探討小劑量氯胺酮抑制癌痛大鼠嗎啡耐受機(jī)制

張俊霞，梁艷芳，張秀寧，徐貫杰，李志華，劉春曉

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院手術(shù)麻醉二科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院；3.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院手術(shù)麻醉一科）

絕大多數(shù)癌癥患者到中晚期后，最難以忍受的臨床癥狀即無法緩解的重度疼痛，重度癌痛具備長期性、漸進(jìn)性及復(fù)雜性等特征，不僅對病人生理、心理及人際關(guān)系產(chǎn)生不良影響，而且對機(jī)體免疫功能也產(chǎn)生重要影響，其中以骨癌疼痛為著[1]。目前臨床上多采用手術(shù)、放化療、阿片類止痛藥物來緩解中重度骨轉(zhuǎn)移性癌痛。但絕大數(shù)患者不能得到滿意的鎮(zhèn)痛效果，這促使最大限度地幫助晚期癌癥患者緩解疼痛、解除疼痛帶來副作用逐漸成為臨床醫(yī)生的首要任務(wù)。

阿片類止痛藥物被世界衛(wèi)生組織指定作為抗擊晚期癌痛治療的“第三階梯”用藥，通過與不同腦區(qū)阿片受體結(jié)合抑制P物質(zhì)釋放干擾中樞系統(tǒng)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，鞘內(nèi)給藥長效治療效果廣受臨床醫(yī)生認(rèn)可[2]。但最新研究指出長期應(yīng)用嗎啡抗擊癌痛除產(chǎn)生的耐藥性及毒副作用外，其亦參與癌細(xì)胞的擴(kuò)散與發(fā)展，因此限制了其在臨床中的使用[3]。

氯胺酮是一種N-甲基D-天氨酸受體選擇性拮抗藥，作為短效鎮(zhèn)痛劑，早有報(bào)道指出小劑量鞘內(nèi)注射可以輔助增加嗎啡等阿片類鎮(zhèn)痛藥物的鎮(zhèn)痛效果，同時(shí)一定程度逆轉(zhuǎn)嗎啡長期應(yīng)用產(chǎn)生機(jī)體耐受性[4]。國內(nèi)外臨床醫(yī)生及學(xué)者推薦可鞘內(nèi)注射小劑量氯胺酮聯(lián)合嗎啡協(xié)同參與鎮(zhèn)痛的治療，減輕嗎啡耐藥性及毒性作用[5]。本研究擬通過觀察小劑量氯胺酮鞘內(nèi)注射嗎啡癌耐受小鼠模型影響并進(jìn)行相關(guān)機(jī)制探討。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及動物

MADB-106乳腺癌細(xì)胞（購于拜力生物科技有限公司，上海）。SPF級健康雌性SD大鼠，體質(zhì)量為230~250 g（購于河北醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心）。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫（25±0.5）℃，混合飼料和純凈水喂養(yǎng)，自由飲食飲水。

1.2 藥物和試劑

鹽酸嗎啡注射液（購自沈陽第一制藥廠，東北制藥廠批號081105-1，國藥準(zhǔn)字H21022436）；鹽酸氯胺酮注射液（購自恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，江蘇，批號KH090501）；DMEM高糖（購自GIBCO公司）；胎牛血清（購自CLARK公司）；二甲基亞砜（購自勃盛化學(xué)試劑有限公司）；胰蛋白酶-EDTA（購自宏瑞特生物技術(shù)有限公司）；緩激肽檢測試劑盒（購自R&D公司，美國）；兔Substance-P抗體（購自博士德生物工程有限公司）；濃縮型DAB試劑盒（購自中杉金橋公司，北京）；SP免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒（購自博海生物工程有限公司）；Poly-L-LysineSolution（多聚賴氨酸，購自博海生物工程有限公司，河北）。

1.3 動物模型的制備

1.3.1 在癌痛大鼠模型基礎(chǔ)上制作本研究所用脛骨癌痛模型。將10%水合氯醛350 mg/kg注射入大鼠腹腔麻醉后，將大鼠仰臥位捆綁固定于操作板，使用有齒鑷夾腳趾，直到大鼠對鉗夾無反應(yīng)，同時(shí)均勻自主呼吸，判定為麻醉滿意。穿刺部位統(tǒng)一選為大鼠左側(cè)脛骨上段，與膝關(guān)節(jié)距離1 cm處，模型組（B組）將乳腺癌細(xì)胞3μl（大約4.8×106/mL）注入大鼠脛骨骨髓腔，注射完畢后5 min將針頭拔出，并用骨蠟迅速封孔，逐層縫合?？瞻讓φ战M（A組）以同樣操作規(guī)范注射相同容積的生理鹽水，假手術(shù)組（C組）進(jìn)行手術(shù)操作，不進(jìn)行藥物注射。分別于術(shù)后8 d、14 d以大鼠自由行走痛行為、輻射熱痛閾、X線影像學(xué)及患肢脛骨HE染色驗(yàn)證癌痛模型建立成功與否。

