基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS和生物信息學(xué)探討瓜蔞薤白湯治療冠心病的潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制

孫 志，張媛媛，周勝楠，劉麗偉，包曉悅，程文播，李小強(qiáng)，王 靖，左莉華

基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS和生物信息學(xué)探討瓜蔞薤白湯治療冠心病的潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制

孫 志1, 2，張媛媛1, 2，周勝楠1, 2，劉麗偉1, 2，包曉悅1, 2，程文播3，李小強(qiáng)3，王 靖1, 2，左莉華1, 2

1. 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州 450052 2. 河南省精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)臨床質(zhì)譜工程研究中心，河南 鄭州 450052 3. 中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，江蘇 蘇州 215163

系統(tǒng)分析并識別瓜蔞薤白湯主要化學(xué)成分和入血成分，預(yù)測其防治冠心病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。采用超高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）進(jìn)行瓜蔞薤白湯體內(nèi)外成分分析，結(jié)合色譜峰保留時(shí)間、精確相對分子質(zhì)量、碎片離子、中性丟失等信息進(jìn)行化合物指認(rèn)。使用生物信息學(xué)方法，對潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，借助Cytoscape軟件構(gòu)建瓜蔞薤白湯“活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，對潛在活性成分和作用通路進(jìn)行預(yù)測。利用AutoDock Tools 1.5.6軟件對其活性成分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。瓜蔞薤白湯體外定性得到了68個化學(xué)成分，大鼠ig給藥后在血清樣本中檢測到23個入血成分。其中芹菜素、木犀草素、酒渣堿、亞油酸等化合物為瓜蔞薤白湯發(fā)揮治療冠心病藥效的關(guān)鍵成分，前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxidesynthase 2，PTGS2）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、半胱氨酸蛋白水解酶3（cysteine-containing aspartate-specific protease 3，CASP3）等為瓜蔞薤白湯治療冠心病的主要靶點(diǎn)，涉及到脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、癌癥的途徑、TNF信號通路、NF?κB信號通路、MAPK信號通路。初步鑒定了瓜蔞薤白湯防治冠心病的潛在藥效成分并預(yù)測其作用靶點(diǎn)，為該方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制的深入研究提供參考。

瓜蔞薤白湯；UHPLC-Q-Orbitrap HRMS；入血成分；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對接；芹菜素；木犀草素；酒渣堿

冠心病（coronary heart disease，CHD）是一種與人體多系統(tǒng)相關(guān)的慢性復(fù)雜疾病，已成為世界范圍內(nèi)的主要死亡原因之一[1]，尋求安全有效的治療方法改善冠心病的癥狀十分必要。中藥復(fù)方在我國臨床實(shí)踐了數(shù)千年，體現(xiàn)了“辨證論治”的治療原則，對維持中國人民的健康起著至關(guān)重要的作用。瓜蔞薤白湯源自張仲景的《金匱要略·胸痹心痛短氣病脈證治》[2]，具有通心陽、散瘀滯、止痹痛的功效[3]，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的冠心病心絞痛、冠脈痙攣、心律失常、心肌梗死等癥狀一致。瓜蔞薤白湯由瓜蔞、薤白、白酒煎煮而成，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，瓜蔞薤白湯具有多種生物活性，如心肌保護(hù)[4]、抗氧化[5]、抗炎[6]、干預(yù)慢性阻塞性肺病[7]等。盡管瓜蔞薤白湯已有廣泛的臨床應(yīng)用和大量的藥理學(xué)研究，但關(guān)于其有效化學(xué)成分的數(shù)據(jù)并不充足，也尚未深入探索其治療冠心病的具體作用機(jī)制。

