包載姜黃素的白及多糖載藥膠束的活性氧響應(yīng)性、抗炎作用及肝靶向性研究

王 濟(jì)，黨婷婷，趙慧雯，馮 斌

包載姜黃素的白及多糖載藥膠束的活性氧響應(yīng)性、抗炎作用及肝靶向性研究

王 濟(jì)，黨婷婷，趙慧雯*，馮 斌*

軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室，國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，陜西省口腔生物工程技術(shù)研究中心，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院 藥劑科，陜西 西安 710032

考察包載模型藥物姜黃素（curcumin，Cur）的白及多糖（polysaccharide，BSP）載藥膠束的活性氧（reactive oxygen species，ROS）響應(yīng)性、抗炎作用以及肝靶向性。采用透析袋法考察Cur載藥膠束在H2O2存在下的體外釋放特性；利用熒光顯微鏡觀察Cur載藥膠束在富含ROS的巨噬細(xì)胞內(nèi)的響應(yīng)性釋放效果；采用酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法考察Cur載藥膠束的抗炎作用；研究Cur載藥膠束在肝纖維化大鼠模型體內(nèi)的藥動學(xué)和組織分布情況。Cur載藥膠束在H2O2存在的情況下釋藥速度加快，在12 h內(nèi)累積釋放量達(dá)到53%，48 h累積釋放量達(dá)76%；Cur載藥膠束可被富含ROS的巨噬細(xì)胞特異性識別并響應(yīng)性釋放藥物；Cur與BSP有協(xié)同抗炎作用，可協(xié)同降低致炎因子的水平；藥動學(xué)和組織分布研究表明，Cur載藥膠束在大鼠體內(nèi)滯留時間延長，平均滯留時間（mean residence time，MRT0～∞）達(dá)（12.109±3.528）h，且在肝臟中分布最多。包載Cur的BSP載藥膠束具有ROS響應(yīng)性、抗炎作用以及肝臟靶向性。

白及多糖；姜黃素；活性氧響應(yīng)；抗炎作用；肝臟靶向

肝纖維化是各種慢性肝臟疾病的共同病理特征之一，主要表現(xiàn)為肝組織中細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致肝內(nèi)纖維結(jié)締組織過度沉積[1]。庫否細(xì)胞（Kupffer cell，KC）是肝臟的巨噬細(xì)胞，其參與纖維化的整個進(jìn)程，是纖維化的關(guān)鍵調(diào)控者[2-3]。在炎癥反應(yīng)前階段，KC受各種致病因素作用后可產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），在ROS觸發(fā)下繼而產(chǎn)生炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素- 1β（interleukin-1β，IL-1β）等，并誘導(dǎo)其他炎癥細(xì)胞的滲透，最終導(dǎo)致肝損傷[4-5]。

研究發(fā)現(xiàn)白及多糖（polysaccharide，BSP）能與巨噬細(xì)胞特異性結(jié)合[6-9]，且具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗腫瘤等生物學(xué)活性[10-14]，因此本課題組前期以BSP為骨架材料，利用ROS響應(yīng)基團(tuán)4-羥基苯硼酸頻那醇酯（4-hydroxymethyl phenyl-boronic acid pinacol ester，PBAP）對BSP進(jìn)行修飾，包封具有抗炎、抗氧化作用的姜黃素（curcumin，Cur），制備得到包載Cur的ROS敏感BSP膠束（Cur-Oxi-BSP）[15]。

