6種代表性沉香精油的化學(xué)成分及抗氧化、抗炎活性比較分析

陳細(xì)欽，王燦紅，馮 劍，陳德力，魏建和，劉洋洋*

6種代表性沉香精油的化學(xué)成分及抗氧化、抗炎活性比較分析

陳細(xì)欽1, 2，王燦紅2，馮 劍2，陳德力2，魏建和1, 2，劉洋洋2*

1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，瀕危藥材繁育國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100193 2. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所海南分所，海南省南藥資源保護(hù)與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局沉香可持續(xù)利用重點(diǎn)研究室，海南 海口 570311

比較不同來(lái)源、不同提取方式的6種沉香精油化合物組成、抗氧化能力及抗炎活性的差異。采用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-time of flight mass spectrometry，GC-TOF MS）對(duì)6種沉香精油的化學(xué)成分進(jìn)行分析，并測(cè)定其清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）與2,2-氮雜雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽[2,2-azabis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS]自由基的能力，考察其對(duì)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7活力的影響。從通體香水蒸氣蒸餾精油（TTS）、通體香超臨界萃取精油（TTC）、板頭香水蒸氣蒸餾精油（BTS）、板頭香超臨界萃取精油（BTC）、奇楠沉香水蒸氣蒸餾精油（QNS）和奇楠沉香超臨界萃取精油（QNC）中鑒定出的化合物數(shù)量分別為48、55、59、71、72和35種，所含香味物質(zhì)小分子芳香物質(zhì)及倍半萜類成分相對(duì)含量之和分別為81.42%、87.84%、89.03%、62.05%、63.83%和28.36%，所含2-(2-苯乙基)色酮類化合物相對(duì)含量分別為0、0、0.25%、22.42%、17.48%、60.42%。6種沉香精油均具有清除DPPH和ABTS自由基能力，且質(zhì)量濃度在0.5～5 mg/mL與自由基清除能力均呈正相關(guān)。3種水蒸氣蒸餾沉香精油（BTS、TTS、QNS）對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）分別為18.61、30.30、18.05 μg/mL，而3種超臨界CO2萃取沉香精油（BTC、TTC、QNC）的IC50值分別為41.98、38.45、24.50 μg/mL。超臨界萃取沉香精油同水蒸氣蒸餾沉香精油化合物組成相差較大，其能夠提取出更多的脂肪酸類和色酮類化合物；板頭香和通體香采用同一提取方法所得精油化學(xué)成分相似，而奇楠沉香中含有更多含量的香味物質(zhì)和2-(2-苯乙基)色酮類化合物。3種超臨界萃取沉香精油清除DPPH自由基能力均強(qiáng)于水蒸氣蒸餾沉香精油，而抗炎活性則相反，且3種沉香來(lái)源中，奇楠沉香精油抗炎能力最佳。

沉香；奇楠；精油；化學(xué)成分；抗氧化能力；抗炎活性；2-(2-苯乙基)色酮

沉香為瑞香科沉香屬Lam.和擬沉香屬Gaertn.植物含有樹脂的木材。正常生長(zhǎng)的沉香樹無(wú)法生成沉香，只有在沉香樹受到物理、生物或化學(xué)等外部傷害后，沉香樹啟動(dòng)防御反應(yīng)，在其內(nèi)部生成黑褐色的樹脂，含有這些樹脂的木材便稱為沉香[1-2]。因沉香珍貴難得，目前全球野生沉香資源瀕危，沉香屬報(bào)道的21個(gè)種均列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》（CITES）附錄II中[3]。如今大面積的沉香種植、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)結(jié)香方法的發(fā)明，使得市場(chǎng)上的沉香供應(yīng)得以持續(xù)[2]。目前市場(chǎng)上較為常見的沉香有采用全斷桿法所結(jié)沉香（簡(jiǎn)稱板頭香）、采用通體結(jié)香技術(shù)所結(jié)沉香（簡(jiǎn)稱通體香）以及采用打孔法所結(jié)沉香（簡(jiǎn)稱奇楠沉香）等[4-6]?！吨袊?guó)藥典》2020年版記載沉香具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘的功效[7]，可用于治療胃腸道疾病、咳嗽、風(fēng)濕病及各種疼痛[8-10]。其沉香制品，如沉香精油、沉香香粉、沉香線香等物，常用于熏蒸燃燒，起到舒緩身心、安神解郁的作用[11-12]。

