腦小血管病實驗動物模型及制備方法研究進(jìn)展

王香元，佘瑞寧，方 銳，葛金文，梅志剛

·綜 述·

腦小血管病實驗動物模型及制備方法研究進(jìn)展

王香元，佘瑞寧，方 銳，葛金文*，梅志剛*

湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208

腦小血管?。╟erebral small vessel disease，CSVD）是由于顱內(nèi)微小血管的動態(tài)彌漫性病變所致的腦微血管疾病，是腦卒中和血管性癡呆的主要病因，具有高隱匿性、高發(fā)病率、高致殘率等特點，發(fā)病機(jī)制可能與腦血流量減少或慢性大腦低灌注、內(nèi)皮功能障礙、血-腦脊液屏障功能受損、炎癥反應(yīng)和遺傳等因素有關(guān)。為有效探尋CSVD的中西醫(yī)病理機(jī)制及防治方法，制備合適的且能展示中醫(yī)藥特色優(yōu)勢的動物模型尤為重要。當(dāng)前構(gòu)建的CSVD動物模型有低灌注損傷CSVD模型、高血壓靶器官損傷CSVD模型、基因修飾CSVD模型、微小栓子栓塞CSVD模型等。從CSVD模型的建立、行為學(xué)與病理改變、模型的優(yōu)缺點等角度綜述了近年來國內(nèi)外有關(guān)CSVD動物模型的研究進(jìn)展，旨在為深入探索CSVD的發(fā)病機(jī)制和靶向防治腦小血管病的創(chuàng)新藥物研發(fā)提供模式動物參考。

腦小血管?。粍游锬Ｐ停恢嗅t(yī)藥；低灌注損傷腦小血管病模型；高血壓靶器官損傷腦小血管病模型；基因修飾腦小血管病模型；微小栓子栓塞腦小血管病模型

腦小血管?。╟erebral small vessel disease，CSVD）是由各種病因影響腦內(nèi)小動脈、微動脈、毛細(xì)血管、小靜脈和微靜脈所導(dǎo)致的一系列臨床、影像、病理綜合征[1]。CSVD占所有缺血性卒中的25%，也是血管性癡呆的主要原因。與正常人相比，CSVD患卒中的風(fēng)險會增加1倍，發(fā)展成血管性癡呆的風(fēng)險會增加3倍[2]。該病臨床表現(xiàn)不一，急性CSVD可表現(xiàn)為腔隙綜合征，慢性CSVD隱匿起病，可無臨床癥狀，隨著病變進(jìn)展患者可出現(xiàn)認(rèn)知、運(yùn)動、情感和二便障礙等表現(xiàn)。CSVD臨床診斷主要依靠影像學(xué)檢查，尚缺乏規(guī)范診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，也無特異性治療藥物[1]。近年來中醫(yī)藥在CSVD的干預(yù)治療中提供了新的切入點并展現(xiàn)出良好的成效[3]，目前對CSVD的病因病機(jī)雖無統(tǒng)一認(rèn)識，但多數(shù)現(xiàn)代醫(yī)家認(rèn)為CSVD病位在腦和絡(luò)脈，與肝、脾、腎及督脈密切相關(guān)，病性屬虛實夾雜之證，以肝、脾、腎等臟腑虧損，精血虧虛為本，痰濁、瘀血為標(biāo)，病機(jī)為臟腑功能失調(diào)及夾痰、夾瘀血上擾腦竅[4]，采用補(bǔ)腎填精固本、健脾益氣化痰、活血化瘀通絡(luò)等法進(jìn)行辨證論治均收到良好效果[5]。為進(jìn)一步探索CSVD的中西醫(yī)病理機(jī)制和防治，復(fù)制具有CSVD病理特點和臨床表現(xiàn)的動物模型是關(guān)鍵。目前研究人員構(gòu)建CSVD模型的方法有阻塞頸動脈致腦低灌注損傷、模擬慢性高血壓腦損傷、基因修飾、微小栓子栓塞等，模型病理觀察可見小血管病變、腔隙性腦梗死和腦白質(zhì)病變3種主要病變[6]。本文綜述了4種CSVD病理模型的建立、動物行為學(xué)與組織病理改變、模型優(yōu)缺點等，以期為研究CSVD的中西醫(yī)發(fā)病機(jī)制和藥物防治提供建模參考。