本研究對Cur-Oxi-BSP能否特異性靶向至肝臟KC及其在ROS刺激下響應(yīng)性釋放藥物的抗炎作用進(jìn)行考察。首先，以H2O2模擬體內(nèi)高濃度ROS水平，考察ROS對Cur-Oxi-BSP膠束體外釋藥行為的影響，評價其在體外是否具有ROS響應(yīng)性。然后，采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ROS，用熒光染料香豆素-6（coumarin-6，C6）代替Cur制備熒光標(biāo)記載體（C6-Oxi-BSP），考察載體在富含ROS巨噬細(xì)胞內(nèi)的響應(yīng)性釋藥情況。將載體與RAW264.7巨噬細(xì)胞和LPS孵育后，分別采用ELISA試劑盒測定致炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表達(dá)水平，考察載體的抗炎活性。最后，構(gòu)建肝纖維化大鼠模型，研究Cur-Oxi-BSP膠束的藥動學(xué)和組織分布情況，驗證其是否具有肝臟靶向性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

R205B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；78HW-1型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器（杭州儀表電機(jī)有限公司）；BT125D型電子天平（德國賽多利斯公司）；X1R臺式低溫離心機(jī)（賽默飛世爾公司）；G560E型渦旋混合器（Scientific Industries）；370系列CO2培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技有限公司）；HHWS-II-200型恒溫箱（上海躍進(jìn)恒溫設(shè)備廠）；SW-CJ-1C超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.2 藥物與試劑

Cur-Oxi-BSP膠束[實驗室自制，平均粒徑為（225.33±2.97）nm，包封率為（85.75±0.87）%，載藥量為（20.21±0.44）%]；BSP（批號20171126，西安朗澤生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%）；Cur原料藥（批號C1523070，阿拉丁試劑上海有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）；大黃素內(nèi)標(biāo)物（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.7%，批號110756-201512，中國食品藥品檢定研究院）；泊洛沙姆Pluronic F127（批號SLBL1780V，Sigma-Aldrich公司）；二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO，批號C1807128，Aladdin試劑公司）；CCK-8試劑盒（cell counting Kit-8，批號C0042，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；TNF-α ELISA試劑盒（批號180909，武漢菲恩生物科技有限公司）；IL-1β ELISA試劑盒（批號180912，武漢菲恩生物科技有限公司）；IL-6 ELISA試劑盒（批號180920，武漢菲恩生物科技有限公司）；DCFH-DA熒光染料（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99.9%，Sigma公司）；C6（批號MKBV4602V，上海源葉生物科技公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98.0%）；DMEM高糖培養(yǎng)基（批號20180925，索萊寶公司）；胎牛血清（批號181018，杭州四季青生物公司）；純化水（實驗室自制）。

1.3 細(xì)胞與動物

RAW264.7巨噬細(xì)胞株（西安飛揚(yáng)生物科技有限公司）；SPF級雄性SD大鼠168只，體質(zhì)量（220±20）g，6～7周齡，第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK（軍）2016-0007。動物實驗經(jīng)第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院實驗動物管理倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號2018倫審字076號）。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同Cur制劑的制備

2.1.1 姜黃素溶液（curcumin solution，Cur-S）的制備 稱取Cur原料藥以DMSO溶解，質(zhì)量濃度為1 mg/mL。

2.1.2 非ROS響應(yīng)性載藥膠束（curcumin-loaded Pluronic micelles，Cur-P）的制備 載體Pluronic 50 mg和Cur原料藥15 mg溶解于10 mL甲醇溶液中，水浴加熱至60 ℃，減壓旋蒸30 min去除有機(jī)溶劑，向混合薄膜骨架中加入12 mL同溫度的去離子水（pH 6.6的PBS緩沖溶液），于相同溫度下水化一定時間，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得Cur質(zhì)量濃度為1 mg/mL的Cur-P。