沉香精油主要成分有倍半萜類、2-(2-苯乙基)色酮類、小分子芳香物質(zhì)及脂肪酸類化合物等，作為芳香療法常用的精油之一，其具有抗氧化、抑菌、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗癌等藥理活性[6,13]。沉香精油有多種提取方式，如水蒸氣蒸餾提取法、超臨界萃取法、亞臨界提取、微波輔助提取法、酶輔助提取法、溶劑提取法等[14-16]，其中水蒸氣蒸餾提取法和超臨界CO2萃取法較為常見。水蒸氣蒸餾提取法是一種傳統(tǒng)的提取方法，提取方法簡(jiǎn)單、設(shè)備價(jià)格低廉，但提取率低，通常僅有0.1%～0.5%，且長(zhǎng)時(shí)間高溫所致的芳香類物質(zhì)的損失和2-(2-苯乙基)色酮類化合物的分解，易造成沉香中有效成分的破壞[16]。超臨界CO2萃取法條件溫和，芳香類物質(zhì)損失和2-(2-苯乙基)色酮類化合物破壞較少，且提取率高，通常可達(dá)0.8%～5%[17]。采用不同來(lái)源的沉香以及不同提取方法所得沉香精油的顏色、香味特點(diǎn)以及使用效果存在較大差異[18]。目前，對(duì)沉香精油化學(xué)成分的研究大多為對(duì)采取某一種提取方法從普通沉香中提取的沉香精油進(jìn)行化學(xué)成分分析，且沉香精油活性研究主要集中于抗氧化、抗炎活性方面，而對(duì)幾種代表性的沉香采用不同提取方法所得沉香精油化學(xué)成分及活性比較研究報(bào)道少見。因此，本研究選擇了板頭香、通體香和奇楠沉香3種代表性沉香，并采用水蒸氣蒸餾和超臨界CO2萃取2種常用的精油提取方式提取得到6種沉香精油，對(duì)其化學(xué)組成、抗氧化能力及抗炎活性進(jìn)行系統(tǒng)對(duì)比分析，以期為沉香精油的質(zhì)量評(píng)價(jià)和深度開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7購(gòu)自上海賽百康生物技術(shù)有限公司。

1.2 藥品與試劑

6種沉香精油信息見表1和圖1，其中水蒸氣蒸餾精油為實(shí)驗(yàn)室自制，超臨界CO2萃取精油由瑜豐沉香匯（廣東）科技有限公司提取，且2種提取方法所用通體香為同一批（批號(hào)CXT20161009-1），所用市售板頭香為同一批（批號(hào)BT20210421），所用市售奇楠沉香為同一批（批號(hào)QN20210421）。以上沉香均購(gòu)自廣東茂名，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所海南分所劉洋洋研究員鑒定，3種沉香基原均為瑞香科植物白木香(Lour.) Gilg。

表1 6種沉香精油

Table 1 Six agarwood essential oils

編號(hào)提取方式來(lái)源 TTS水蒸氣蒸餾提取通體香 TTC超臨界CO2萃取 BTS水蒸氣蒸餾提取板頭香 BTC超臨界CO2萃取 QNS水蒸氣蒸餾提取奇楠沉香 QNC超臨界CO2萃取

圖1 6種沉香精油圖片

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，批號(hào)CL31203820）、吲哚美辛（批號(hào)Y18M10C83262）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)70080110）購(gòu)自Biosharp公司；胰酶消化液（批號(hào)21144688）、青霉素-鏈霉素（批號(hào)69070500）、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（butylated hydroxytoluene，BHT，批號(hào)20160415）購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；胎牛血清（批號(hào)070219191026）購(gòu)自美國(guó)CLARK公司；CCK-8（批號(hào)031521210520）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH，批號(hào)20210120）購(gòu)自福州飛凈生物科技有限公司；2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽[2,2-azabis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS，批號(hào)C12467440]、過(guò)硫酸鉀（批號(hào)C10279335）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；正構(gòu)烷烴（C8～C40）對(duì)照品（批號(hào)220101504）購(gòu)自美國(guó)AccuStandard公司；二甲基亞砜、無(wú)水乙醇及其他試劑均為分析純。

1.3 儀器

7890B/7200型氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-time of flight mass spectrometry，GC-TOF MS，美國(guó)安捷倫科技有限公司）；CKX53型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；UV-1900型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；Galaxy 170S型CO2恒溫培養(yǎng)箱（德國(guó)Eppendorf公司）；Multiskan GO型微孔板分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；HWS-26型電熱恒溫水浴箱（上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；TGL-16M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；XS105DU型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

2 方法

2.1 沉香精油成分分析

采用GC-TOF MS對(duì)6種沉香精油進(jìn)行分析。

2.1.1 氣相條件 HP-5 MS彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為高純氦氣，體積流量1 mL/min，分流比2∶1，進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣口溫度255 ℃。程序升溫：柱溫80 ℃，保持5 min；以10 ℃/min升至130 ℃，保持5 min；以1 ℃/min升至140 ℃，保持10 min；以0.5 ℃/min升至160 ℃，再以10 ℃/min升至230 ℃，再以5 ℃/min升至300 ℃，保持3 min。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊（EI）能量70 eV；離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，溶劑延遲5 min，掃描范圍/50～550。正構(gòu)烷烴（C8～C40）對(duì)照品1 μL單獨(dú)進(jìn)樣。

2.2 沉香精油抗氧化活性測(cè)定

2.2.1 沉香精油清除DPPH自由基能力的測(cè)定 取DPPH乙醇溶液（100 μmol/L），沉香精油（5 mg/mL）用量為500、400、300、200、100、50 μL，用無(wú)水乙醇補(bǔ)足至1 mL，室溫避光放置30 min，采用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定517 nm處的吸光度（）值，記為1；以無(wú)水乙醇代替DPPH，同法測(cè)定，記為2；以樣品溶劑代替樣品，同法測(cè)定，記為0。每個(gè)樣品測(cè)定3次。以BHT（0.5 mg/mL）為陽(yáng)性對(duì)照，同法測(cè)定，計(jì)算清除率。