1 低灌注損傷CSVD模型

1.1 雙側(cè)頸總動脈閉塞（bilateral carotid artery occlusion，BCAO）或狹窄模型

BCAO模型是采用外科縫線永久性結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動脈而建立的[7]。造模后即刻皮質(zhì)腦血流量下降超過70%[8]，2～3個月逐漸恢復(fù)至基線的50%～90%[7,9]。術(shù)后4～5周會出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)能力和記憶能力受損相關(guān)的認(rèn)知障礙[10]。術(shù)后3～7 d，病理觀察可見視神經(jīng)和視束、側(cè)腦室、胼胝體、內(nèi)囊和尾殼纖維束出現(xiàn)白質(zhì)病變，尤以視神經(jīng)和視束最為明顯[11]。雙側(cè)頸總動脈狹窄（bilateral common carotid artery stenosis，BCAS）模型是將內(nèi)徑0.18 mm、節(jié)距0.50 mm、總長度2.5 mm的微線圈纏繞在C57Bl/6小鼠一側(cè)頸總動脈分叉附近，間隔半小時后，將另一微線圈纏繞在對側(cè)頸總動脈對稱的位置而構(gòu)建[12]（圖1）。

圖1 BCAS模型[12]

術(shù)后2 h，腦血流量降至67%，術(shù)后1 d腦血流量開始恢復(fù)[12]。術(shù)后22 d小鼠表現(xiàn)出明顯的短期記憶缺陷[13]。術(shù)后1個月病理可見胼胝體、尾殼核、內(nèi)囊和視束發(fā)生白質(zhì)病變，且以胼胝體最為顯著，同時可見小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活增殖[12]。術(shù)后6個月小鼠磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）檢測可見嚴(yán)重的白質(zhì)病變、腦萎縮、多發(fā)性局灶性皮質(zhì)下梗死，同時病理可見血管破裂伴有膠原堆積、管壁增大、纖維蛋白沉積和血管纖維素樣壞死[14]。雙側(cè)頸總動脈不對稱狹窄模型（asymmetrical common carotid artery stenosis，ACAS）的構(gòu)建方法是將微線圈（內(nèi)徑0.18 mm）纏繞在C57BL/6J小鼠左側(cè)頸總動脈，同時將Ameroid 慢性縮窄環(huán)（內(nèi)徑0.5 mm、外徑3.25 mm、長度1.28 mm）植入右側(cè)頸總動脈對稱的位置（圖2）。術(shù)后28 d植入Ameroid側(cè)頸總動脈完全閉塞，腦血流量為73%。微線圈側(cè)腦血流量為75%。在神經(jīng)功能和行為方面，小鼠術(shù)后14 d出現(xiàn)運(yùn)動失調(diào)和神經(jīng)肌肉無力，28 d出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，病理改變可見右側(cè)皮質(zhì)下多處缺血性梗死灶，左側(cè)腦白質(zhì)稀疏和神經(jīng)膠質(zhì)增生[15]。

綜上，3種模型均可見白質(zhì)病理改變，可作為研究CSVD白質(zhì)損傷伴有認(rèn)知障礙的模型。雖然BCAO模型操作簡單成本低，但大鼠死亡率較高且缺血損傷視神經(jīng)會對認(rèn)知功能評估造成影響[15]，不適合推廣應(yīng)用。為降低BCAO模型的死亡率，有學(xué)者在BCAO模型的基礎(chǔ)上發(fā)明了改良兩血管閉塞模型（modified 2 vessel occlusion，Modified 2VO），本模型是用外科縫線先結(jié)扎大鼠一側(cè)頸總動脈，間隔1周后再結(jié)扎對側(cè)頸總動脈而建立的，大鼠在行為和形態(tài)學(xué)方面表現(xiàn)與BCAO相似[16-17]，但死亡率顯著下降。BCAS模型操作簡單、成本和死亡率低且?guī)缀醪粨p傷視神經(jīng)，推薦使用內(nèi)徑為0.18 mm微線圈造模，其模型重復(fù)性較高，比較適合研究的廣泛應(yīng)用。ACAS模型術(shù)后死亡率約為20%，可造成小鼠白質(zhì)梗死伴認(rèn)知功能障礙，由于雙側(cè)頸總動脈使用不同的造模裝置可造成2側(cè)大腦半球缺血程度的不同，因此可以作為評價某些藥物對缺血療效的實驗?zāi)Ｐ汀＞窒扌栽谟谀Ｐ椭谱鞒杀靖咔椅匆娢⒀懿∽僛15]。低灌注損傷CSVD模型與中醫(yī)瘀阻腦絡(luò)證型病理機(jī)制相似，瘀血阻于腦脈，氣血不通，腦髓失養(yǎng)，則出現(xiàn)神識不清、癡呆等癥狀，可用于瘀阻腦絡(luò)型CSVD的相關(guān)研究[5]。

圖2 ACAS模型[15]