2.1.3 Cur-Oxi-BSP的制備 參考課題組前期報道方法[15]。

2.2 Cur-Oxi-BSP膠束的細(xì)胞安全性評價

參照“2.1.3”方法制備Cur-Oxi-BSP膠束和空白載體，其中空白載體不加入Cur。用DMEM培養(yǎng)基稀釋分別得到含Cur濃度為5、10、20、30、50 μmol/L的Cur-Oxi-BSP膠束溶液及質(zhì)量濃度為5、20、50、100、200 μg/mL的空白載體溶液，備用。取處于對數(shù)生長期的RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于96孔板中，每孔約5×104個細(xì)胞，加入200 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃下在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，洗去培養(yǎng)液，加入200 μL上述空白載體溶液或Cur-Oxi-BSP載藥膠束溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，向每個孔中加入20 μL CCK-8儲備液，繼續(xù)孵育4 h。取出，用酶標(biāo)儀于450 nm測定各孔吸光度。以無細(xì)胞的空白培養(yǎng)基作為空白對照；以含10%胎牛血清的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞作為陰性對照。每個樣品3復(fù)孔，根據(jù)所測得吸光度計算細(xì)胞存活率。

實驗結(jié)果如圖1所示，空白載體的細(xì)胞安全性考察結(jié)果顯示，空白載體在5～50 μg/mL未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，在質(zhì)量濃度為100 μg/mL及以上時表現(xiàn)出了一定的細(xì)胞生長抑制現(xiàn)象，同時Cur-Oxi-BSP膠束在大于30 μmol/L時，抑制細(xì)胞生長，這可能是由于載體材料積聚在細(xì)胞內(nèi)濃度較高造成的。因此，本研究中后續(xù)實驗所涉及的載體質(zhì)量濃度均在20～25 μg/mL，Cur-Oxi-BSP膠束濃度在20 μmol/L，在此濃度范圍內(nèi)載體未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。

圖1 Cur-Oxi-BSP膠束(A)和空白載體(B) 的細(xì)胞毒性()

2.3 Cur-Oxi-BSP膠束的體外ROS響應(yīng)性考察

2.3.1 Cur-Oxi-BSP膠束在H2O2存在下的體外釋藥考察 分別精密吸取不同制劑溶液（Cur-S、Cur-P、Cur-Oxi-BSP）各3 mL，轉(zhuǎn)移至透析袋中，兩端夾緊，置于含或不含10 mmol/L H2O2的200 mL透析介質(zhì)（含5% SDS的等滲葡萄糖溶液）中，水浴恒溫振蕩，頻率為100 r/min，溫度（37.0±0.5）℃[16]。分別在不同時間點取出透析袋，透析袋內(nèi)溶液4000 r/min離心10 min，以透析袋內(nèi)的藥物沉淀加透析液為藥物釋放部分，透析袋內(nèi)的離心上清液為未釋放部分。采用HPLC法[17]進(jìn)行分析，所有的樣品平行測定3次。按以下公式計算各取樣點各樣品的累積釋放率。

累積釋放率＝釋放/總

釋放表示藥物釋放部分量；總表示藥物總量

結(jié)果（圖2）表明，Cur-Oxi-BSP在H2O2存在的條件下Cur釋放速率較快，且在12 h內(nèi)累積釋放量達(dá)到53%，48 h累積釋放量達(dá)76%。而在無H2O2條件下Cur 48 h累積釋放量僅為50%，表明BSP具有良好的氧化響應(yīng)性。H2O2對Cur-S的釋放幾乎沒有影響。Cur-P則在單純的釋放介質(zhì)和H2O2條件下，藥物釋放相對緩慢，且沒有顯著差異，證明Cur-P無ROS響應(yīng)性。