DPPH自由基清除率＝0－(1－2)/0

2.2.2 沉香精油清除ABTS自由基能力的測(cè)定 取7 mmol/L的ABTS與2.45 mmol/L的過(guò)硫酸鉀溶液等體積混合均勻，避光放置12 h，臨用前用乙醇溶液稀釋ABTS預(yù)備液至734 nm處的值為0.70±0.02，得ABTS工作液。分別取500、400、300、200、100、50 μL沉香精油溶液（2 mg/mL）與1.5 mL ABTS工作液混勻，無(wú)水乙醇補(bǔ)足至2 mL，反應(yīng)20 min后于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定值，記為1；以溶劑代替樣品，同法測(cè)定，記為0；以乙醇代替ABTS，同法測(cè)得各樣品對(duì)照組的，記為2。每個(gè)樣品測(cè)定3次。以BHT（0.5 mg/mL）為陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算清除率。

ABTS自由基清除率＝0－(1－2)/0

2.3 沉香精油對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響

RAW264.7細(xì)胞以5×103/孔接種于96孔板中，100 μL/孔，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞是否鋪板均勻，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。設(shè)置對(duì)照組、模型組及不同沉香精油樣品（100、50、25、12.5 μg/mL）組和吲哚美辛（10、5、2.5、1.25 μg/mL）組，除對(duì)照組外，其余各組加入LPS（1 μg/mL），各給藥組再加入相應(yīng)藥物，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8，孵育1 h后，采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的值，計(jì)算細(xì)胞存活率。采用回歸分析計(jì)算半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）。

細(xì)胞存活率＝(給藥－對(duì)照)/(模型－對(duì)照)

2.4 數(shù)據(jù)分析

經(jīng)GC-TOF MS分析后，通過(guò)Qualitative Analysis B.07.00軟件結(jié)合NIST17質(zhì)譜庫(kù)對(duì)沉香精油各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索與定性，并按峰面積歸一化法計(jì)算出各組分的相對(duì)含量。采用SIMCA 14.1軟件對(duì)6種沉香精油進(jìn)行層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）。

抗氧化活性及抗炎活性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 8.3軟件作圖。所有結(jié)果以表示，組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 不同沉香精油成分分析

采用GC-TOF MS從6種沉香精油樣品中共鑒定出110種化合物（表2）。不同來(lái)源的沉香以及不同提取方式所得沉香精油中的化學(xué)成分?jǐn)?shù)量、種類及相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均存在差異。

表2 6種沉香精油化學(xué)成分

Table 2 Chemical compositions of six agarwood essential oils

序號(hào)化合物化學(xué)式保留指數(shù)相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)/% BTSTTSQNSBTCTTCQNC 1芐基丙酮C10H12O12463.963.750.512.011.880.72 2(5Z)-13,13-dimethyl-11,12-diazatricyclo[8.2.1.0]trideca-5,11-dieneC13H20N213980.160.100.18——— 34-(5,5-dimethylspiro[2.5]oct-4-yl)-2-butanoneC14H24O1416—0.16———— 41-(4,7,7-trimethylbicyclo[4.1.0]hept-3-en-3-yl)ethanoneC12H18O1442——0.27——— 5β-廣藿香烯C15H241448———0.14—— 6(1R,3aR,5aR,9aS)-1,4,4,7-tetramethyl-1,2,3,3a,4,5a,8,9-octahydrocyclopenta [c]benzofuranC15H24O14510.48—0.26——— 7葎草烯C15H241456———0.13—— 8(4R,4aS,6S)-4,4a-dimethyl-6-(prop-1-en-2-yl)-1,2,3,4,4a,5,6,7-octahydronaphthaleneC15H2414720.280.180.340.410.13— 92-(4a,8-dimethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7-octahydro-naphthalen-2-yl)-prop-2-en-1-olC15H24O14764.913.461.820.170.17— 10古蕓烯C15H241490—0.20———— 11長(zhǎng)葉烯C15H241500—0.230.140.16—— 12(3R,5aR,9S,9aS)-2,2,5a,9-tetramethyloctahydro-2H-3,9a-methanobenzo[b]oxepineC15H26O15040.430.400.22——— 13delta-guaieneC15H241508—0.210.110.24—— 142,4-di-tert-butylphenolC14H22O1512—0.200.17——— 15(1aR,3aR,4R,7R,8aS)-1a,4,9,9-tetramethyloctahydro-3a,7-methanoazuleno[1,8a-b]oxireneC15H24O15190.710.620.62——— 161,4,6-trimethyl-1,2,3,3a,4,7,8,8a-octahydro-4,7-ethanoazuleneC15H2415280.480.500.80——— 17alloaromadendrene oxide-(2)C15H24O15310.180.120.46——— 182-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-enyl)cyclopropanecarboxylic acid, methyl esterC14H22O21542—0.14———— 19(8R,8aS)-8,8a-dimethyl-2-(propan-2-ylidene)-1,2,3,7,8,8a-hexahydronaphthaleneC15H2215450.371.000.29——— 204,8,8-trimethyl-2-methylene-4-vinylbicyclo[5.2.0]nonaneC15H241547—0.160.830.140.15— 212-(4a,8-dimethyl-2,3,4,4a,5,6-hexahydro-naphthalen-2-yl)-prop-2-en-1-olC15H22O15583.265.730.64———