1.2 立體定向藥物注射模型

立體定向藥物注射模型是通過立體定向?qū)?nèi)皮素-1和一氧化氮合酶抑制劑N(G)硝基--精氨酸甲酯（-NAME）聯(lián)合注入重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠內(nèi)囊后肢造成腦血管收縮降低腦血流量建立的。造模成功后，小鼠可出現(xiàn)顯著的神經(jīng)功能障礙，術(shù)后1 d MRI彌散加權(quán)成像顯示內(nèi)囊后肢高信號。術(shù)后8周病理可見局限性軸突和髓鞘丟失，周圍有反應(yīng)性膠質(zhì)增生，微血管收縮，微梗塞形成，此方法可復(fù)制CSVD皮質(zhì)下微梗死模型[18]。當(dāng)內(nèi)皮素-1或-N5-(1-亞氨基乙基)鳥氨酸（-NIO）注射到小鼠的腦室周圍白質(zhì)或皮質(zhì)下白質(zhì)時，小鼠未見神經(jīng)功能障礙，但可見局部白質(zhì)病變，此方法可復(fù)制CSVD白質(zhì)病變模型[19]。本模型建模的優(yōu)點在于定位準(zhǔn)確，局限性在于縮血管藥物滲漏到腦室會造成高死亡率，有文獻(xiàn)報道當(dāng)針頭與大腦矢狀面成30°針刺夾角時可明顯降低死亡率[20]。

2 高血壓相關(guān)性CSVD模型

2.1 自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneous hypertensive rat，SHR）模型

SHR是由患有高血壓的成年Wistar大鼠培育獲得。12周齡SHR的收縮壓＞200 mm Hg（1 mm Hg＝133 Pa）。30～34周齡SHR出現(xiàn)非空間工作記憶受損。35周齡SHR行MRI檢查可見大腦萎縮和白質(zhì)丟失，組織學(xué)分析證實了白質(zhì)脫髓鞘和局限性血腦屏障功能障礙，并伴有皮質(zhì)深層的小膠質(zhì)細(xì)胞和大膠質(zhì)細(xì)胞活化[21]，甚至出現(xiàn)大腦皮層梗死出血，血管周圍間隙明顯增大等[22-23]。幼年SHR出現(xiàn)明顯的腦部宏觀和微觀結(jié)構(gòu)的改變，表明SHR可能是一種早期CSVD的有效實驗動物模型[21]。高鹽飲食喂養(yǎng)SHR能加重血管病變，HE染色可見小動脈同心性透明增厚，管腔狹窄，血管周圍增大，與人類動脈硬化性CSVD的血管病理結(jié)果相似，可作為模擬動脈硬化性CSVD動物模型[24]。Kitamura等[25]將CSVD危險因素高血壓和腦低灌注損傷因素相結(jié)合構(gòu)建了自發(fā)性高血壓大鼠/雙側(cè)頸動脈逐漸閉塞（SHRs subjected to the bilateral common carotid artery gradual occlusion，SHR-2VGO）模型，其建模方法是將Ameroid慢性縮窄環(huán)（內(nèi)徑0.5 mm）分別植入SHR雙側(cè)頸總動脈對稱的位置。造模后7 d腦血流量緩慢下降到基線水平的68%，28 d腦血流量逐漸恢復(fù)基線水平的82%，大鼠空間工作記憶明顯損傷，白質(zhì)病變突出，病理觀察到膠質(zhì)纖維酸性蛋白免疫陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞和促炎因子明顯增加，但未見明顯的血腦屏障破壞，推測可能是由于小血管病理損傷較輕。SHR和SHR-2VGO模型都可作為研究CSVD白質(zhì)病變的模型，但后者更符合CSVD臨床病理演變的過程且能縮短模型實驗周期。

2.2 易卒中自發(fā)性高血壓性CSVD模型

易卒中自發(fā)性高血壓大鼠（stroke-prone spontaneously hypertensive rat，SHRSP）是在SHR基礎(chǔ)上培育出的亞系。雄性SHRSP卒中自發(fā)率高達(dá)80%，3月齡SHRSP收縮壓約為200 mm Hg。24周齡SHRSP非空間記憶能力顯著下降，而空間學(xué)習(xí)能力受損不明顯[21]，4～5個月開始出現(xiàn)腦白質(zhì)變化，9個月時出現(xiàn)梗死和出血[26]。病理可見內(nèi)皮損傷，血腦屏障功能障礙，小動脈壁增厚、變性和血管周圍組織改變，最終導(dǎo)致血管破裂和微出血。SHRSP高鹽暴露會加速高血壓和梗死的發(fā)展，高鹽攝入可能會增加血腦屏障通透性，增加活性氧的產(chǎn)生，并導(dǎo)致大鼠過早死亡[27-28]。因此將SHRSP作為CSVD動物模型時應(yīng)該避免動物鹽暴露[29]。此模型具有明顯的白質(zhì)疏松及小血管病變，是良好的高血壓性CSVD白質(zhì)病變模型[30]。