1.3.2 慢性嗎啡鎮(zhèn)痛耐受模型的制備 建模成功的脛骨癌痛大鼠于手術(shù)后21 d連續(xù)皮下注射鹽酸嗎啡注射液（10 mg/kg，2次/d，間隔12 h，共9 d），制做嗎啡鎮(zhèn)痛耐受模型；隔天測定痛閾，以監(jiān)測大鼠痛閾的變化和有無嗎啡鎮(zhèn)痛耐受發(fā)生。

1.4 分組及給藥

對癌痛嗎啡耐受大鼠（即手術(shù)后30 d）進(jìn)行鞘內(nèi)置管，將上述癌痛大鼠模型隨機(jī)分為4組，對照組（F組）：鞘內(nèi)注射0.9%生理鹽水10μL，1次/d；氯胺酮組（G組）：鞘內(nèi)注射氯胺酮注射液25μg（10μL），1次/d；嗎啡組（H組）：皮下注射嗎啡10 mg/kg，2次/d；氯胺酮聯(lián)合嗎啡組（I組）：皮下注射嗎啡10 mg/kg，2次/d，鞘內(nèi)注射氯胺酮25μg（10μL），1次/d。

1.5 監(jiān)測指標(biāo)及方法

癌痛模型術(shù)前1日至實(shí)驗(yàn)37日通過間斷監(jiān)測輻射熱痛閾觀察疼痛行為學(xué)的變化。

免疫組織化學(xué)染色方法和固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附方法—實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第37 d時(shí)，最后一次給大鼠注藥后，等待1 h，以斷頭法立即處死大鼠，摘取大鼠腰4到腰6脊髓節(jié)段，取下約2 cm長脊髓，取1 cm脊髓將上述組織即刻浸泡于濃度為4%多聚甲醛液固定24 h，用免疫細(xì)胞化學(xué)（IH）染色法檢測SP含量。將余留1 cm脊髓組織置于液氮中保存，取材結(jié)束后將其余脊髓標(biāo)本放置于溫度為-80℃冰箱保存，用ELISA法檢測脊髓BK含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 組織病理學(xué)改變

癌痛模型建立成功的大鼠8 d后，經(jīng)HE染色可見左側(cè)脛骨骨髓腔內(nèi)及骨小梁間出現(xiàn)較多形狀改變、多個(gè)細(xì)胞核的腫瘤細(xì)胞，骨小梁組織結(jié)構(gòu)未出現(xiàn)改變；14 d觀察到骨髓腔上述腫瘤細(xì)胞有所增加，并且癌細(xì)胞絕大多數(shù)表現(xiàn)活躍，X線顯示骨小梁遭到廣泛侵襲，骨皮質(zhì)受破壞后變薄，其周圍可見較多編織骨；37 d經(jīng)HE染色后，大量腫瘤細(xì)胞充斥在骨髓腔內(nèi)，中央大部分組織已退變壞死，骨髓腔邊緣腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)活躍。腫瘤組織表現(xiàn)為向外生長造成更大范圍的骨皮質(zhì)侵襲、破壞（見圖1）。

圖1

2.2 癌痛大鼠模型X線檢查

患肢X線顯示骨質(zhì)破壞明顯，并且隨時(shí)間延長骨破壞程度增加。建模后10 d注射部位松質(zhì)骨表現(xiàn)為局限的低密度缺如影像；第20 d骨損害逐漸嚴(yán)重，骨皮質(zhì)完全破壞，出現(xiàn)更大面積的病損，2只大鼠已發(fā)生病理性骨折（見圖2）。

圖2

2.3 大鼠痛閾值比較

癌痛大鼠模型（B組）痛閾值與空白對照組（A組）大鼠和假手術(shù)組（C組）大鼠比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即癌痛大鼠模型痛閾值低于正常大鼠和假手術(shù)組大鼠（見圖3）。用藥處理前C組、G組、H組及I組間痛閾值差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），用藥7 d后痛閾比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中I組痛閾顯著低于F組、H組和G組（P＜0.05）（見圖4）。

圖3

圖4

2.4 緩激肽表達(dá)影響

F組、H組、G組及I組與A組緩激肽表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。F組與G組緩激肽表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；F組與H組緩激肽水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；I組和H組比較，緩激肽表達(dá)水平顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見圖5）。