續(xù)表2

序號(hào)化合物化學(xué)式保留指數(shù)相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)/% BTSTTSQNSBTCTTCQNC 228S,14-cedrandiolC15H26O215610.611.071.160.320.66— 23(4aS,8R)-4a,8-dimethyl-4,4a,5,6,7,8-hexahydronaphthalen-2(3H)-oneC12H18O1568————0.10— 24heneicosapentaenoic acid methyl esterC22H34O21572—0.170.260.170.18— 25(1R,4S,5S)-1,8-dimethyl-4-(prop-1-en-2-yl)spiro[4.5]dec-7-eneC15H2415781.401.688.521.171.282.57 261,1,7,7a-tetramethyl-1a,2,6,7,7a,7b-hexahydro-1H-cyclopropa[a]naphthaleneC15H221585—0.53———— 272-[(2R,4aR,8aS)-4a-methyl-8-methylenedecahydronaphthalen-2-yl]prop-2-en-1-olC15H24O15871.920.883.680.370.70— 28(1R,7S,E)-7-isopropyl-4,10-dimethylenecyclodec-5-enolC15H24O15970.220.55———— 29纈草酸C15H22O21601——0.35——— 30eudesma-4(14),7(11)-dieneC15H2416050.550.280.62——— 31(1S,4S,7R)-1,4,9,9-tetramethyl-1,2,3,4,5,6,7,8-octahydro-4,7-methanoazuleneC15H2416100.220.270.81——— 322-[(2R,4aR,8aR)-4a,8-dimethyl-1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahydronaphthalen-2-yl]prop-2-en-1-olC15H24O1613—0.29—0.230.12— 33愈創(chuàng)木烯C15H2416152.703.551.990.840.61— 34cadineneC15H2416252.707.193.221.270.52— 35(1R,3aS,8aS)-7-isopropyl-1,4-dimethyl-1,2,3,3a,6,8a-hexahydroazuleneC15H2416291.381.751.391.371.01— 36β-馬欖烯C15H2416321.461.932.130.860.53— 37(?)-aristoleneC15H2416362.682.662.771.521.520.44 38pethylbreneC15H2416423.214.676.563.753.170.56 39沉香螺旋醇C15H26O16448.227.789.256.335.301.44 40selina-3,7(11)-dieneC15H241649—0.16———— 41(R)-2-[(4aS,8aR)-4a-methyl-8-methylene-1,4,4a,5,6,7,8,8a-octahydronaphthalen-2-yl]propan-1-olC15H24O16550.330.610.75——— 42(E)-2-[(8R,8aS)-8,8a-dimethyl-3,4,6,7,8,8a-hexahydronaphthalen-2(1H)-ylidene]propan-1-olC15H24O1658——0.311.710.72— 432-[(2R,4aR)-4a,8-dimethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7-octahydronaphthalen-2-yl]prop-2-en-1-olC15H24O16600.262.302.010.630.57— 44桉油烯醇C15H24O16636.965.653.960.320.260.38 454,4-dimethyl-3-(3-methylbut-3-enylidene)-2-methylenebicyclo[4.1.0]heptaneC15H2216681.601.551.60——— 46valenceneC15H241676——1.41——— 47(E)-3-[(4S,7R,7aR)-3,7-dimethyl-2,4,5,6,7,7a-hexahydro-1H-inden-4-yl]-2-methylacrylaldehydeC15H22O16782.340.672.391.260.770.71 48spiro[2.7]dec-4-ene,1,1,5,6,6,9,9-heptamethyl-10-methyleneC18H30168214.57.815.991.002.180.50 49aristol-1(10)-en-9-olC15H24O16881.641.83———— 501(10),11-eremophiladien-9-oneC15H22O1689——1.490.240.240.31 51doconexentC22H32O216941.061.341.562.850.780.31 52tricyclo[5.2.2.0(1,6)]undecan-3-ol,2-methylene-6,8,8-trimethylC15H24O1706—0.94———— 53(1aR,4aS,8aS)-4a,8,8-trimethyl-1,1a,4,4a,5,6,7,8-octahydrocyclopropa[d]naphthalene-2-carbaldehydeC15H22O17084.54—7.770.471.181.45 546-(1,3-dimethyl-buta-1,3-dienyl)-1,5,5-trimethyl-7-oxa-bicyclo[4.1.0]hept-2-eneC15H22O17130.21—0.32——— 556-isopropenyl-4,8a-dimethyl-1,2,3,5,6,7,8,8a-octahydro-naphthalen-2-olC15H24O17161.280.741.880.540.870.47 56cis-thujopseneC15H241723————0.12— 576-(1-hydroxymethylvinyl)-4,8a-dimethyl-3,5,6,7,8,8a-hexahydro-1H-naphthalen-2-oneC15H22O21723——0.17——— 584,6,6-trimethyl-2-(3-methylbuta-1,3-dienyl)-3-oxatricyclo[5.1.0.0(2,4)]octaneC15H22O1727——0.910.140.17— 59tricyclo[4.2.1.1(2,5)]deca-3,7-dien-9-one,10-butyl-10-hydroxy-stereoisomerC14H18O217293.524.190.55——— 603-epi-cedrenalC15H22O17362.291.310.240.440.60— 61squamulosoneC15H22O17385.963.745.812.164.440.75 62γ-himachaleneC15H2417440.330.380.880.841.170.51 63aristoloneC15H22O1748—0.14———— 649,12-octadecadiynoic acid,methyl esterC19H30O21748————0.14— 65(E)-2-[(8R,8aS)-8,8a-dimethyl-3,4,6,7,8,8a-hexahydronaphthalen-2(1H)-ylidene]propanalC15H22O17530.830.470.440.150.32—