2.3 易卒中腎血管性高血壓性CSVD模型

易卒中腎血管性高血壓大鼠（stroke-prone renovascular hypertensive rat，RHRSP）模型是用銀夾（內(nèi)徑0.3 mm）夾閉SD大鼠雙側(cè)腎動脈根部誘發(fā)高血壓構(gòu)建的。RHRSP卒中自發(fā)率約為62%。術(shù)后12周RHRSP收縮壓維持在200 mm Hg左右。20周齡RHRSP出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)和記憶障礙。6周齡RHRSP病理可見明顯局灶性腦損傷（腦梗死、腦出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血）和神經(jīng)功能缺陷（偏癱癲癇等）。20周齡RHRSP通過MRI T2加權(quán)像檢測出了彌漫性、融合性白質(zhì)高信號，以穹窿部最為顯著。病理學(xué)方面可見白質(zhì)明顯疏松且有空泡形成，白質(zhì)髓鞘和神經(jīng)纖維消失，支持神經(jīng)影像學(xué)的發(fā)現(xiàn)。同時也觀察到腦內(nèi)小動脈纖維蛋白樣壞死、透明質(zhì)增生和血管重塑，血腦屏障破壞和血漿白蛋白漏入組織間隙的病理表現(xiàn)。此模型符合CSVD的白質(zhì)病變和小血管病理改變[31-32]。此外，有學(xué)者在構(gòu)建RHRSP的基礎(chǔ)上用5-0的絲線先結(jié)扎大鼠右側(cè)頸總動脈，間隔1周后再結(jié)扎左側(cè)頸總動脈，建立了易卒中腎血管性高血壓大鼠/改良雙側(cè)頸總動脈閉塞復(fù)合動物模型（stroke-prone renovascular hypertensive rat/modified 2 vessel occlusion，RHRSP/Modified 2VO）。術(shù)后12周大鼠收縮壓＞180 mm Hg，大鼠存在明顯的空間認(rèn)知障礙。病理改變可見彌漫性白質(zhì)病變，明顯的脫髓鞘、空泡形成和神經(jīng)纖維消失，尤以側(cè)腦室旁的胼胝體最為明顯，在胼胝體內(nèi)可見I型和IV型靜脈膠原沉積。白質(zhì)區(qū)的小血管可觀察到管壁向心性增厚、血管重塑和管腔狹窄[33]。RHRSP和RHRSP/Modified 2VO模型均可見到符合CSVD的白質(zhì)病變和小血管病理改變，可作為研究CSVD白質(zhì)病變伴認(rèn)知障礙模型，模型易于建立，成本低，缺陷在于大鼠體型差異難以控制腎動脈狹窄程度，可能會造成腎功能損害[10]。

2.4 血管緊張素II誘導(dǎo)高血壓性CSVD模型

血管緊張素II誘導(dǎo)高血壓性CSVD模型是在C57BL/6N小鼠皮下植入含有AngII微型泵［1000 ng/(kg·min)，輸注率為11 μL/h］并在飲水中加入-NAMEL（100 mg/kg），從而誘發(fā)高血壓建立。持續(xù)給藥4周后收縮壓可達(dá)150 mm Hg左右。模型小鼠在行為學(xué)方面表現(xiàn)出認(rèn)知功能和記憶明顯下降。MRI檢查可見腦室增大和海馬萎縮、散發(fā)性小梗死和微出血，但未見明顯的白質(zhì)損傷，彌散張量成像可見白質(zhì)密度顯著降低，推測可能與實驗誘導(dǎo)的高血壓周期太短有關(guān)（4周）。病理可見腦血管壁肥厚、神經(jīng)血管單位結(jié)構(gòu)損傷、小膠質(zhì)細(xì)胞激活、血腦屏障滲漏、內(nèi)皮細(xì)胞活化和免疫細(xì)胞聚集。該模型有類似于早發(fā)CSVD的關(guān)鍵特征，包括動脈病變、血腦屏障損傷、神經(jīng)炎癥、白質(zhì)改變的早期跡象，并具有典型的CSVD神經(jīng)心理學(xué)特征，可作為高血壓相關(guān)早發(fā)性CSVD的小鼠模型[34]。本模型的局限性在于藥量需求大，成本較高，不能模擬慢性高血壓長期損害的病理過程。

2.5 主動脈縮窄高血壓性CSVD模型

主動脈縮窄高血壓性CSVD模型是通過手術(shù)將恒河猴胸主動脈前2～4 cm的血管直徑縮小到2.0～2.5 mm從而誘發(fā)高血壓建立的（圖3）。術(shù)后1年發(fā)現(xiàn)收縮壓＞150 mm Hg的恒河猴在注意力、記憶力、執(zhí)行力等認(rèn)知和行為方面都有顯著的損害，而收縮壓＜150 mm Hg的恒河猴認(rèn)知損害不明顯，表明認(rèn)知功能損害與血壓升高相關(guān)[35]。神經(jīng)病理學(xué)上，最顯著的病變是形狀不規(guī)則的微梗死（直徑＜500 μm），伴有局灶性膠質(zhì)細(xì)胞增生，散在分布于大腦皮質(zhì)、腦干和小腦的灰質(zhì)和白質(zhì)，尤其是前腦白質(zhì)[36-38]。小動脈病變可見血管壁增厚。此方法可復(fù)制CSVD相關(guān)的白質(zhì)微血栓伴認(rèn)知功能障礙模型。本模型的優(yōu)點在于使用靈長類動物造模更能模擬人類病理狀態(tài)，局限性在于動物倫理要求更嚴(yán)，成本更高。