超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)具有高分離能力、高準(zhǔn)確性、高分辨率、低基質(zhì)效應(yīng)等特點(diǎn)，已逐步成為中藥藥效成分快速準(zhǔn)確鑒定的重要手段[8]。藥物成分只有經(jīng)消化道吸收入血到達(dá)靶器官或靶點(diǎn)才能在體內(nèi)發(fā)揮相應(yīng)的藥效[9]，因此挖掘藥物入血成分對于明確藥效成分、闡明藥效物質(zhì)基礎(chǔ)具有重大的意義。生物信息學(xué)整體性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)與中醫(yī)藥整體觀、辯證論治原則相符，已被廣泛用于中藥復(fù)方協(xié)同作用的研究中?；诖?，本研究采用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)對瓜蔞薤白湯化學(xué)成分、入血成分進(jìn)行鑒定，選擇入血成分進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，構(gòu)建“活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，探討其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和潛在作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Ultimate 3000超高效液相色譜儀（美國Dionex公司）；Q-Exactive質(zhì)譜儀（美國Thermo Scientific公司）；ACQUITY UPLC?HSS C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；萬分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Heraeus Fresco 17 Centrifuge型微量冷凍離心機(jī)（美國Thermo Scientific公司）；BX7200HP型超聲波清洗器（上海CIMO醫(yī)療器械制造有限公司）；N-1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）。

1.2 藥材與試劑

瓜蔞、薤白購于張仲景大藥房，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)教授李寒冰鑒定分別為葫蘆科植物栝樓Maxim的成熟果實(shí)、百合科植物小根蒜Bge.的干燥鱗莖。

對照品蘆?。ㄅ朚UST-1603181）、木犀草苷（批號MUST-15012204）、木犀草素（批號MUST-21072311）、芹菜素（批號MUST-16061301）、5-羥甲基糠醛（批號MUST-16031202），均購于成都曼思特生物有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%。精氨酸（批號11009，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.5%），纈氨酸（批號94619，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.5%），色氨酸（T0254，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），均購自美國Sigma公司。白酒購自張仲景大藥房，甲醇、乙腈均為質(zhì)譜級，購自美國Thermo Fisher公司。

1.3 動物

雄性SD大鼠12只，體質(zhì)量（210～250 g）購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（魯）20190003。實(shí)驗(yàn)前在12 h晝夜循環(huán)的動物房內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，自由獲取飼料和飲用水。動物實(shí)驗(yàn)由河南省實(shí)驗(yàn)動物中心實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查并批準(zhǔn)（批件號ZZU-LAC20220225[13]）

1.4 數(shù)據(jù)庫與軟件

SwissTargetPrediction（http://www.swisstarget prediction.ch/），人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards, https:// www.genecards.org/），人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM，https://www.omim.org/），DrugBank數(shù)據(jù)庫（https://go.drugbank.com/），DisGeNET數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org/），STRING數(shù)據(jù)庫（https:// string db.org/），Metascape數(shù)據(jù)庫（http://metascape.org/），蛋白數(shù)據(jù)庫RCSB PDB（https://www.rcsb.org/），微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）。Thermo Xcalibur 3.0軟件，Mass Frontier 7.0軟件，Cytoscape 3.7.2軟件，AutoDock Tools 1.5.6軟件，PyMOL 2.4.1軟件。

2 方法

2.1 體內(nèi)外成分分析

2.1.1 供試品溶液的制備 取瓜蔞30 g、薤白15 g與1400 mL白酒共煎，武火煎沸后轉(zhuǎn)文火煎煮90 min，濾過藥渣后得到約450 mL（含生藥量0.1 g/mL）瓜蔞薤白湯。取適量上述湯劑，3500 r/min離心10 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，即得瓜蔞薤白湯體外定性供試品溶液。取適量上述所得瓜蔞薤白湯，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，濃縮20倍，得到生藥量為2 g/mL大鼠ig液。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱定各對照品1.0 mg，分別置于10 mL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制備成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的單一對照品儲備液；分別精密移取上述儲備液適量，加甲醇稀釋，最終得到質(zhì)量濃度為1 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 動物分組、給藥及樣本處理 12只大鼠隨機(jī)分為對照組和瓜蔞薤白湯給藥組，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。給藥前12 h大鼠禁食不禁水。按10 mL/kg ig 給藥，對照組給予等體積的生理鹽水。于給藥后0.5、1、2、3、4 h，采用眼眶取血的方式各取1 mL于含有肝素鈉的EP管中，靜置約1 h，4 ℃、3500 r/min離心10 min，取上清液，空白組血漿處理方法與給藥組一致。取不同采血點(diǎn)上清各100 μL，渦旋30 s，加3倍量乙腈，渦旋3 min，4 ℃、13 000 r/min離心10 min，取200 μL進(jìn)樣。

