基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接探討參苓白術(shù)散對(duì)慢性腎小球腎炎和抑郁癥異病同治的作用機(jī)制

鄭舒文，王柏森，李志明，王圣治

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 1.研究生學(xué)院，沈陽(yáng) 110847；2.附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，沈陽(yáng) 110032）

慢性腎小球腎炎（chronic glomerulonephritis，CGN）是我國(guó)最常見的慢性腎臟病之一，病程較長(zhǎng)者可致慢性腎衰竭，其病理機(jī)制尚未明確且無(wú)特效藥物［1-2］。抑郁癥主要表現(xiàn)為情緒低落，對(duì)周邊事物漠不關(guān)心，產(chǎn)生自責(zé)心理［3-4］，嚴(yán)重影響患者的健康和生活質(zhì)量［5］，其發(fā)病可能與多種因素有關(guān)［6-10］?？挂钟羲幹委熢诙唐诰哂幸欢ㄗ饔?，但其不良反應(yīng)亦不容忽視［11-12］。CGN和抑郁癥目前均無(wú)明確病理機(jī)制及特效藥，而中醫(yī)在慢性疾病治療方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。中醫(yī)異病同治是中醫(yī)基礎(chǔ)重要理論之一，不同疾病其病機(jī)相同即可用同一藥方治療。參苓白術(shù)散出自《太平惠民和劑局方》［13］。已有研究［14］表明，加味參苓白術(shù)散治療脾腎兩虛型CGN，療效確切，改善臨床癥狀效果顯著；也有研究［15］表明，以參苓白術(shù)散為底方，運(yùn)用健脾益氣法治療老年抑郁癥患者，總有效率91%。由于CGN和抑郁癥均有脾虛證，而參苓白術(shù)散有益氣補(bǔ)脾的作用，為異病同治提供了理論依據(jù)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)主要通過建立“成分-靶標(biāo)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)的方法分析藥物的作用機(jī)制［16］，由此可知一種靶點(diǎn)可調(diào)控多種疾病，這種調(diào)控過程和中醫(yī)的異病同治類似。參苓白術(shù)散治療CGN和抑郁癥均效果良好，因此，本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接的方法分析其異病同治的作用機(jī)制，以證明中醫(yī)藥在2種疾病中的作用。

1 材料與方法

1.1 參苓白術(shù)散化學(xué)成分及靶點(diǎn)的搜尋

運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP）數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），搜索參苓白術(shù)散方組成中10種中藥的活性成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性指數(shù)（drug like index，DL）≥0.18［17］為條件，對(duì)收集的信息進(jìn)行篩選。并利用 Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org）的注釋文件將藥物靶點(diǎn)基因規(guī)范化。

1.2 參苓白術(shù)散治療CGN和抑郁癥共同靶點(diǎn)的篩選

利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org）和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.omim.org），獲取CGN和抑郁癥的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。將該靶點(diǎn)及參苓白術(shù)散對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)導(dǎo)入在線軟件Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）取交集，并繪制韋恩圖。

1.3 “中藥-活性成分-共同靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

用Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建參苓白術(shù)散治療CGN和抑郁癥的“中藥-活性成分-共同靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。對(duì)上述網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯渲?，度的?shù)值越大，該成分越有可能為參苓白術(shù)散治療的潛在活性成分。

1.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選

在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//string-db.org）中上傳共有靶點(diǎn)，并將物種設(shè)置成人類，取最高置信度，數(shù)值0.900，其余參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)，獲得蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件可視化，拓?fù)浞治龊筮x取度值較高的前10個(gè)靶點(diǎn)，即參苓白術(shù)散異病同治的核心靶點(diǎn)。

1.5 通路分析

將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/），限定物種為人類，對(duì)參苓白術(shù)散“異病同治”的作用靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，按P值從小到大排序，繪制排名前20的結(jié)果圖。

1.6 分子對(duì)接

從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org/）分別下載活性成分的分子結(jié)構(gòu)，以及核心靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，并導(dǎo)入Sybyl-X2.1.1軟件進(jìn)行分子對(duì)接。若對(duì)接得分＞4.25，表明分子與蛋白具有對(duì)接活性；若對(duì)接得分＞5，表明具有較好的對(duì)接活性；若對(duì)接結(jié)果＞7，則認(rèn)為具有高度的對(duì)接活性。