3 基因修飾相關(guān)CSVD模型

3.1 內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）基因缺陷小鼠模型

一氧化氮是腦血管功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，能激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的鳥苷環(huán)偶聯(lián)受體，參與腦血流的自動調(diào)節(jié)和神經(jīng)元突觸前適應(yīng)性調(diào)節(jié)。eNOS是血管中一氧化氮的主要來源。有學(xué)者通過基因工程技術(shù)敲除小鼠基因構(gòu)建了基因缺陷小鼠模型。幼年小鼠出現(xiàn)腦灌注不足、氧化應(yīng)激、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和血腦屏障滲漏，滲漏以額葉和頂葉皮質(zhì)為主，隨著年齡的增長，可擴(kuò)展到大腦深部區(qū)域（如顳頂葉皮質(zhì)和海馬），還可見到CSVD相關(guān)的臨床表現(xiàn)如腦淀粉樣血管病（cerebral amyloid angiopathy，CAA）、微出血、微梗死和白質(zhì)病變。中年小鼠可見嚴(yán)重的白質(zhì)病變、皮質(zhì)層II／III和V錐體神經(jīng)元神經(jīng)變性以及步態(tài)障礙。老年小鼠出現(xiàn)海馬依賴性記憶障礙。此模型直接將慢性低灌注和脫髓鞘與神經(jīng)變性聯(lián)系起來可作為年齡依賴性自發(fā)性CSVD模型，該模型的局限性在于微梗死的偶發(fā)性并且很難確定低灌注程度[39]。

圖3 胸主動脈縮窄示意圖[35]

3.2 CAA模型

CAA是β-淀粉樣蛋白（amyloid β protein，Aβ）在軟腦膜和皮質(zhì)層的中小動脈以及腦毛細(xì)血管內(nèi)沉積為主要病理特征的CSVD[40-41]。有學(xué)者將人APP770SwDI構(gòu)建物通過顯微鏡注射到SD大鼠的卵母細(xì)胞中構(gòu)建了rTg DI轉(zhuǎn)基因大鼠CAA模型，大鼠3個月時在大腦皮質(zhì)、海馬和丘腦可見早期和進(jìn)行性腦微血管Aβ蓄積，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活，并伴有早期和持續(xù)性的行為障礙。12個月時大腦微血管Aβ沉積會導(dǎo)致毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)改變，產(chǎn)生血管周圍神經(jīng)炎，還可見微出血和小血管閉塞（丘腦為主），另外還能觀察到血管周細(xì)胞變性，星形膠質(zhì)細(xì)胞中細(xì)胞凋亡蛋白酶-3激活，以及神經(jīng)元軸突完整性的破壞，這些結(jié)構(gòu)改變都很容易被MRI檢測到[42-43]。該模型大鼠在腦中產(chǎn)生低水平的人類家族性CAA荷蘭/愛荷華州E22Q/D23N突變的Aβ，可作為遺傳性CAA荷蘭型的實驗?zāi)Ｐ汀１灸Ｐ瓦x用大鼠作為建模動物相較于小鼠更有優(yōu)勢，因為大鼠與人類更接近。大鼠為研究小血管CAA和微出血的發(fā)病機(jī)制和測試干預(yù)治療措施提供了一種新的模型[42]。

3.3 絲氨酸蛋白酶1（high-temperature requirement A serine peptidase 1，HTRA1）基因重組小鼠模型

基因突變可導(dǎo)致單基因遺傳性CSVD即伴皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體隱性遺傳性腦動脈?。╟erebral autosomal recessive arteriopathy with subcortical infarcts and leuconcephalopathy，CARASIL）。基因突變導(dǎo)致HTRA1酶活性下降、功能喪失[44]，使腦小血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）中膜丟失變薄、內(nèi)彈力層斷裂、外膜的細(xì)胞外基質(zhì)變薄、基質(zhì)中纖維玻璃樣物質(zhì)沉積，隨后小動脈管腔狹窄或擴(kuò)張導(dǎo)致缺血或出血性病變。Li等[45]利用成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)系統(tǒng)（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9，CRISPR/）基因編輯技術(shù)建立了一種表達(dá)人基因L364P突變體的重組小鼠模型。觀察到人基因主要在小鼠VSMCs細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，誘導(dǎo)VSMCs凋亡，導(dǎo)致VSMCs大量丟失，還可見與CARASIL患者類似的卒中、脫毛、腦動脈向心性增厚和結(jié)構(gòu)紊亂等臨床表現(xiàn)和血管病理改變。該模型小鼠有助于闡明CARASIL的病理機(jī)制，為臨床治療提供新的治療靶點。

3.4 伴皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動脈病（cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy，CADASIL）基因突變小鼠模型