2.1.4 液質(zhì)聯(lián)用條件 色譜條件：ACQUITY UPLC?HSS C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱溫40 ℃，體積流量0.2 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），瓜蔞薤白湯體外成分鑒定含藥血清成分鑒定試驗(yàn)梯度洗脫程序?yàn)椋?～4.0 min，5%B；4.0～51.0 min，5%～100%B；51.0～56.0 min，100%B；56.0～56.2 min，100%～5%B。

質(zhì)譜條件：ESI電離源，正、負(fù)離子模式分開掃描。離子傳輸管溫度320 ℃，輔助氣溫度為300 ℃，鞘氣、輔助氣的體積流量分別為45、15 μL/min；碰撞能梯度為20、40、60 eV，質(zhì)荷比窗口寬度設(shè)置為2，質(zhì)量掃描范圍/80～1200。

2.1.5 瓜蔞薤白湯體內(nèi)外代謝產(chǎn)物鑒定 根據(jù)“2.1.4”項(xiàng)下的色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)樣，結(jié)合色譜峰保留時(shí)間、精確相對分子質(zhì)量、碎片離子、中性丟失等信息進(jìn)行瓜蔞薤白湯化學(xué)成分體外定性。給藥組和空白組樣本進(jìn)行對比分析，提取2組間差異質(zhì)譜峰，并結(jié)合保留時(shí)間、加荷離子信息和離子碎片，進(jìn)行瓜蔞薤白湯體內(nèi)入血成分鑒定。

2.2 生物信息學(xué)研究

2.2.1 入血成分靶點(diǎn)搜集 在PubChem數(shù)據(jù)庫中下載23個入血成分的2D結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入SwissADME網(wǎng)站進(jìn)行篩選，標(biāo)準(zhǔn)為Pharmacokinetics項(xiàng)目中GI absorption為“High”，Druglikeness項(xiàng)中滿足2個指標(biāo)為“Yes”，通過篩選的化合物在SwissTarget Prediction數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測。

2.2.2 冠心病相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 基于GeneCards、OMIM、DrugBank和DisGeNET數(shù)據(jù)庫，以“coronary heart disease，CHD”為關(guān)鍵詞，獲取冠心病相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。

2.2.3 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將上述得到的藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)各自刪除重復(fù)后，求交集得到瓜蔞薤白湯和冠心病共同作用的靶點(diǎn)。將瓜蔞薤白湯的活性成分、冠心病，交集基因分別歸類于“Drug”“Disease”“Gene”，建立Network和Type文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。

2.2.4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network，PPI）的構(gòu)建 將上述得到的共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，蛋白種屬為“homo sapiens”，置信度為0.4，其他參數(shù)不變，得到蛋白相互作用關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)圖，下載TSV格式。將該TSV文件導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2軟件，并使用cytoHubba插件進(jìn)行拓?fù)浞治觯@得瓜蔞薤白湯治療冠心病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.2.5 基因本體論（gene ontology，GO）與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析 將瓜蔞薤白湯治療冠心病的相關(guān)靶點(diǎn)上傳到Metascape平臺中進(jìn)行GO和KEGG富集分析，設(shè)定參考值＜0.05、富集因子＞1.5、最小計(jì)數(shù)值為3。最后在微生信網(wǎng)站進(jìn)行GO和KEGG富集分析可視化。

2.2.6 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將瓜蔞薤白湯活性成分、治療冠心病的關(guān)鍵靶點(diǎn)、KEGG富集通路分別歸類為“Drug”“Gene”“Pathway”，建立Network和Type文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。