2.3.2 Cur-Oxi-BSP在富含ROS的巨噬細(xì)胞內(nèi)的攝取及響應(yīng)性釋藥考察 首先用熒光染料C6代替Cur，按照“2.1”項方法制備C6-S、C6-P及C6-Oxi-BSP。

取無菌處理的圓形蓋玻片置于24孔板內(nèi)，將RAW264.7巨噬細(xì)胞以1×105接種于24孔細(xì)胞板，在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含有100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）中標(biāo)準(zhǔn)條件培養(yǎng)24 h，棄去上層培養(yǎng)基，用PBS潤洗。將細(xì)胞分為C6-S、C6-P及C6-Oxi-BSP組，分別與400 ng/mL LPS孵育3 h，棄去舊培養(yǎng)液，加入經(jīng)無血清培養(yǎng)基稀釋的各熒光制劑（C6終質(zhì)量濃度為100 ng/mL）。同時以不含膠束的空白培養(yǎng)液作為陰性對照。37 ℃培養(yǎng)3 h后，吸除上層培養(yǎng)液，PBS洗細(xì)胞3次，加1 mL 4%多聚甲醛固定細(xì)胞（室溫20 min），PBS洗3次，加入細(xì)胞核染色劑DAPI（200 μL/孔），避光室溫孵育10 min。棄去DAPI，PBS洗2 min，重復(fù)5次；取出細(xì)胞爬片置于潔凈載玻片上，采用50%甘油封片，避光保存于4 ℃，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞對各組制劑的攝取情況。

圖2 Cur-S、Cur-P、Cur-Oxi-BSP在無H2O2條件(A)及10 mmol·L?1H2O2條件(B) 下的體外釋放曲線()

由圖3可知，巨噬細(xì)胞與不同的熒光標(biāo)記載體孵育后呈現(xiàn)出不同的熒光強(qiáng)度，且綠色熒光均分布于細(xì)胞漿內(nèi)；熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱反映出細(xì)胞對不同載體的攝取程度以及載體在胞內(nèi)的釋藥情況。C6-S組細(xì)胞內(nèi)C6的熒光最強(qiáng)，原因在于溶液中的C6為小分子，可自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，無需細(xì)胞攝取和胞內(nèi)釋放過程；C6-Oxi-BSP次之，C6-P熒光最弱，證實相比于無ROS響應(yīng)的載體，ROS響應(yīng)載體可更多地被巨噬細(xì)胞表面受體特異性識別攝取，且載體在胞內(nèi)高濃度ROS刺激下可實現(xiàn)響應(yīng)性釋藥。

A-陰性對照組 B-C6-S C-C6-P D-C6-Oxi-BSP

2.4 Cur-Oxi-BSP的抗炎活性研究

按“2.2”項方法培養(yǎng)細(xì)胞后，分為4組：Cur-S組（Cur濃度20 μmol/L）、空白載體組（B-Oxi-BSP，與Cur-Oxi-BSP組加入相同的溶液體積）、Cur-Oxi-BSP組（Cur濃度20 μmol/L）、Cur-P組（Cur濃度20 μmol/L）。分別將細(xì)胞與無血清DMEM（含400 ng/mL LPS）及不同制劑孵育，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每組設(shè)置6個復(fù)孔。同時設(shè)置陽性對照（只加入LPS，不加任何制劑）組和陰性對照（不加LPS和任何制劑）組。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，分別采用ELISA試劑盒測定致炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)水平，結(jié)果見圖4。

各組細(xì)胞中致炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）的表達(dá)水平趨勢大致相同，Cur-Oxi-BSP組最低，Cur-P組次之，Cur-S組和B-Oxi-BSP組也均明顯低于陽性對照組（＜0.05）?？梢娪坞x的Cur和空白載體均能抑制致炎因子的表達(dá)，而含Cur載體的作用最強(qiáng)，且Cur-Oxi-BSP組強(qiáng)于Cur-P組（＜0.05），證實Cur與載體BSP有協(xié)同抗炎作用。

A-陽性對照組 B-Cur-S組 C-B-Oxi-BSP組 D-Cur-Oxi-BSP組 E-Cur-P組 F-陰性對照組 與陽性對照組比較：*P＜0.05；與Cur-Oxi-BSP比較：#P＜0.05