圖5

2.5 大鼠脊髓SP表達(dá)變化

F組在3個(gè)實(shí)驗(yàn)動物組中的陽性反應(yīng)最大，陽性指征的黃色顆粒呈密集分布。I組脊髓背角Ⅰ-Ⅱ?qū)油挥|素免疫陽性產(chǎn)物表達(dá)比H組明顯減少。用IPP圖像分析軟件檢測，結(jié)果顯示I組脊髓背角SP平均光密度值明顯低于其他3組[I組（0.02±0.03）、F組（0.25±0.02）、G組（0.21±0.02）、H組（0.22±0.03），P＜0.05]（見圖6）。

圖6

3 討論

癌痛多指癌癥本身、因癌癥引發(fā)的其他病變以及治療癌癥所引起的疼痛，作為癌癥患者最常見晚期并發(fā)癥，約38%~56%患者終末期發(fā)生中重度癌痛，其中10%~20%發(fā)生難治性癌痛。晚期的骨轉(zhuǎn)移性癌痛不僅在生理上給患者帶來痛苦，而且在心理上給患者帶來極大的不良影響，使患者在癌癥晚期極其痛苦，喪失對生活的希望和信心。阿片類止痛藥是“第三階梯”緩解癌痛的首選藥物，也是WHO推薦控制中重度癌痛的主要用藥。嗎啡一直被公認(rèn)為是最有效的、最基礎(chǔ)的抗癌止痛劑。但無論是口服、靜脈還是其他方式給藥，單一、長期應(yīng)用可引起機(jī)體耐受，甚至部分患者產(chǎn)生依賴等一系列不良反應(yīng)[6]。近年來有臨床報(bào)道指出，常規(guī)給予阿片類鎮(zhèn)痛藥的同時(shí)復(fù)合低劑量氯胺酮可有效減低阿片類藥物耐藥性的發(fā)生。同時(shí)證實(shí)小劑量氯胺酮可以有效降低嗎啡耐受性的產(chǎn)生，但至今具體機(jī)制尚未明確定論[7，8]。本實(shí)驗(yàn)通過給予嗎啡耐受癌痛大鼠模型鞘內(nèi)注射低劑量氯胺酮，并觀察產(chǎn)生的效果影響，并對其可能存在的機(jī)制進(jìn)行研究，希望可以更好地指導(dǎo)臨床上對于骨癌痛的治療。

癌痛中骨癌痛最常見、顯著、典型；其次，骨癌痛大鼠模型也是成功率最高、疼痛部位最為穩(wěn)定、行為學(xué)改變最接近人類改變的動物模型[9，10]。因此，本研究擬定骨轉(zhuǎn)移性癌痛大鼠模型作為研究對象。參照既往癌痛大鼠模型制備基礎(chǔ)上，我們選用與本研究實(shí)驗(yàn)動物同源的MADB-106乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行脛骨癌痛大鼠模型制備。造模成功后分別從病理組織、X線影像表現(xiàn)及疼痛閾值等幾個(gè)角度進(jìn)行骨癌模型評價(jià)。證實(shí)MADB-106乳腺癌細(xì)胞具備大鼠脛骨建立骨癌痛模型可行性且造模成功率也得到了顯著的提高。