2.3 分子對接驗(yàn)證

根據(jù)“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖篩選degree值較高的靶點(diǎn)，從PDB數(shù)據(jù)庫下載該蛋白靶點(diǎn)的3D晶體結(jié)構(gòu)pdb文件。根據(jù)“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)篩選關(guān)鍵活性成分，從PubChem數(shù)據(jù)庫中下載活性成分對應(yīng)的SDF文件。通過Chem 3D軟件將2D結(jié)構(gòu)優(yōu)化并保存為3D結(jié)構(gòu)的mol2格式。在AutoDockTools 1.5.6使用Vina軟件進(jìn)行分子對接，最后使用Pymol軟件進(jìn)行分子可視化。

3 結(jié)果與分析

3.1 體內(nèi)外成分鑒定結(jié)果

3.1.1 體外化學(xué)成分鑒定 瓜蔞薤白湯正、負(fù)離子模式下的總離子流圖如圖1所示。共鑒定出68種化學(xué)成分，8種成分經(jīng)對照品比對，詳見表1。包括黃酮類6個、氨基酸類10個、有機(jī)酸14個、核苷類4個、生物堿及含氮類11個、皂苷類6個、揮發(fā)油3個、糖類6個、其他類8個。

圖1 瓜蔞薤白湯在正離子模式(A) 和負(fù)離子模式(B) 下的總離子流圖

表1 瓜蔞薤白湯68個化學(xué)成分質(zhì)譜信息

Table 1 Mass spectrum information of 68 chemical components of Gualouxiebai Decoction

編號成分名稱分子式tR/min離子模式理論值實(shí)測值誤差(×10?6)二級離子碎片來源 F1*蘆丁C27H30O1620.27[M＋H]+611.160 66611.159 85?1.33465.10, 303.05, 285.04, 153.01GL F2*木犀草苷C21H20O1121.57[M－H]?447.093 28447.093 351.16 327.05, 285.04, 151.00GL F3香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷C22H22O1126.60[M－H]?461.108 93461.109 072.67 298.05,283.02,269.042 55.03GL F4*木犀草素C15H10O632.16[M＋H]?285.040 46285.040 473.88 267.03, 151.00, 133.03, 87.04GL F5*芹菜素C15H10O537.45[M－H]?269.045 54269.045 654.46 225.06, 151.00, 107.01GL F6香葉木素C16H12O614.49[M＋H]+301.070 66301.068 94?5.73151.00, 107.01GL A1*精氨酸C6H14N4O21.50[M＋H]+175.118 95175.118 90?0.30158.09, 130.10, 116.07, 112.09GL、XB A2*纈氨酸C5H11NO21.58[M＋H]+118.086 25118.086 18?0.6472.08, 57.06, 55.05GL、XB A3谷氨酰胺C5H9NO41.21[M＋H]+148.060 43148.060 10?2.26130.05, 120.08, 102.05, 84.04GL、XB A4蒜氨酸C6H11NO3S1.54[M＋H]+178.053 24178.053 22?0.12160.04, 91.02, 88.04XB A5L-亮氨酰-L-脯氨酸C11H20N2O31.65[M＋H]+229.154 66229.154 60?0.30116.07, 86.10, 70.07GL A6脯氨酸C5H9NO21.53[M＋H]+116.070 60116.070 48?1.0898.06, 74.02, 70.07GL A7焦谷氨酸C5H7NO31.66[M＋H]+130.049 86130.049 930.46 112.05, 102.05, 84.04GL A8亮氨酸C6H13NO21.78[M＋H]+132.101 90132.101 85?0.4286.10, 69.07GL