基因錯義突變可導(dǎo)致一種常見的遺傳性CSVD即CADASIL[46]。CADASIL病理特點是在中小型動脈中聚集顆粒狀嗜鋨物質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致VSMCs的進(jìn)行性退化。TgNotch3R90C、TgNotch3C428S、TgNotch3R169C、TgNotch3R1031C、TgNotch3C455R均可見NOTCH3ECD積聚和嗜鋨物質(zhì)沉積，其中R169C表型還可見白質(zhì)損傷及嚴(yán)重的認(rèn)知功能下降[47]。WT人Notch3、WT鼠Notch3、TgNotch3R142C均未見血管病理表現(xiàn)，也無白質(zhì)病變和缺血事件發(fā)生。TgNotch3R170C小鼠可出現(xiàn)嗜鋨物質(zhì)沉積、VSMCs結(jié)構(gòu)異常、細(xì)胞間隙擴(kuò)大、微出血、微梗死、纖維膠質(zhì)增生病理改變和共濟(jì)失調(diào)、癱瘓等神經(jīng)學(xué)特征[48]。由于TgNotch3R182C小鼠表現(xiàn)出隨著年齡和RNA表達(dá)水平的遞增，嗜鋨物質(zhì)不斷在血管沉積，然而并沒有腦實質(zhì)損害發(fā)生[49]，因此認(rèn)識到“Notch3評分”是CADASIL的定量生物標(biāo)記物，可以試圖將CADASIL轉(zhuǎn)基因小鼠用于臨床治療前測試模型[50]。

3.5 Ⅳ型膠原蛋白α1（α1 type IV collagen，COL4A1）基因突變小鼠模型

基因編碼COL4A1鏈，COL4A1是基底膜的主要結(jié)構(gòu)成分，基因突變大部分是由膠原結(jié)構(gòu)域內(nèi)Gly-X-Y重復(fù)序列內(nèi)高度保守的甘氨酸殘基改變所致[51]，臨床表現(xiàn)為成人小血管疾病、家族性孔腦畸形、遺傳性的血管病腎病動脈瘤和肌肉痛性痙攣綜合征[52]。Gould等[53]將突變雄性小鼠的精子與C57BL/6J雌性小鼠卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精，然后將胚胎移植到FVB/NJ雌性小鼠體內(nèi)分娩產(chǎn)生雜合子+/Δex40小鼠。小鼠容易發(fā)生自發(fā)性多灶性腦出血，以基底節(jié)區(qū)為主，導(dǎo)致腦出血的原因可能由于突變基因?qū)е卵苌僧惓：图?xì)胞內(nèi)膠原增加相關(guān)，除此之外還與環(huán)境因素（如出生創(chuàng)傷）有一定關(guān)系。成年小鼠中可出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺陷，包括癲癇發(fā)作和偏癱。此外還可見到本病的其他表型如視網(wǎng)膜血管扭曲、腎小球基底膜缺陷以及微量白蛋白尿。此模型可復(fù)制基因突變相關(guān)CSVD的腦出血模型。

4 微小栓子栓塞CSVD模型

4.1 微球注射微梗死模型

Silasi等[54]通過彈槍將2000顆小熒光微球（直徑約20 μm）注射到Thy1-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠單側(cè)頸總動脈，同時短暫阻斷翼腭動脈和頸外動脈，構(gòu)建了CSVD微梗死模型（圖4）。微球的直徑以接近嚙齒動物穿透小動脈的大小（10～20 μm）為宜。微球滯留在大腦中的分布以大腦皮質(zhì)和丘腦居多，微球滯留導(dǎo)致7%的微梗死，16%的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷，21%的微球引發(fā)了小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。術(shù)后4周小鼠出現(xiàn)了顯著的粗大運(yùn)動障礙和認(rèn)知功能損害。病理可見微閉塞的海馬區(qū)細(xì)胞丟失或神經(jīng)元萎縮，白質(zhì)束內(nèi)的軸突以及紋狀體和丘腦出現(xiàn)氣泡或破壞，還可見血管損傷。此模型優(yōu)勢在于可以研究微梗死的分布區(qū)域，局限性在于操作技術(shù)要求較高[54-55]。

圖4 微球注射微梗死模型[54]