2.5 Cur-Oxi-BSP在模型大鼠體內(nèi)的肝靶向性研究

2.5.1 肝纖維化大鼠模型的構(gòu)建 取SD大鼠168只，雄性，體質(zhì)量（220±20）g，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，留取3只作為正常組繼續(xù)飼養(yǎng)，其余ip CCl4-橄欖油（1∶1）的混合溶液，劑量為2 mL/kg。第1周每天連續(xù)注射誘導(dǎo)大鼠肝臟急性損傷，第2周開始2 d注射1次，誘導(dǎo)大鼠肝纖維化；第4周末造模結(jié)束后，隨機(jī)選取3只大鼠解剖，取心、肝、脾、肺、腎、腦等組織，備用，觀察肝臟組織形態(tài)，并進(jìn)行HE染色。

4周后正常組和模型組大鼠肝臟的病理切片HE染色結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出正常組大鼠肝索排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，無壞死、變性現(xiàn)象；模型組大鼠肝索排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝匯管區(qū)纖維結(jié)締組織增生[18]。模型大鼠肝臟切片表現(xiàn)出明顯的肝纖維化特征，由此可推斷肝纖維化大鼠模型構(gòu)建成功。

圖5 正常組(A) 和模型組(B) 大鼠肝臟的病理變化 (HEstaining, 200 μm)

2.5.2 藥動學(xué)研究 將肝纖維化模型大鼠隨機(jī)分為3組（＝54），給藥前12 h禁食不禁水，各組大鼠分別ip給予Cur-S、Cur-P和Cur-Oxi-BSP。各組給藥劑量按Cur質(zhì)量分?jǐn)?shù)10 mg/kg計算。

肝纖維化模型大鼠ip給藥后，分別在不同時間點（5、15、30 min及1、2、4、8、12、24 h）大鼠眼底靜脈叢取血，置于預(yù)先用EDTA飽和的離心管中，13 000 r/min離心10 min，分離上清液，于?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

精密吸取大鼠血漿200 μL至1.5 mL EP管中，并加入色譜甲醇200 μL，大黃素內(nèi)標(biāo)液10 μL，渦旋混合1 min，沉淀蛋白，13 000 r/min離心10 min，分離上清液，N2吹干后，再用200 μL甲醇復(fù)溶，渦旋3 min使充分溶解，離心取上清液，參照課題組前期報道的UHPLC-MS/MS法測定各血漿中Cur含量[18]。

以不同時間點血漿中的Cur濃度為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的時間為橫坐標(biāo)，繪制血藥濃度-時間曲線。采用藥動學(xué)軟件DAS 2.1.1，計算相關(guān)藥動學(xué)參數(shù)，見圖6。藥動學(xué)參數(shù)結(jié)果見表1。

由圖6和表1可見，與Cur-S組相比，Cur-P和Cur-Oxi-BSP組大鼠血漿Cur的峰濃度（max）均降低（＜0.05），且Cur-Oxi-BSP組降低更明顯（＜0.05）；Cur-P組和Cur-Oxi-BSP組大鼠體內(nèi)Cur的滯留時間（MRT0～∞）明顯延長（＜0.05），且Cur-Oxi-BSP組MRT0～∞比Cur-P組更長。原因可能為Cur-P組和Cur-Oxi-BSP組中的膠束載體進(jìn)入腹腔后，僅有少量會在腹腔液中釋放出游離Cur，大部分會優(yōu)先被肝、脾等富含巨噬細(xì)胞的臟器攝取[18]，在臟器中載體會緩慢釋放出游離的Cur。只有游離的Cur才能擴(kuò)散進(jìn)入血液循環(huán)，導(dǎo)致膠束組的血藥峰濃度比較低，達(dá)峰時間（max）較長，體內(nèi)MRT0～∞延長（＜0.05）。而Cur-S中的游離Cur則可快速進(jìn)入血液循環(huán)，快速達(dá)到血漿max，又被快速的清除。此外，與Cur-P相比，Cur-Oxi-BSP在腹腔液內(nèi)幾乎不會釋放出游離Cur，只有在ROS濃度較高的肝臟部位才會響應(yīng)性釋藥，因此Cur-Oxi-BSP組中進(jìn)入血液循環(huán)的Cur含量更少，藥-時曲線下面積（area under the concentration-time curve，AUC0～∞）更低（＜0.05）。