續(xù)表1

編號成分名稱分子式tR/min離子模式理論值實(shí)測值誤差(×10?6)二級離子碎片來源 A9苯丙氨酸C9H11NO22.37[M＋H]+166.086 25166.086 320.39149.06, 131.05, 120.08, 79.05GL A10*色氨酸C11H12N2O24.48[M＋H]+205.097 15205.097 03?0.61188.07, 170.06, 118.06XB O1煙酸C6H5NO21.63[M＋H]+124.039 30124.039 310.0480.05GL O24-羥基-煙酸C6H5NO31.67[M＋H]+140.034 21140.034 18?0.28121.03, 94.03GL O3肉桂酸C9H8O22.36[M＋H]+149.059 70149.059 750.30131.05, 103.05, 79.05GL O4原兒茶酸C7H6O423.62[M＋H]+155.033 88155.033 80?0.06135.01, 109.03, 91.09GL O5香草酸C8H8O48.47[M＋H]+169.049 53169.049 791.51152.01, 123.04, 108.02GL O69-氧代壬酸C9H16O342.94[M＋H]+173.117 22173.116 87?2.21153.09, 125.10GL O8水楊酸C7H6O319.90[M－H]?137.024 41137.024 297.08 109.03, 93.03GL O99S,13R-12-oxophytodienoic acidC18H28O340.92[M＋H]+293.211 12293.210 69?1.47275.20, 219.17, 205.16, 149.10GL O10天師酸C18H34O542.71[M－H]?329.233 34329.233 373.40 311.22, 293.21, 229.14, 171.10GL O112-羥基-6-(4-羥基苯乙基)苯甲酸C15H14O441.50[M－H]?257.081 93257.081 944.30 213.09, 107.05, 93.03XB O12十八碳三烯酸C18H30O347.35[M＋H]+295.226 77295.226 26?1.73277.22, 259.20, 99.08GL O133-甲?；?2-甲基苯甲酸C9H8O31.69[M＋H]+165.054 62165.054 60?0.13150.03, 122.04, 79.05XB O14亞油酸C18H32O29.62[M－H]?279.232 95279.232 572.55279.23GL、XB O15瓜蔞酸C18H30O250.06[M＋H]+279.231 85279.231 35?1.82261.22, 137.13, 123.12, 109.10GL N1腺苷C10H13N5O41.63[M＋H]+268.104 03268.103 91?0.45136.06, 119.03GL、XB N3腺嘌呤C5H5N51.56[M＋H]+136.061 77136.061 72?0.38119.03, 94.04, 67.03GL、XB N4鳥嘌呤核苷C10H13N5O51.70[M＋H]+284.098 94284.098 72?0.79152.06, 135.03, 110.03GL、XB N5胸腺嘧啶核苷C10H14N2O52.31[M－H]?241.082 99241.082 412.12151.05, 125.04GL AN2葫蘆巴堿C7H7NO26.34[M＋H]+138.054 95138.054 980.18120.04, 110.06, 94.06GL AN31-羥甲基-2-吡咯醛C6H7NO23.74[M＋H]+126.054 95126.054 67?2.26108.04, 98.06, 80.05XB AN42,3,4,9-四氫-1H-β-咔啉-3-甲酸C12H12N2O28.40[M＋H]+217.097 15217.097 431.27171.09, 144.08, 130.07, 86.02XB AN59H-吡啶并[2,3-B]吲哚C11H8N212.23[M＋H]+169.076 02169.075 96?0.38169.07, 93.03XB AN64-[2-甲?；?5-(羥甲基)-1H-吡咯-1-基]丁酸C10H13NO410.54[M－H]?210.077 18210.077 014.41124.04, 94.03, 66.03GL AN71-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-β-咔啉-羧酸C13H14N2O29.52[M＋H]+231.112 80231.112 69?0.49214.09, 144.08, 130.06, 102.06XB AN9正香豆酰酪胺C17H17NO328.24[M＋H]+284.128 11284.127 90?0.77164.07, 147.04, 121.06, 103.05XB AN10順式-N-阿魏酰酪胺C18H19NO430.03[M＋H]+314.138 68314.138 61?0.24177.05, 149.06, 121.06, 93.07GL AN111-羧丙基-5-乙氧甲基-1H-吡咯-2-醛-吡咯C12H17NO41.89[M＋H]+240.123 03240.122 96?0.31124.04, 94.03, 66.03GL AN124-氨基苯甲酸丁酯C11H15NO230.07[M＋H]+194.117 55194.117 740.95138.05, 110.06, 94.07GL AN13酒渣堿C17H12N2O431.59[M＋H]+309.086 98309.086 70?0.92281.09, 263.08, 235.09, 206.08GL S1知母皂苷CC45H74O1835.61[M＋H]+903.494 79903.494 20?0.66741.44, 579.39, 435.28, 417.34XB S2知母皂苷A-IIIC39H64O1336.61[M＋H]+741.441 96741.440 43?2.08579.39, 435.27, 417.34, 273.22XB S3薯蕷皂苷元-3-O-β-D-吡喃-葡萄糖苷C33H52O841.72[M＋H]+577.373 49577.373 05?0.77415.32, 273.22, 255.21XB S47-羥基色原酮C9H6O314.76[M－H]?161.024 41161.024 326.21161.02 S5gitogeninC27H44O445.50[M＋H]+433.331 23433.330 57?1.54415.32, 397.31, 289.22, 271.20XB