氯胺酮（Ketamine）是苯環(huán)己哌啶（Phencyclidine）的衍生物，作為臨床常用靜脈麻醉藥物代表，不同劑量下親和多種受體（阿片受體）與離子通道（鈉鉀離子通道），對不同腦區(qū)多種關(guān)鍵分子、多種基本神經(jīng)活動功能存在廣泛影響而產(chǎn)生多樣藥理作用[11]。鞘內(nèi)給藥的優(yōu)勢是使得藥物迅速在腦脊液中擴(kuò)散開來以獲得有效的血藥濃度[12]。Borgbjerg等[13]證實(shí)小劑量鞘內(nèi)給藥不僅無組織學(xué)損傷亦可使其發(fā)揮有效作用，同時(shí)避免大劑量用藥產(chǎn)生的分離麻醉、精神異常等氯胺酮副反應(yīng)。Fisher等[14]亦提倡鞘內(nèi)或硬膜外氯胺酮給藥。因此，我們通過鞘內(nèi)小劑量注射氯胺酮（＜1 mg/kg）方式進(jìn)行給藥干預(yù)，以疼痛閾值及自由行走痛行為學(xué)指標(biāo)作為研究觀察指標(biāo)。結(jié)果證實(shí)單純鞘內(nèi)給予小劑量氯胺酮雖然有止疼效果，但因其維持時(shí)間較短，故不建議以此方法給藥。氯胺酮干預(yù)組嗎啡耐受大鼠模型鎮(zhèn)痛作用較慢性嗎啡耐受模型組鎮(zhèn)痛作用存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)二者聯(lián)合應(yīng)用可增強(qiáng)鎮(zhèn)痛作用且一定程度緩解了嗎啡用藥產(chǎn)生的耐受性。這一研究與Schmid等[15]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，即鞘內(nèi)小劑量氯胺酮能夠降低嗎啡耐受，增強(qiáng)嗎啡對軀體和內(nèi)臟的止疼效果。眾所周知，嗎啡通過與阿片受體結(jié)合，對腺苷酸環(huán)化酶-環(huán)磷酸腺苷（AC-cA MP）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路產(chǎn)生抑制作用而發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)。長期嗎啡治療使機(jī)體產(chǎn)生一系列適應(yīng)性改變，如阿片類受體出現(xiàn)數(shù)量降低、內(nèi)化、與Gi蛋白脫耦聯(lián)及環(huán)磷酸腺苷（cAMP）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的上調(diào)及超敏等磷酸化反應(yīng)，最終引起參與疼痛通路傳導(dǎo)中重要緩激肽與腫瘤細(xì)胞表面B2受體結(jié)合使胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生高濃度Ca2+，激活NOS產(chǎn)生NO激活鳥苷酸環(huán)化酶，產(chǎn)生高濃度cGMP引起機(jī)體耐受[16，17]。氯胺酮作為少有的用于治療復(fù)雜的區(qū)域性疼痛綜合征（comp lex regional pain syndrome，CRPS）的有效藥物，鎮(zhèn)痛作用是廣受臨床認(rèn)可的。但其緩解疼痛的機(jī)理較為復(fù)雜，目前報(bào)道較多的一方面通過與阿片受體相互作用實(shí)現(xiàn)鎮(zhèn)痛作用[18]。因此可認(rèn)為以上機(jī)制研究為氯胺酮增強(qiáng)嗎啡耐受癌痛大鼠模型鎮(zhèn)痛作用提供了理論依據(jù)。同時(shí)有研究指出長期應(yīng)用嗎啡cAMP/PKA通路上調(diào)使得NMDA受體磷酸化及表達(dá)量明顯上調(diào)，氯胺酮本身為NMDA受體拮抗劑，因此，我們認(rèn)為抑制NMDA受體發(fā)揮作用也是其嗎啡耐受主要機(jī)制之一[19]。另一方面作為NMDAR阻斷劑，有報(bào)道指出其可通過干預(yù)慢性痛中樞（即脊髓及更高級中樞神經(jīng)系統(tǒng)）敏感化過程實(shí)現(xiàn)鎮(zhèn)痛作用[20]。研究表明引發(fā)疼痛的關(guān)鍵是中樞神經(jīng)系統(tǒng)敏化和外周神經(jīng)系統(tǒng)的超敏反應(yīng)[21]。我們通過觀察氯胺酮干預(yù)組脊髓P物質(zhì)及緩激肽含量表達(dá)發(fā)現(xiàn)明顯低于單純嗎啡耐受癌痛大鼠模型。脊髓SP是主要的痛覺信號傳遞物質(zhì)，由背根神經(jīng)節(jié)中的神經(jīng)元構(gòu)成，終末端作用在脊髓后角及三叉神經(jīng)脊束神經(jīng)核尾側(cè)亞核。氯胺酮作用于后激活NMDA受體拮抗劑對疼痛信息疼痛傳遞起到負(fù)性調(diào)控作用從而減緩嗎啡耐受癌痛大鼠模型疼痛閾值及行為[22]。因此，我們推測氯胺酮通過調(diào)節(jié)脊髓P物質(zhì)起到疼痛調(diào)節(jié)過程。同理，緩激肽釋放也受NMDA激活通路影響。因此，我們有理由推測氯胺酮拮抗嗎啡耐受可通過對脊髓P物質(zhì)及緩激肽釋放調(diào)節(jié)輔助嗎啡鎮(zhèn)痛作用。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C組、K組、M組及K+M組與Control組的緩激肽水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。K+M組和M組比較，緩激肽表達(dá)水平表現(xiàn)為明顯下調(diào)。相關(guān)分析軟件檢測表明K+M組脊髓背角SP平均光密度值顯著低于其余組。以上結(jié)果表明，緩激肽和脊髓SP物質(zhì)可以用來評價(jià)嗎啡耐受癌痛大鼠模型鞘內(nèi)氯胺酮聯(lián)合嗎啡的鎮(zhèn)痛效果。

綜上所述，嗎啡耐受癌痛大鼠模型鞘內(nèi)氯胺酮聯(lián)合嗎啡作用可以增強(qiáng)嗎啡抗擊癌痛作用，同時(shí)減輕嗎啡引起耐受及戒斷反應(yīng)，其中，以脊髓P物質(zhì)及緩激肽水平表達(dá)評價(jià)其鎮(zhèn)痛效應(yīng)具有可行性。