圖6 肝纖維化大鼠ip不同Cur制劑體內(nèi)血藥濃度-時間曲線()

表1 各組大鼠的主要藥動學(xué)參數(shù)()

Table 1 Main pharmacokinetic parameters of rats in each group ()

藥動學(xué)參數(shù)單位Cur-Oxi-BSPCur-PCur-S t1/2h7.688±2.896#7.693±1.466#2.759±0.422 tmaxh3.167±1.329*#2.000±0.001#1.000±0.001 CLz/FL·h?1·kg?12.277±0.529*#1.443±0.139#7.692±0.995 MRT0～∞h12.109±3.528#11.681±1.79#3.619±0.214 Cmaxμg·L?1347.478±28.484*#555.193±56.244#823.011±76.592 AUC0～tμg·h·L?13 922.411±582.394*#6 119.546±375.98#1 323.601±207.139 AUC0～∞μg·h·L?14 589.109±1 054.300*#6 982.105±644.498#1 325.712±206.365

與Cur-P組比較：*＜0.05；與Cur-S組比較：#＜0.05

*< 0.05Cur-P group;#< 0.05Cur-S group

2.5.3 Cur-Oxi-BSP在模型大鼠體內(nèi)的藥物組織分布 按“2.5.2”項方法分組及樣品處理，各組大鼠眼底靜脈叢取血后，脫臼處死并解剖大鼠，分離心、肝、脾、肺、腎、腦等組織，生理鹽水沖洗組織表面，濾紙吸干，組織稱質(zhì)量，按組織質(zhì)量的2倍加入生理鹽水，勻漿儀勻漿，備用。參照課題組前期報道的UHPLC-MS/MS法測定各組織中Cur含量[18]。根據(jù)各時間點血漿、心、肝、脾、肺、腎、腦樣品中Cur的濃度繪制柱狀圖，比較各時間點樣品中的Cur濃度來考察其分布特征。

組織分布（圖7）結(jié)果顯示，Cur-Oxi-BSP組在前2 h內(nèi)肝臟中的Cur濃度均比較高，證明載體可優(yōu)先進(jìn)入肝臟組織。Cur-Oxi-BSP組肝臟Cur濃度于4 h開始下降，明顯低于Cur-P組（＜0.05），可能是由于Cur-Oxi-BSP在肝臟高濃度ROS刺激下已完成響應(yīng)性釋藥，Cur已經(jīng)在肝臟部位發(fā)揮作用后被代謝，從膽汁中快速清除[19]。而Cur-P無ROS響應(yīng)性，進(jìn)入肝臟后仍維持緩慢釋藥，肝臟中的Cur可在較長時間內(nèi)維持較高濃度。Cur-S組中的游離Cur則會快速進(jìn)入血漿中，快速達(dá)峰，很快又被清除；其在各個組織均有分布，在不同部位的分布差異是由其血流灌注量導(dǎo)致的[18]。

2.6 統(tǒng)計分析

通過ANOVA單因素方差分析對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以表示，＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

與Cur-S組比較：*P＜0.05；與Cur-P組比較：#P＜0.05

3 討論

BSP是從白及藥材中提取的由葡萄糖和甘露糖（1∶2.4）以β-糖苷鍵聚合而成的多糖化合物[6-8]。BSP是中藥白及的有效成分，具有抗炎、抗氧化、抗纖維化等生物學(xué)活性，無毒、無刺激性，還可特異性靶向至巨噬細(xì)胞表面的β-葡聚糖受體和甘露糖受體[9-11]。但BSP作為藥物遞送載體具有自身缺陷，其親水性較強(qiáng)、缺少疏水域，使其應(yīng)用受到限制。