續(xù)表1

*由對照品比對確定 F-黃酮類 A-氨基酸類 O-有機(jī)酸類 N-核苷類 AN-生物堿及含氮類 S-皂苷類 V-揮發(fā)油類 C-糖類 Other-其他類 GL-瓜蔞藥材 XB-薤白藥材 GXD-瓜蔞薤白湯

*determined by reference substance F-flavonoids A-amino acids O-organic acids N-nucleoside AN-alkaloids and nitrogens S-saponins V-volatile oils C-carbohydrate Other-other classes GL-XB-GXD-Gualouxiebai Decoction

3.1.2 體內(nèi)入血成分鑒定 給藥組血清總離子流圖如圖2所示，共鑒定出23個入血成分，詳見表2。

3.1.3 體內(nèi)外成分鑒定 瓜蔞薤白湯中共鑒定出68個成分，入血成分中鑒定出23個，以黃酮類F4為例，該化合物在正離子模式下分子離子峰為287.05，經(jīng)Xcalibur軟件擬合得到其對應(yīng)分子式C15H10O6，通過分析其二級并通過對照品比對，鑒定F4為木犀草素，裂解規(guī)律見圖3-A。以有機(jī)酸類O5在負(fù)離子模式下分子離子峰為152.01，經(jīng)Xcalibur軟件擬合得到其對應(yīng)分子式為C8H8O4，根據(jù)該化合物的精確相對分子質(zhì)量、斷裂方式，分析其二級碎片離子信息，最終確定O5為香草酸，裂解規(guī)律見圖3-B。

3.2 生物信息學(xué)研究

3.2.1 瓜蔞薤白湯活性成分的篩選與靶點(diǎn)的預(yù)測 瓜蔞薤白湯入血成分均通過SwissADME篩選，利用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫，下載活性成分的靶點(diǎn)表格，規(guī)定probability≥1倍中位數(shù)為篩選條件，合并去重后得到396個瓜蔞薤白湯潛在作用靶點(diǎn)。

3.2.2 冠心病靶點(diǎn)的篩選 在GenenCards數(shù)據(jù)庫中，以“coronary heart disease”為關(guān)鍵詞，設(shè)置relevance score≥30為篩選條件，得到靶點(diǎn)379個。同樣將以上關(guān)鍵詞輸入到OMIM和DrugBank數(shù)據(jù)庫，分別得到553、35靶點(diǎn)。在DisGeNET數(shù)據(jù)庫中，篩選出score值大于等于2倍中位數(shù)的靶點(diǎn)415個。最后將4個數(shù)據(jù)庫得到的靶點(diǎn)求并集，刪去重復(fù)項(xiàng)后共得到1185個冠心病候選靶點(diǎn)。