2 結(jié)果

2.1 參苓白術(shù)散的活性成分和靶點(diǎn)篩選

從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得參苓白術(shù)散中10味中藥的活性成分，其中，人參22種、白術(shù)7種、茯苓15種、桔梗7種、白扁豆1種、甘草92種、蓮子心11種、薏苡仁9種、山藥16種、砂仁10種，將活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)刪除重復(fù)后獲得225個(gè)靶點(diǎn)，將結(jié)果繪制“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）。

圖1 “成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 "Component-target" network diagram

2.2 CGN和抑郁癥的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中，CGN對(duì)應(yīng)刪除重復(fù)后靶點(diǎn)1 806個(gè)，抑郁癥對(duì)應(yīng)刪除重復(fù)后靶點(diǎn)12 997個(gè)。在Venny2.1.0中得到參苓白術(shù)散異病同治2種疾病潛在作用靶點(diǎn)共計(jì)103個(gè)，并繪制韋恩圖（圖2）。

圖2 共有作用靶點(diǎn)韋恩圖Fig.2 Venn diagram of common action target

2.3 “中藥-活性成分-共同靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)

在參苓白術(shù)散異病同治2種疾病的“中藥-活性成分-共同靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）中，活性成分槲皮素（MOL000098）、木犀草素（MOL000006）、山奈酚（MOL000422）為參苓白術(shù)散異病同治的關(guān)鍵活性成分，其中，槲皮素作用于75個(gè)靶點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)度最好。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)圖共有節(jié)點(diǎn)97個(gè)，邊912個(gè)。其中，參苓白術(shù)散異病同治的核心靶點(diǎn)是STAT3、JUN、RELA、MAPK1、TP53、AKT1、HSP90AA1、MAPK14、IL6、ESR1。

2.5 通路分析

共獲得參苓白術(shù)散與疾病共有靶點(diǎn)的基因本體論（gene ontology，GO）富集結(jié)果508條（P＜0.05），共同靶點(diǎn)主要影響生物學(xué)結(jié)果（biological process，BP）383條，主要包括DNA模板轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、對(duì)藥物的反應(yīng)；結(jié)果中，細(xì)胞的組成（cellular component，CC）43 條，主要包括胞外區(qū)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外間隙；分子功能（molecular function，MF）的結(jié)果82條，主要包括蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、酶結(jié)合等。

京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析涉及信號(hào)通路109條（P＜0.05），其中，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）信號(hào)通路、以磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B（phosphatidylinositol 3 kinase-protein kinase B，PI3K-Akt）信號(hào)、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（nucleotide-binding oligomerization domain，NOD）樣受體信號(hào)通路為參苓白術(shù)散異病同治的主要的“明星通路”。

2.6 分子對(duì)接

對(duì)接結(jié)果顯示，分子與晶體均具有結(jié)合活性。其中α-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT）1與3種蛋白晶體均具有較好的對(duì)接活性，與槲皮素對(duì)接得分7.617，具有高度的對(duì)接活性。依據(jù)對(duì)接得分值繪制熱圖（圖4），同時(shí)繪制AKT1與3種活性成分對(duì)接構(gòu)象（圖5）。

圖4 對(duì)接得分值熱圖Fig.4 Docking scoring value heat map

圖5 AKT1與槲皮素、木犀草素、山奈酚對(duì)接構(gòu)象Fig.5 Docking conformation of AKT1 with quercetin，luteolin and kaempferol

3 討論

中醫(yī)理論認(rèn)為，CGN與抑郁癥的共同發(fā)病機(jī)制在于脾失健運(yùn)。參苓白術(shù)散作為補(bǔ)益脾胃的經(jīng)典方劑，已被臨床廣泛應(yīng)用。異病同治是中醫(yī)辨證論治的基本特點(diǎn)之一，也是《黃帝內(nèi)經(jīng)》原文中“治病必求于本”的重要體現(xiàn)［18］。在古代醫(yī)書中雖未記載CGN病名，但根據(jù)其癥狀，可從醫(yī)家經(jīng)典中發(fā)現(xiàn)一些線索。如《黃帝內(nèi)經(jīng)》中有“慢腎風(fēng)”“風(fēng)水”“水脹”等病名；《金匱要略》中也提到十一類水腫；這些疾病的臨床表現(xiàn)與CGN類似［19-21］。脾虛是CGN的核心病機(jī)，正所謂“四季脾旺不受邪”［22］。脾失固攝則精微物質(zhì)下泄，尿中出現(xiàn)蛋白等物質(zhì)［23］，脾虛則土不制水故出現(xiàn)水腫。海派名醫(yī)童少伯從脾論治CGN，認(rèn)為CGN病本在脾，脾在中焦調(diào)控肺腎兩臟［24］?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》有云“脾在志為思”“思傷脾”，憂思過度則會(huì)傷及脾臟，脾的運(yùn)化功能與西醫(yī)消化系統(tǒng)相似，現(xiàn)代研究［25-26］表明腸道菌群可影響神經(jīng)遞質(zhì)、HPA軸等，從而導(dǎo)致抑郁癥。