續(xù)表2

3.1.1 6種沉香精油化學(xué)成分?jǐn)?shù)量比較 如表2所示，從BTS中鑒定出化合物48種，占精油總含量的98.01%；從BTC鑒定出化合物71種，占精油總含量的96.16%；從TTS鑒定出化合物55種，占精油總含量的96.99%；從TTC鑒定化合物72種，占精油總含量的96.41%；從QNS鑒定化合物59種，占精油總含量的97.02%；從QNC鑒定化合物35種，占精油總含量的95.29%。

奇楠沉香、通體香和板頭香3種沉香原料所得沉香精油，BTC和TTC中化學(xué)成分?jǐn)?shù)量均高于其水蒸氣蒸餾精油，且增加的化合物主要為脂肪酸類和2-(2-苯乙基)色酮類化合物，同時(shí)，BTC和TTC中的倍半萜類化合物數(shù)目并沒(méi)有減少，甚至還提取出BTS和TTS中不存在的倍半萜類化合物，這說(shuō)明超臨界CO2萃取法相較于水蒸氣蒸餾法，提取效果更佳。此外，QNS中鑒定出的化合物數(shù)量及其中倍半萜類化合物數(shù)量均高于BTS和TTS，這說(shuō)明奇楠沉香中具有更加豐富的香氣成分。然而，由于QNC中2-(2-苯乙基)色酮類化合物含量過(guò)高，大大降低了精油中其他化合物含量占比，以至于面積歸一法中積分方法較難對(duì)少含量的化合物進(jìn)行積分鑒定，故QNC中鑒定出的化合物數(shù)目?jī)H有35種。

綜上，3種沉香中，水蒸氣蒸餾法提取的精油主要成分均為小分子芳香化合物及倍半萜類化合物，出峰時(shí)間集中在16～45 min（圖2），而超臨界CO2萃取法能夠提取到更多的化合物，精油出峰時(shí)間較均勻，且在75～90 min出現(xiàn)了水蒸氣蒸餾精油中沒(méi)有的色酮類化合物。

圖2 6種沉香精油GC-MS總離子流圖

3.1.2 6種沉香精油化合物種類及其相對(duì)含量比較 如圖3所示，沉香精油主要由倍半萜類、小分子芳香物質(zhì)、2-(2-苯乙基)色酮類及脂肪酸類化合物組成，而不同沉香精油，其化合物種類相對(duì)含量也有明顯的不同?？梢钥闯?，不同提取方式對(duì)精油不同成分相對(duì)含量影響更大。3種沉香水蒸氣蒸餾精油中，倍半萜類及小分子芳香物質(zhì)成分含量較多，而超臨界萃取精油中，則出現(xiàn)了大量水蒸氣蒸餾精油中沒(méi)有的色酮類化合物，且能得到更多的脂肪酸類化合物。

3種不同沉香中，板頭香和通體香化合物含量組成相似，無(wú)論是超臨界萃取精油還是水蒸氣蒸餾精油，其小分子芳香成分含量均高于奇楠沉香，但奇楠沉香精油中，2-(2-苯乙基)色酮類化合物含量極高，奇楠沉香超臨界萃取精油中，僅4種2-(2-苯乙基)色酮化合物含量之和，便占總色譜峰面積的60%以上，甚至是在水蒸氣蒸餾提取的長(zhǎng)時(shí)間高溫環(huán)境下，也有微量的2-(2-苯乙基)色酮類化合物提取出來(lái)，這與之前文獻(xiàn)報(bào)道相似[19-20]。

從6種沉香精油的HCA圖（圖4）也可看出，沉香水蒸氣蒸餾精油和超臨界萃取精油分為2組，通體香和板頭香無(wú)論是水蒸氣蒸餾精油還是超臨界萃取精油，二者精油成分及含量十分相似，而奇楠沉香相差較大，特別是QNC，這是由于QNC中含有大量的2-(2-苯乙基)色酮類化合物造成的差異。根據(jù)有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA）模型分析篩選這2組之間的差異代謝物，變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）較高的化合物有2-(2-苯乙基)色酮（VIP 3.74）、spiro[2.7]dec-4-ene,1,1,5,6,6,9,9-heptamethyl-10-methylene（VIP 2.68）、2-(4-methoxyphenethyl)-4-chromen-4-one（VIP 2.34）、nootkatone（VIP 2.27）等，說(shuō)明以上化合物對(duì)不同提取方式所得沉香精油的分類影響較為顯著?？梢钥闯?，水蒸氣蒸餾沉香精油與超臨界萃取沉香精油能夠明顯區(qū)分，這說(shuō)明不同的精油提取方式所得到的沉香精油化合物成分有所不同。

圖3 6種沉香精油中化合物含量

圖4 6種沉香精油HCA圖

綜上，通過(guò)6種沉香精油化合物種類含量比較可知，板頭香和通體香精油化合物成分種類和含量相似，而奇楠沉香精油中含有更多的色酮類化合物，特別是QNC，2-(2-苯乙基)色酮化合物總質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)60%以上。水蒸氣蒸餾提取法無(wú)法提出色酮類成分，精油中小分子芳香物質(zhì)及倍半萜類化合物含量較多，而超臨界CO2萃取法精油中則出現(xiàn)了大量水蒸氣精油中沒(méi)有的色酮類化合物，且能夠提取出更多的脂肪酸類化合物。