3.2.3 核心靶點(diǎn)的篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將瓜蔞薤白湯活性成分對應(yīng)的396個靶點(diǎn)與冠心病相關(guān)的1185個疾病靶點(diǎn)取交集，得到70個瓜蔞薤白湯防治冠心病的潛在靶點(diǎn)（圖4）。將獲得的70個核心靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，蛋白種屬為“homo sapiens”，置信度為0.4，刪除游離靶點(diǎn)，得到PPI網(wǎng)絡(luò)的TSV文件，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)（圖5）。該網(wǎng)絡(luò)共有67個節(jié)點(diǎn)，492條邊。

A-空白血清正離子模式 B-含藥血清正離子模式 C-空白血清負(fù)離子模式 D-含藥血清負(fù)離子模式

表2 瓜蔞薤白湯23個入血成分質(zhì)譜信息

Table 2 Mass spectrum information of 23 absorbed components of Gualouxiebai Decoction in plasma

編號鑒定成分分子式tR/min離子模式理論值實(shí)測值誤差(×10?6)碎片離子 F4木犀草素C15H10O66.91[M＋H]+287.055 01287.054 32?2.40287.05, 269.04, 153.02, 135.04, 89.04 F5芹菜素C15H10O531.44[M＋H]+271.060 09271.058 41?6.24271.06, 153.02, 91.05 A2纈氨酸C5H11NO21.24[M＋H]+118.086 25118.086 15?0.11118.09, 57.06 A4蒜氨酸C6H11NO3S1.32[M＋H]+178.053 24178.053 421.01132.04, 91.02, 88.04 A7焦谷氨酸C5H7NO31.17[M＋H]+130.049 86130.049 930.46130.05, 84.04 A9苯丙氨酸C9H11NO21.37[M＋H]+166.086 25166.086 14?0.69149.06, 131.05, 120.08, 79.05 A10色氨酸C11H12N2O21.37[M＋H]+205.097 15205.096 97?0.90205.10, 188.07, 170.06, 118.06 O3肉桂酸C9H8O236.16[M＋H]+149.059 70148.051 88?0.98149.06, 103.05, 79.05 O5香草酸C8H8O41.35[M－H]?167.03498167.034 745.12152.01, 123.04, 108.02 O8水楊酸C7H6O314.89[M＋H]+139.038 97139.038 970.86109.03, 93.03 O10天師酸C18H34O521.70[M－H]?329.233 34329.233 281.03229.14, 211.13, 171.10 O12十八碳三烯酸C18H30O337.82[M＋H]+295.226 77295.227 170.40259.20, 99.08, 81.07 O14亞油酸C18H32O243.92[M－H]?279.232 95279.231 841.05279.23, 261.22 O15瓜蔞酸C18H30O228.88[M＋H]+279.231 85279.231 41?1.60279.23, 149.02, 121.03 AN2葫蘆巴堿C7H7NO21.21[M＋H]+138.054 95138.054 95?0.04110.06, 94.07 AN124-氨基苯甲酸丁酯C11H15NO28.41[M－H]?192.103 00192.102 392.52138.05, 110.06, 94.07 AN13酒渣堿C17H12N2O418.61[M＋H]+309.086 98309.086 00?3.18281.09, 263.08, 235.09, 206.08 S47-羥基色原酮C9H6O316.82[M－H]?161.024 41161.024 406.70161.02 S5gitogeninC27H44O433.74[M－H]?431.316 68431.317 384.16431.32 V2鄰苯二甲酸二丁酯C16H22O437.66[M＋H]+279.159 08279.159 00?0.31167.03, 149.02, 121.03, 93.03 C3半乳糖酸-γ-內(nèi)酯C6H10O61.16[M－H]?177.040 46177.040 456.13177.04 Other6黑麥草內(nèi)酯C11H16O38.98[M＋H]+197.117 22197.117 11?0.56197.12, 151.11 Other8前列腺素E1C20H35O424.47[M＋H]+355.247 90355.245 18?2.72355.24