目前已有許多研究者對其進(jìn)行疏水改性。成念等[20]制備了膽甾醇琥珀?；鵅SP兩親性嵌段共聚物，該材料可自發(fā)形成膠束，包載紫杉醇后，與游離藥物相比，其對腫瘤細(xì)胞的殺傷力增強(qiáng)。Guan等[21]制備了包載多西他賽的硬脂酸-BSP兩親性聚合物膠束，該膠束對HepG2等4種癌細(xì)胞呈現(xiàn)良好的抗癌活性。此外，還有用乙二胺[22]、伯胺基[23]等修飾的陽離子化BSP作為基因和RNA藥物載體。本課題組前期采用疏水材料PBAP對BSP進(jìn)行修飾，二者以ROS敏感的苯硼酸酯鍵聯(lián)接，包載抗肝纖維化藥物Cur，制備得到KC靶向且具有ROS敏感響應(yīng)的藥物載體Cur-Oxi-BSP，用于肝纖維化治療。該載體能夠在細(xì)胞外維持膠束結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，一旦其被KC表面的特異性受體識別進(jìn)入細(xì)胞后，載體中的苯硼酸酯鍵即可在細(xì)胞內(nèi)高濃度ROS刺激下斷裂，膠束結(jié)構(gòu)被破壞，釋放出游離藥物[15,24]，同時BSP還可與藥物發(fā)揮協(xié)同抗炎作用。該載體集特異性靶向、ROS響應(yīng)性釋藥和協(xié)同抗炎等優(yōu)點于一體，將有利于肝纖維化的治療。

前期已對載體的制備工藝及其理化性質(zhì)表征進(jìn)行報道，本研究繼續(xù)對載體的生物學(xué)活性進(jìn)行驗證。為證實Cur-Oxi-BSP膠束具有ROS響應(yīng)性，首先采用H2O2（ROS最主要的一種形式）模擬體內(nèi)ROS環(huán)境，考察Cur-Oxi-BSP膠束在H2O2條件下的體外釋放情況。前期研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)H2O2濃度為10 mmol/L時，膠束已呈現(xiàn)中空狀，分布散亂，邊界模糊。此外膠束的粒徑、分散指數(shù)和Zeta電位開始發(fā)生較大變化，且與H2O2濃度呈正比，提示當(dāng)H2O2濃度大于10 mmol/L時，BSP可產(chǎn)生ROS響應(yīng)，因此確定10 mmol/L H2O2為體外釋藥實驗所使用的濃度[15]。結(jié)果顯示Cur-Oxi-BSP膠束在H2O2存在下釋藥速度加快，具有ROS響應(yīng)性。

采用細(xì)胞實驗驗證Cur-Oxi-BSP膠束在富含ROS的巨噬細(xì)胞內(nèi)也具有ROS響應(yīng)性。查閱文獻(xiàn)得知RAW264.7巨噬細(xì)胞細(xì)胞表面有與KC相同的受體，可與白及多糖結(jié)合[17,25-26]，因此本實驗以可傳代的RAW264.7細(xì)胞替代成本較高不可傳代的KC進(jìn)行實驗。細(xì)胞毒性實驗證實各載體具有較好的安全性。采用LPS刺激巨噬細(xì)胞來構(gòu)建富含ROS的巨噬細(xì)胞模型，并使用DCFH-DA熒光染料試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)水平[27]，最終結(jié)合細(xì)胞內(nèi)ROS水平和細(xì)胞存活率2個指標(biāo)篩選最佳LPS濃度。結(jié)果顯示各組巨噬細(xì)胞在LPS刺激下均可呈現(xiàn)不同的熒光強(qiáng)度，且隨著LPS濃度的增加，細(xì)胞熒光強(qiáng)度有所增加，表明細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS增加[28]。但質(zhì)量濃度大于400 ng/mL時，LPS抑制細(xì)胞生長，細(xì)胞存活率下降較為明顯。綜合考慮，選擇LPS質(zhì)量濃度為400 ng/mL進(jìn)行后續(xù)實驗。接著將熒光標(biāo)記載體、LPS與巨噬細(xì)胞孵育，熒光顯微鏡觀察后發(fā)現(xiàn)相比于非ROS響應(yīng)載體，BSP載體可被巨噬細(xì)胞特異性識別，并在細(xì)胞內(nèi)高濃度ROS刺激下響應(yīng)性釋藥。此外，ELISA結(jié)果顯示載體BSP和Cur具有協(xié)同抗炎作用，可協(xié)同降低致炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白表達(dá)水平。

