PAIg、淋巴細胞亞群及Th17/Treg對ITP的診斷價值

圖2 淋巴細胞亞群及Th17/Treg對ITP診斷的ROC曲線

3 討 論

ITP為臨床常見的血小板減少性疾病，其發(fā)生率占出血性疾病的30%左右，并以外周血血小板數(shù)量減少、皮膚黏膜及內(nèi)臟出血和血小板膜糖蛋白特異性自身抗體的出現(xiàn)為主要臨床表現(xiàn)[6-7]。臨床研究指出，ITP血小板的破壞需以血小板、抗體及巨噬細胞存在為基礎，同時具備充分的時間使機體對抗原接觸、致敏，產(chǎn)生抗體并結合，促使巨噬細胞對抗體結合的血小板進行吞噬[8-9]。且目前研究顯示，自身抗體致敏的血小板被體內(nèi)巨噬細胞大量吞噬、破壞是ITP的主要發(fā)病機制，因此，在ITP患者的血小板表面可檢測到PAIgG、PAIgA、PAIgM等相關抗體[10-11]。另有研究證實，與健康者相比，ITP患者血清中PAIg水平異常升高，故有效檢測ITP患者血清中PAIg水平對ITP的診斷具有一定的價值[12]。本研究病例組PAIgG、PAIgA、PAIgM水平均高于對照組，且ROC曲線顯示PAIgG、PAIgA、PAIgM診斷ITP的AUC、靈敏度及特異度均較高，該結果與高婧等[13]研究結論具有一致性，提示ITP發(fā)病機制中體液免疫具有重要作用。

T淋巴細胞在免疫反應中可作為細胞及體液免疫反應的重要環(huán)節(jié)，其可在抗原刺激下活化，產(chǎn)生大量的淋巴因子，在機體免疫中具有調(diào)節(jié)作用[14]。正常情況下，T淋巴細胞亞群之間的正常比例及功能形成是免疫應答的基礎，CD4、CD8細胞間相互制約及相互誘導形成的T細胞網(wǎng)絡是維持機體免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要環(huán)節(jié)，而其平衡異常是免疫介導性疾病損傷的重要因素[15]。本研究中，與健康人群相比，ITP患兒外周血的CD3、CD4、CD4/CD8、CD16+CD56水平均降低，而CD8、CD19水平均升高。其原因可能為：ITP患兒CD4水平下降主要為誘導細胞的數(shù)目降低、功能減弱，而CD8增加后可降低誘導細胞對T抑制細胞的誘導作用，造成T抑制細胞功能減弱，因此，無法充分抑制B細胞，使B細胞功能亢進，所以CD19水平升高[16]。另ROC結果顯示，CD3、CD4、CD8、CD4/CD8、CD19、CD16+CD56診斷ITP的AUC分別為0.851、0.772、0.846、0.949、0.956、0.750，均具有一定準確性。以上結果提示，除體液免疫機制外，淋巴細胞亦可能參與ITP的發(fā)生、發(fā)展過程。

Treg為CD4+T細胞的新亞群，具有維持機體免疫平衡作用。研究顯示，Treg不僅可對機體過度免疫造成的損傷產(chǎn)生抑制作用，且可對宿主的免疫性保護作用進行抑制，影響機體對病原體的清除[17]。且已有研究指出，Treg可分泌大量白細胞介素(interleukin，IL)-4、IL-10及轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)等細胞因子，進一步參與機體炎性反應及免疫應答[18]。近年來的研究顯示，ITP患兒外周血中Treg水平異常，其數(shù)量的減少可減弱T淋巴細胞活化增殖，進一步對機體免疫耐受產(chǎn)生破壞，造成機體免疫平衡狀態(tài)失衡[19]。分析其原因為：CD4+T細胞數(shù)量的減少使機體中參與免疫抑制作用的細胞隨之減少，破壞了機體免疫耐受平衡，降低了機體免疫抑制功能，進一步激活了自身反應性T細胞；同時，機體免疫平衡破壞后，B細胞的活化及增殖可促使機體產(chǎn)生相應的抗體，以上均可造成體液免疫及細胞免疫異常，進而破壞血小板。這與ITP發(fā)生、發(fā)展過程相符，故Treg的減少可能參與ITP發(fā)生、發(fā)展。而Th17亦為CD4+T細胞亞群的一種，其主要分泌IL-17、IL-21、IL-22等炎性因子，分泌的大量炎性細胞因子促進中性粒細胞的活化及聚集，介導炎癥級聯(lián)反應放大，因此，可參與感染性疾病、自身免疫性疾病及惡性腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展。本研究中，病例組Th17水平低于對照組，且ROC曲線顯示，Th17對ITP具有一定的診斷價值?？紤]為Th17細胞可分泌大量的IL-17分子，誘導其他細胞因子產(chǎn)生，導致ITP患兒機體中免疫調(diào)節(jié)功能異常，影響疾病的發(fā)生、發(fā)展。另Treg及Th17均源自共同的細胞分化前體，正常情況下二者相互拮抗，可維持機體免疫平衡穩(wěn)定。本研究中病例組Th17/Treg水平低于對照組，相關性分析顯示PAIgG、PAIgA、PAIgM、CD8、CD19與Th17、Treg均呈負相關，CD3、CD4、CD4/CD8、CD16+CD56與Th17、Treg、Th17/Treg均呈正相關(P<0.05)，提示Th17/Treg失衡可能在ITP的發(fā)生、發(fā)展中具有一定的作用。

綜上所述，ITP作為自身免疫性疾病，其發(fā)生、發(fā)展不僅與體液免疫異常有關，還與細胞免疫異常有關，同時Th17/Treg相互制約的關系可維持機體免疫平衡。