3.2 沉香精油抗氧化活性測(cè)定

3.2.1 不同沉香精油清除DPPH自由基活性 如圖5所示，6種沉香精油清除DPPH自由基能力不同，在0.5～5 mg/mL的質(zhì)量濃度中，6種沉香精油的DPPH自由基清除能力與質(zhì)量濃度呈不同程度的正相關(guān)。在這些精油中，DPPH自由基清除能力最強(qiáng)的是TTC精油，最弱的是BTS精油。3種超臨界萃取沉香精油，在5 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率均在50%以上，而3種水蒸氣蒸餾沉香精油，同等質(zhì)量濃度下，清除率均在50%以下，可以看出，無(wú)論是何種沉香，超臨界萃取精油DPPH自由基清除能力均比水蒸氣蒸餾提取精油強(qiáng)。而不同來(lái)源沉香，同種提取方式的沉香精油DPPH自由基清除能力雖有不同，但差距較小，抗氧化活性相似。6種沉香精油的DPPH自由基清除能力強(qiáng)弱與其化合物組成結(jié)果十分相似，這說(shuō)明沉香精油的DPPH自由基清除能力與這些沉香精油不同提取方式所致化學(xué)成分的不同有關(guān)。不同提取方式所致的精油氧化能力的不同，可能是由于水蒸氣蒸餾提取精油長(zhǎng)時(shí)間與空氣在熱環(huán)境下接觸，致使部分化合物被氧化，其抗氧化能力降低，而超臨界萃取精油能夠保留一些熱敏性強(qiáng)，容易氧化分解破壞的成分，故抗氧化能力較高。

圖5 沉香精油清除DPPH自由基活性

3.2.2 不同沉香精油清除ABTS自由基活性 如圖6所示，6種沉香精油ABTS自由基清除能力與質(zhì)量濃度呈不同程度的正相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，同DPPH自由基清除能力相反，通體香和板頭香的水蒸氣蒸餾精油的ABTS自由基清除能力整體要強(qiáng)于超臨界萃取精油，QNC的ABTS自由基清除能力則強(qiáng)于QNS。在這些精油中，TTS的ABTS自由基清除能力最強(qiáng)，在2 mg/mL時(shí)，其ABTS自由基清除率高達(dá)83.26%；QNS的ABTS自由基清除能力最弱，在2 mg/mL時(shí)，其ABTS自由基清除率最高僅為53.03%。總體上，6種沉香精油的ABTS自由基清除能力差距較DPPH自由基清除能力差距小。

2個(gè)自由基清除實(shí)驗(yàn)中，陽(yáng)性對(duì)照BHT在0.05～0.50 mg/mL，其ABTS自由基清除清除率均在99%以上，自由基清除能力遠(yuǎn)高于沉香精油，但同等質(zhì)量濃度下，BHT的DPPH自由基清除能力較弱，表明BHT清除DPPH和ABTS自由基的能力有所不同。同樣，雖然趨勢(shì)并不明顯，但普通沉香的超臨界萃取精油和水蒸氣蒸餾精油在ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)中與DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)呈現(xiàn)相反的結(jié)果，推測(cè)沉香精油抗氧化活性的差異是由于不同氧化體系的自由基清除原理不同造成的。并且在ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)中，奇楠沉香又同普通沉香的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反，這可能與奇楠沉香中色酮類化合物含量較高有關(guān)。

圖6 沉香精油清除ABTS自由基活性

3.3 不同沉香精油對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響

炎癥是機(jī)體對(duì)各種刺激產(chǎn)生的一種自我防御，通常情況下，炎癥是有益的，但是過(guò)度的炎癥反應(yīng)卻會(huì)引起組織損傷和誘發(fā)疾病。LPS是細(xì)菌感染性炎癥反應(yīng)中最主要的促炎因子，可誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞合成并釋放腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β、IL-8等多種炎癥因子[21]。研究表明，沉香揮發(fā)油具有較強(qiáng)的體內(nèi)外抗炎活性[22-24]，但不同來(lái)源、不同提取方式得到的沉香精油的抗炎差異卻少有研究。

因此，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了不同質(zhì)量濃度的6種沉香精油對(duì)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞活力的影響，其中，BTS、TTS、QNS、BTC、TTC、QNC精油抑制細(xì)胞活性的IC50值分別為18.61、30.30、18.05、41.98、38.45、24.50 μg/mL，陽(yáng)性對(duì)照吲哚美辛的IC50值為10.24 μg/mL。如圖7所示，6種沉香精油在12.5～100 μg/mL，對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞存活率均有顯著的抑制作用（＜0.001）。6種沉香精油抗炎活性相近，QNS抗炎活性最佳，BTS次之，BTC最弱。由于不同提取方式得到的沉香精油抗炎活性具有明顯差異，且3種沉香的水蒸氣蒸餾提取精油作用均優(yōu)于超臨界CO2萃取精油。