槲皮素是參苓白術(shù)散中對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)最多的核心成分。已有研究［27-28］表明，槲皮素有抗炎、抗氧化、預(yù)防神經(jīng)凋亡等作用，戴恩來(lái)等［29］研究表明槲皮素干預(yù)可修復(fù)足細(xì)胞損傷，進(jìn)而保護(hù)腎小球?yàn)V過膜。華深等［30］通過對(duì)小鼠進(jìn)行應(yīng)激刺激并用槲皮素進(jìn)行干預(yù)，闡明了槲皮素對(duì)抑郁癥的治療效果及機(jī)制。

本研究中，KEGG分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，參苓白術(shù)散作用于109個(gè)信號(hào)通路，其中TNF信號(hào)通路等5種信號(hào)通路相關(guān)性較高。TNF信號(hào)通路作為一種炎癥信號(hào)通路，介導(dǎo)多種炎癥反應(yīng)，調(diào)控多種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，TNF信號(hào)通路及其下游白細(xì)胞介素-6等炎性細(xì)胞因子在抑郁癥患者外周血中濃度增加［31］，在腎組織中TNF信號(hào)通路及下游表達(dá)升高則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因子失衡，進(jìn)而增加CGN的疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)［32］。Toll樣受體可觸發(fā)產(chǎn)生免疫復(fù)合物，與腎臟損傷有一定的聯(lián)系［33］。研究［34］發(fā)現(xiàn)，慢性腎炎患者外周血淋巴細(xì)胞中，Toll樣受體表達(dá)顯著上調(diào)，引起炎癥損傷。通過調(diào)控Toll樣受體信號(hào)通路可修復(fù)神經(jīng)損傷，達(dá)到抗抑郁的效果［35］。HIF-1和NOD樣受體信號(hào)通路參與多種炎癥反應(yīng)，NOD樣受體信號(hào)通路可以激活下游核因子κB信號(hào)通路［36］，這些炎癥反應(yīng)均參與CGN和抑郁癥發(fā)生和發(fā)展，調(diào)控上述2種信號(hào)通路在疾病抗炎治療中起重要的作用。PI3K-AKT信號(hào)通路參與多種自身免疫性疾病，在多種慢性腎臟病中顯著上調(diào)并參與炎癥和增殖，且該通路與抑郁癥的關(guān)系明確，多種抗抑郁藥物通過該通路發(fā)揮作用，如文拉法辛可通過該通路抑制神經(jīng)元凋亡［37］，從而發(fā)揮抗抑郁的作用。

本研究通過2種技術(shù)對(duì)參苓白術(shù)散治療CGN及抑郁癥的作用機(jī)制進(jìn)行了分析，與異病同治理論相對(duì)應(yīng)。將參苓白術(shù)散治療2種疾病的共同靶點(diǎn)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)10個(gè)核心靶點(diǎn)作用于RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、DNA模板轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)、對(duì)藥物的反應(yīng)等生物學(xué)過程，調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路，繼而調(diào)控CGN與抑郁癥。分子對(duì)接結(jié)果顯示，上述10個(gè)核心靶點(diǎn)與參苓白術(shù)散的主要活性成分都具有對(duì)接活性，也從側(cè)面證明了參苓白術(shù)散主要是通過這些核心靶點(diǎn)對(duì)CGN及抑郁癥發(fā)揮異病同治的作用。值得注意的是，AKT1與這3種活性成分都具有最高的對(duì)接得分。AKT1也是PI3K-AKT信號(hào)通路的重要組成部分，該通路也是參苓白術(shù)散異病同治過程中的“明星通路”，也從一定程度上反映了參苓白術(shù)散可以通過這些核心靶點(diǎn)發(fā)揮異病同治的作用。

綜上所述，本研究在微觀上證明了異病同治理論的可行性，豐富了其內(nèi)涵。雖然應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法可以探究中藥在CGN與抑郁癥的作用機(jī)制，但其本身具有一定的局限性，因此，仍然需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。