最后進(jìn)一步考察Cur-Oxi-BSP在肝臟組織的靶向性。構(gòu)建肝纖維化大鼠模型，研究載體在模型大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)和組織分布特征。結(jié)果表明，Cur-Oxi-BSP中的Cur在大鼠體內(nèi)MRT0～∞延長，在肝臟中的Cur濃度最高，提示其可更多地靶向至肝臟，在肝纖維化病灶部位發(fā)揮作用。

綜上所述，該載體具有ROS響應(yīng)性、抗炎活性及肝臟靶向性等特點，將BSP與Cur相結(jié)合，可充分發(fā)揮藥物和載體的雙重作用，為探索抗肝纖維化治療提供了新思路。但本研究僅考察了Cur-Oxi-BSP的體外ROS響應(yīng)性，還需要對其體內(nèi)ROS響應(yīng)性進(jìn)行深入研究；另外其在動物體內(nèi)的抗肝纖維化藥效也有待進(jìn)一步考察。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Reactive oxygen species-responsiveness and anti-inflammatory activity of curcumin-loadedpolysaccharide micelles and its liver-targeting

WANG Ji, DANG Ting-ting, ZHAO Hui-wen, FENG Bin

State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi Engineering Research Center for Dental Materials and Advanced Manufacture, Department of Pharmacy, Hospital of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China

To investigate the reactive oxygen species (ROS)-responsiveness, anti-inflammatory activity and liver-targeting properties ofpolysaccharide (BSP) micelles loaded with curcumin (Cur).Therelease characteristics of drug-loaded micelles in the presence of H2O2was investigated by dialysis bag method; The responsive release effect of Cur-loaded micelles in ROS-rich RAW264.7 macrophages was observed by fluorescence microscopy; Theanti-inflammatory activities of Cur-loaded micelles were investigated by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA); The pharmacokinetics and tissue distribution of Cur-loaded micelles in rats with liver fibrosis were also evaluated.In the presence of H2O2, the release rate of Cur-loaded micelles was accelerated, and the cumulative release amount reached 53% within 12 h and 76% within 48 h. The Cur-loaded micelles could be specifically recognized by ROS-rich macrophages and release drugs in response. Cur and BSP had synergistic anti-inflammatory effects and could synergistically reduce the levels of inflammatory factors. Pharmacokinetic and tissue distribution studies showed that the retention time of Cur-loaded micelles in rats was prolonged, and the mean residence time (MRT0-∞) was (12.109 ± 3.528) h, and the distribution of Cur-loaded micelles was the most in liver.The BSP micelles loaded with Cur have ROS- responsiveness, anti-inflammatory activity and liver-targeting.

polysaccharide; curcumin; reactive oxygen species-responsiveness; anti-inflammatory activity; liver-targeting

R283；R285

A

0253 - 2670(2022)18 - 5759 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.18.019

2022-05-13

陜西省中醫(yī)藥管理局科研項目（2021-ZZ-ZY001）

王 濟(jì)（1988—），女，主管藥師，研究方向為藥物新制劑和新劑型。Tel: (029)84773998 E-mail: wjsydkq145@163.com

馮 斌（1986—），主管藥師，研究方向為口腔制劑研究和神經(jīng)藥理學(xué)研究。Tel: (029)84773998 E-mail: binfeng@fmmu.edu.cn

趙慧雯（1990—），主管藥師，研究方向為藥物分析和藥物質(zhì)量控制。Tel:(029)84773998 E-mail: zhaohw928@163.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]