4 討論

4.1 2種普通沉香精油化合物成分相似

本研究對(duì)6種沉香精油的化合物數(shù)目和相對(duì)含量進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明，從BTS、TTS和BTC、TTC精油中鑒定出的化合物成分?jǐn)?shù)目分別為48、55及71、72；且精油中主要成分小分子芳香類及倍半萜類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和分別為81.42%、87.84%、62.05%、63.83%。這些數(shù)據(jù)表明，通體香和板頭香2種普通沉香，無(wú)論是超臨界萃取還是水蒸氣蒸餾，所得的精油化學(xué)成分相似。但沉香水蒸氣蒸餾精油同超臨界萃取精油化學(xué)成分具有較大的差異，板頭香及通體香的水蒸氣蒸餾精油與超臨界萃取精油相比，化合物數(shù)量較少，僅有小分子芳香物質(zhì)、倍半萜類化合物及少量脂肪酸成分，超臨界萃取精油中除脂肪酸類及倍半萜類化合物數(shù)目增多外，還提取了大量的2-(2-苯乙基)色酮類化合物，占其精油總成分相對(duì)含量的17%以上。

4.2 奇楠沉香與普通沉香所提精油化學(xué)成分差異較大

QNS中共鑒定出化合物59種，倍半萜類化合物53種，占相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的88.07%，其倍半萜化合物數(shù)量和含量均較BTS（43種，77.3%）和TTS（50種，83.83%）2種精油多。而在QNC中鑒定的化合物僅有35種，且小分子芳香物質(zhì)及倍半萜成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和僅為28.36%，遠(yuǎn)低于BTC和TTC，但其色酮類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)60.42%，遠(yuǎn)高于BTC（22.42%）和TTC（17.48%）?？梢?，相較于板頭香和通體香，水蒸氣蒸餾精油中，QNS具有更豐富的香氣成分（小分子芳香物質(zhì)和倍半萜類成分）；而超臨界萃取精油中，QNC中含有更多的色酮類成分含量，可能是奇楠沉香優(yōu)于普通沉香的原因之一。

與對(duì)照組比較：###P＜0.001；與模型組比較：***P＜0.001

4.3 不同提取方式所得沉香精油抗氧化、抗炎活性各有優(yōu)劣

不同提取方式所得沉香精油的活性差異較大。其中，同批沉香采用超臨界萃取法所得沉香精油抗氧化能力一般強(qiáng)于其水蒸氣蒸餾精油，推測(cè)可能是由于水蒸氣蒸餾精油長(zhǎng)時(shí)間處于高溫環(huán)境中，加速部分化合物氧化，導(dǎo)致其抗氧化能力降低[25]。但其水蒸氣蒸餾精油抗炎能力普遍優(yōu)于超臨界萃取精油。由結(jié)果可知，超臨界CO2萃取所得沉香精油中色酮類化合物的含量遠(yuǎn)高于倍半萜成分。石小翠等[26]認(rèn)為精油抗炎的物質(zhì)基礎(chǔ)可能是其化合物中的醛分子。而Takamatsu等[27]發(fā)現(xiàn)色酮類成分受熱可裂解成一些相對(duì)分子質(zhì)量較低的芳香類化合物，如苯甲醛、芐基丙酮等，這些小分子芳香類成分在水蒸氣蒸餾精油中含量較多。沉香精油中小分子芳香物質(zhì)及倍半萜類化合物中有大量的萜醛類化合物，如spiro[2.7]dec-4-ene,1,1,5,6,6,9,9-heptamethyl- 10-methylene、4a,5-dimethyl-3-(1-methylethylidene)-4,4a,5,6,7,8-hexahydro-2(3)-naphthalenone、沉香螺旋醇等化合物，這可能是水蒸氣蒸餾所得沉香精油抗炎活性均優(yōu)于超臨界萃取精油的主要原因。

同時(shí)，不同來(lái)源精油在抗氧化實(shí)驗(yàn)中雖未表現(xiàn)出明顯趨勢(shì)，但QNS和QNC在水蒸氣蒸餾和超臨界萃取中均顯示出最佳的炎癥細(xì)胞抑制活性，這表明奇楠沉香精油抗炎活性優(yōu)于板頭香和通體香這2種普通沉香，其在抗炎方面具有獨(dú)特的藥理優(yōu)勢(shì)。