4.2 高膽固醇血癥栓塞模型

由于高膽固醇血癥在微血管病理性腦缺血發(fā)展中的作用存在爭議，因此Kraft等[56]給予低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDLR）缺失轉(zhuǎn)基因小鼠動脈粥樣硬化飲食（15%乳脂和1.25%膽固醇）9周可誘導(dǎo)小鼠患高膽固醇血癥進(jìn)而導(dǎo)致血栓栓塞而構(gòu)建此模型。該研究未報告模型小鼠認(rèn)知及神經(jīng)功能表現(xiàn)。在6月齡LDLR?/?小鼠中發(fā)現(xiàn)毛細(xì)血管內(nèi)紅細(xì)胞凝集素明顯增高，12月齡LDLR?/?小鼠中紅細(xì)胞凝集素明顯減少，而纖維蛋白血栓顯著增加。此模型表明了高膽固醇血癥與血栓性CSVD表型有關(guān)，LDLR?/?小鼠似乎是研究微閉塞CSVD的合適動物模型。本模型的優(yōu)點在于造模方法簡便可行，缺陷在于同時也能造成大血管的動脈粥樣硬化，增加模型的復(fù)雜性。中醫(yī)認(rèn)為年老體虛、飲食不節(jié)會損傷脾胃導(dǎo)致脾失健運(yùn)，痰濁內(nèi)生，氣機(jī)升降失調(diào)，氣血運(yùn)行受阻日久而成瘀。而本模型是通過高脂飲食誘發(fā)高膽固醇血癥損傷血管內(nèi)皮導(dǎo)致動脈粥樣硬化而誘發(fā)的栓塞，與中醫(yī)“飲食不節(jié)，恣食肥甘”損傷脾胃導(dǎo)致的痰瘀互結(jié)證候有相類似的病機(jī)改變，可用于痰瘀互結(jié)型CSVD的生物學(xué)機(jī)制研究。

5 結(jié)語

CSVD是由于顱內(nèi)微小血管的動態(tài)彌漫性病變所致的腦微血管疾病，是腦卒中和血管性癡呆的主要病因，具有高隱匿性、高發(fā)病率、高致殘率等特點，發(fā)病機(jī)制可能與腦血流量減少或慢性大腦低灌注、內(nèi)皮功能障礙、血-腦脊液屏障功能受損、炎癥反應(yīng)和遺傳等因素有關(guān)。為有效探尋CSVD的中西醫(yī)病理機(jī)制及防治方法，制備合適的且能展示中醫(yī)藥特色優(yōu)勢的動物模型尤為重要。目前針對CSVD模型的動物種屬主要是嚙齒類動物，其中大鼠、小鼠、沙鼠應(yīng)用較多，非人靈長類動物應(yīng)用較少，卻具有嚙齒類動物無法比擬的優(yōu)勢，大腦與人類更相似，可以作為未來相關(guān)研究的主要動物選擇。雖然本文綜述了4種與CSVD相關(guān)的動物模型（低灌注損傷CSVD模型、高血壓靶器官損傷CSVD模型、基因修飾CSVD模型、微小栓子栓塞CSVD模型），其特征見表1，但迄今為止尚沒有任何一種動物模型能夠完全復(fù)制CSVD的病理特點，且大部分是通過單一因素造模，針對復(fù)合因素制備的模型不多，故仍需深入探索符合臨床特點并能模擬臨床病理演變過程的動物模型開發(fā)。基于多因素多靶點制備的復(fù)合型CSVD動物模型，將有助于推動CSVD發(fā)病機(jī)制研究，促進(jìn)防治本病的中醫(yī)藥創(chuàng)新藥物研發(fā)，凸顯中醫(yī)藥的臨床優(yōu)勢。

表1 CSVD動物模型特征

Table 1 Characteristics of animal models of CSVD

模型造模方法臨床病理認(rèn)知功能障礙神經(jīng)功能缺陷文獻(xiàn) 血管損傷白質(zhì)病變微梗死腦微出血/腦出血 低灌注損傷 1外科縫線永久性結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動脈?＋??＋?7-11 2微線圈纏繞在C57Bl/6小鼠一側(cè)頸總動脈分叉附近，間隔半小時后，將另一個同樣大小的微線圈纏繞在對側(cè)頸總動脈相同的位置＋＋＋?＋?12-14 3C57BL/6J小鼠左側(cè)頸總動脈纏繞微線圈（內(nèi)徑0.8 mm），右側(cè)頸總動脈相同的位置放置Ameroid慢性縮窄環(huán)（內(nèi)徑0.5 mm）/＋＋/＋＋15 4通過立體定向儀將縮血管藥物注射到大鼠相應(yīng)的大腦部位?＋＋??＋18-20 高血壓損傷 5雜交培育＋＋＋＋＋/21-24 6Ameroid慢性縮窄（內(nèi)徑0.5 mm）環(huán)植入SHR雙側(cè)頸總動脈＋＋//＋/25 7雜交培育＋＋＋＋＋/21,26-28 8銀夾（內(nèi)徑0.3 mm）夾閉SD大鼠雙側(cè)腎動脈根部＋＋＋＋＋＋31-32 9銀夾（內(nèi)徑0.3 mm）夾閉SD大鼠雙側(cè)腎動脈根部再用5-0的絲線先結(jié)扎右側(cè)頸總動脈，1周后以同樣的方式在同樣的位置結(jié)扎左側(cè)頸總動脈＋＋?/＋/33 10C57BL/6N小鼠皮下植入含有AngII的滲透微型泵并在飲水中加入NOS抑制劑L-NAMEL＋＋＋＋＋/34 11通過手術(shù)將恒河猴胸主動脈前2～4 cm處血管直徑縮小到2.0～2.5 mm＋?＋/＋/35-38 基因修飾 12敲除小鼠eNOS基因＋＋＋＋＋＋39 13將人APP770SwDI構(gòu)建物注射到SD大鼠卵母細(xì)胞中＋/＋＋＋/42-43 14利用Donor & CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建表達(dá)人HTRA1基因L364P突變體的重組小鼠＋/＋///45 15轉(zhuǎn)基因或基因敲入＋＋＋＋＋＋47-50 16COL4A1突變小鼠的精子與C57BL/6J雌性小鼠卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精，然后將胚胎移植到FVB/NJ雌性小鼠體內(nèi)，通過分娩產(chǎn)生＋?/＋/＋53 小栓子栓塞 17轉(zhuǎn)基因小鼠單側(cè)頸總動脈注射小熒光微球（直徑20 μm），同時短暫阻斷翼腭動脈和頸外動脈＋＋＋/＋＋54-55 18LDLR?/?小鼠配合動脈粥樣硬化飲食?/＋?//56