沉香作為一種名貴香料，民間多以熏、燒等加熱的方式使用，除了能夠更好地?cái)U(kuò)散沉香的香味之外，是否因沉香中某些成分需受熱裂解后才能發(fā)揮其藥效尚未有相關(guān)研究報(bào)道。水蒸氣蒸餾法是經(jīng)典的沉香精油提取方法，其認(rèn)可度高，但提取率極低；超臨界萃取方式提取精油的優(yōu)勢(shì)在于其提取方式溫和，能在較低溫度下，更快更好地溶解、提取出更多的精油，但這種提取方式是否適用于作為藥用的沉香尚不明晰。沉香精油價(jià)格昂貴，不同來(lái)源、不同提取方式所得沉香精油有所差異，市場(chǎng)上產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊。目前沉香精油的研究多數(shù)僅停留在精油中化學(xué)成分的鑒定，或是單來(lái)源沉香不同提取方法所得精油的初步對(duì)比，關(guān)于不同來(lái)源、不同提取方式得到沉香精油的系統(tǒng)對(duì)比研究幾乎沒(méi)有，光憑沉香精油化合物的分析對(duì)比，并不足以支撐沉香精油質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的建立。本研究對(duì)市場(chǎng)上具有代表性的3種沉香采用2種不同提取方式提取得到6種沉香精油，對(duì)其化學(xué)組成、抗氧化能力及抗炎活性進(jìn)行比較分析，并探討所得沉香精油化學(xué)成分及其抗氧化和抗炎活性的異同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，6種沉香精油化學(xué)成分和活性均有所不同，超臨界CO2萃取法能夠提取到更多的成分，且超臨界CO2萃取沉香精油的抗氧化能力大于水蒸氣蒸餾沉香精油；而水蒸氣蒸餾沉香精油抗炎能力則強(qiáng)于其超臨界萃取精油；同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，板頭香和通體香所得精油化合物組成類似，而奇楠沉香中則含有更多的香氣成分（倍半萜類和小分子芳香類成分）和色酮類化合物，且其抗炎活性優(yōu)于其他2種沉香。精油化學(xué)成分的差異造成活性上的差異，超臨界CO2萃取法條件溫和，精油中保留了更多的抗氧化化合物，而水蒸氣蒸餾沉香精油中含有更多的萜醛類化合物，這可能是不同提取方式所得沉香精油抗氧化、抗炎活性差異的主要原因。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)沉香水蒸氣精油抗炎活性優(yōu)于超臨界萃取沉香精油，同時(shí)，奇楠沉香中除含有更多的香氣成分和色酮類化合物外，其抗炎活性也優(yōu)于其他2種普通沉香，可為沉香精油的應(yīng)用、質(zhì)量評(píng)價(jià)和產(chǎn)品開發(fā)提供一定依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Comparative analysis of chemical constituents and anti-oxidant and anti-inflammatory activities of six representative agarwood essential oils

CHEN Xi-qin1, 2, WANG Can-hong2, FENG Jian2, CHEN De-li2, WEI Jian-he1, 2, LIU Yang-yang2

1. National Engineering Laboratory for Breeding of Endangered Medicinal Materials, Ministry of Education of Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine, Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China 2. Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine for Agarwood Sustainable Utilization, Hainan Provincial Key Laboratory of Resources Conservation and Development of Southern Medicine, Hainan Branch of Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Haikou 570311, China

To compare the compounds composition, antioxidant capacity and anti-inflammatory activity of six kinds of agarwood essential oils from different sources and different extraction methods.The chemical constituents of six agarwood essential oils were analyzed by gas chromatography-time of flight mass spectrometry (GC-TOF MS), their free radical scavenging abilities against 1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine (DPPH) and 2,2-azabis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) were detected, and effect of six agarwood essential oils on lipopolysaccharide (LPS)-induced RAW264.7 cells viabilities were detected.The number of compounds identified from BTS (essential oil extracted by hydrodistillation from ordinary agarwood of trunk-prunning), TTS (essential oil extracted by hydrodistillation from ordinary agarwood of Agar-Wit), QNS (essential oil extracted by hydrodistillation from Chi-Nan agarwood of drilling), BTC (agarwood essential oil extracted by supercritical fluid from ordinary agarwood of trunk-prunning), TTC (agarwood essential oil extracted by supercritical fluid from ordinary agarwood of Agar-Wit), QNC (agarwood essential oil extracted by supercritical fluid from Chi-Nan agarwood of drilling) were 48, 55, 59, 71, 72 and 35, respectively; Total contents of aromatic compounds were 81.42%, 87.84%, 89.03%, 62.05%, 63.83% and 28.36%, respectively; Contents of 2-(2-phenylethyl) chromones were 0, 0, 0.25%, 22.42%, 17.48% and 60.42% respectively. Six agarwood essential oils all had the ability to scavenge DPPH and ABTS free radicals, and the essential oils were positively correlated with the free radical scavenging ability between 0.5—5 mg/mL. Half inhibition concentration (IC50) of agarwood essential oils extracted by hydrodistillation (BTS, TTS, QNS) on LPS-induced RAW264.7 cells were 18.61, 30.30, 18.05 μg/mL, and IC50values of three agarwood essential oils extracted by supercritical fluid (BTC, TTC, QNC) were 41.98, 38.45, 24.50 μg/mL.Agarwood essential oils extracted by supercritical fluid contains more fatty acids and chromones, which is quite different from that of hydrodistillation. The chemical constituents of essential oil obtained by same extraction method of BT and TT are similar, while Chi-Nan contains more aroma substances and 2-(2-phenylethyl) chromones. DPPH radical scavenging ability of essential oils extracted by supercritical fluid is stronger than that extracted by hydrodistillation, but the anti-inflammatory activity was the opposite.Among the three sources of agarwood, Chi-Nan agarwood essential oil has the best anti-inflammatory ability.

; Chi-Nan; essential oil; chemical constituents; anti-oxidant; anti-inflammatory; 2-(2-phenylethyl) chromones

R285.5

A

0253 - 2670(2022)18 - 5720 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.18.015

2022-04-21

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018YFC1706403）；海南省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（ZDYF2020163，ZDYF2020111）；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（2021-I2M-1-032）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-21）

陳細(xì)欽，在讀碩士，從事中藥質(zhì)量控制研究。E-mail: 18359033886@163.com

劉洋洋，研究員，碩士生導(dǎo)師，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。Tel: (0898)31589000 E-mail: eadchris@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]