1-BCAO模型 2-BCAS模型 3-ACAS模型 4-立體定向藥物注射模型 5-SHR模型 6-SHR-2VGO模型 7-易卒中自發(fā)性高血壓性CSVD模型 8-易卒中腎血管性高血壓性CSVD模型 9-RHRSP/Modified 2VO模型 10-血管緊張素II誘導(dǎo)高血壓性CSVD模型 11-主動脈縮窄高血壓性CSVD模型 12-基因缺陷小鼠模型 13-CAA模型 14-基因重組小鼠模型 15-CADASIL基因突變小鼠模型 16-基因突變模型 17-微球注射微梗死模型 18-高膽固醇血癥栓塞模型；+-有相關(guān)病變 ?-無相關(guān)病變 /-未報告

-BCAO model 2-BCAS model 3-ACAS model 4-stereotactic drug injection model 5-SHR model 6-SHR-2VGO model 7-stroke prone spontaneous hypertensive CSVD model 8- CSVD model of renal vascular hypertension prone to stroke 9-RHRSP/Modified 2VO model 10- angiotensin II-induced hypertensive CSVD model 11-hypertensive CSVD model of aortic coarctation 12-genetically defective mouse model 13-CAA model 14-recombinant mouse model 15-CADASIL gene mutant mouse model 16-gene mutation model 17-microinfarct model by microsphere injection 18-hypercholesterolemia embolization model; +-there are associated lesions ?-there are no associated lesions /-not reported

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Research progress on experimental animal models and preparation methods of cerebral small vessel disease

WANG Xiang-yuan, SHE Rui-ning, FANG Rui, GE Jin-wen, MEI Zhi-gang

Key Laboratory of Hunan Province for Integrated Traditional Chinese and Western Medicine on Prevention and Treatment of Cardio-cerebral Diseases, College of Integrated Chinese and Western Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China

Cerebral small vessel disease (CSVD) is a cerebrovascular disease caused by dynamic diffuse lesions of intracranial microvascular. It is the main cause of stroke and vascular dementia, with high concealment, high incidence rate and high disability rate. Its pathogenesis may be related to reduced cerebral blood flow or chronic cerebral hypoperfusion, endothelial dysfunction, impaired blood-cerebrospinal fluid barrier function, inflammatory response and heredity. Therefore, in order to effectively explore the pathological mechanism and prevention methods of CSVD in traditional Chinese and Western medicine, it is particularly important to prepare suitable animal models that can demonstrate the characteristics and advantages of traditional Chinese medicine. The current CSVD animal models include low perfusion injury CSVD model, hypertension target organ injury CSVD model, gene modified CSVD model, and microembolization CSVD model. Research progress on animal models of CSVD at home and abroad in recent years from the perspectives of model establishment, behavior, pathological changes, and advantages and disadvantages of models were reviewed in this paper, in order to provide model animal reference for in-depth exploration of the pathogenesis of CSVD and for innovative drug research and development for the prevention and treatment of the disease.

cerebral small vessel disease; animal models; traditional Chinese medicine; low perfusion injury CSVD model; hypertension target organ injury CSVD model; gene modified CSVD model; microembolization CSVD model

R285.51

A

0253 - 2670(2022)18 - 5851 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.18.028

2022-06-02

國家重點研發(fā)計劃項目（2018YFC1704904）；湖南省科學(xué)技術(shù)廳省重點研發(fā)計劃項目（2022SK2016）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合一流學(xué)科重點項目（2021ZXYJH01）

王香元，碩士，研究方向為中西醫(yī)結(jié)合防治心腦血管疾病。E-mail: 1742380492@qq.com

葛金文，教授，博士。E-mail: 001267@hnucm.edu.cn

梅志剛，教授，博士。E-mail: meizhigang@hnucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 崔艷麗]