A-木犀草素裂解途徑 B-香草酸裂解途徑

3.2.4 生物過程和通路富集分析 通過Metascape數(shù)據(jù)庫對70個核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析，共獲得158條結(jié)果（＜0.01），根據(jù)值排序結(jié)果，篩選出10條排名最高的富集通路（表3），包括脂質(zhì)與動脈粥樣硬化（lipid and atherosclerosis）、癌癥的途徑（pathways in cancer）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、IL-17信號通路（IL-17 signaling pathway）、核因子κB信號通路（NF?κB signaling pathway）、絲裂原激活蛋白激酶信號通路（MAPK signaling pathway）、PPAR信號通路（PPAR signaling pathway）等，見圖6。GO功能富集分析，主要包括生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組成（cellular component，CC）與分子功能（molecular function，MF）。共獲得640個GO富集分析結(jié)果（＜0.01），根據(jù)值簡單排序后，選取前15個生物過程、前10個細(xì)胞組成和前10個分子功能組成GO富集分析柱形圖，見圖7。GO-BP分析可得到447個條目，發(fā)現(xiàn)瓜蔞薤白湯防治冠心病富集在循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)程、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控、激素水平調(diào)節(jié)、激素應(yīng)答等BP；GO-CC分析得到90個條目，發(fā)現(xiàn)其富集在脂筏、膜側(cè)、受體復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)等CC；GO-MF分析得到103個條目，發(fā)現(xiàn)其富集在脂質(zhì)結(jié)合、內(nèi)太酶活力以及蛋白域特異結(jié)合等MF。

圖4 瓜蔞薤白湯活性成分靶點(diǎn)與冠心病靶點(diǎn)韋恩圖

圖5 瓜蔞薤白湯治療冠心病的PPI網(wǎng)絡(luò)

表3 瓜蔞薤白湯治療冠心病的核心靶點(diǎn)拓?fù)鋮?shù)

Table 3 Topological parameters of core target points of GXD in the treatment of CHD

靶點(diǎn)名稱節(jié)點(diǎn)連接度中介中心度接近中心度 TNF480.154 478 820.295 212 77 EGFR380.076 417 900.371 266 00 PTGS2370.063 171 650.411 411 41 MMP9330.023 187 930.492 424 24 ACE320.064 436 540.425 403 23 CASP3320.045 133 930.453 629 03 ICAM1300.022 580 280.487 356 32 TLR4290.026 208 550.482 758 62 ESR1280.041 416 950.410 052 91 PPARG270.041 175 000.424 501 42

3.2.5 “活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將瓜蔞薤白湯活性成分、信號通路、核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，得“活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖8。網(wǎng)絡(luò)圖中包括99個節(jié)點(diǎn)（包括65個核心靶點(diǎn)，23個活性成分，10個通路節(jié)點(diǎn)）和193條邊。成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖靶點(diǎn)最大degree值為25，最小為1。平均度值4，平均介數(shù)為0.037，平均接近值為0.31，其中有5個成分、10個靶基因，5條通路在平均值以上。推測前列腺素E1（Other8）、芹菜素（F5）、木犀草素（F4）、亞油酸（O14）、酒渣堿（AN13）為瓜蔞薤白湯治療冠心病的關(guān)鍵成分。PTGS2、TNF、MMP9、EGFR、CASP3、AR、ACE、ESR2、MMP2、F2為瓜蔞薤白湯治療冠心病的主要靶點(diǎn)。通路方面則集中在脂質(zhì)與動脈粥樣硬化（lipid and atherosclerosis）、癌癥的途徑（pathways in cancer）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signalingpathway）、核因子κB信號通路（NF?κB signaling pathway）、絲裂原激活蛋白激酶信號通路（MAPK signaling pathway）。

圖6 瓜蔞薤白湯防治冠心病核心靶點(diǎn)KEGG富集分析

3.3 分子對接驗(yàn)證

以前列腺素E1、芹菜素、木犀草素、酒渣堿為配體，PTGS2、TNF、MMP9、EGFR為受體進(jìn)行結(jié)合能力預(yù)測，見圖9。對接結(jié)果只保留每對分子對接的predicted binding affinity絕對值最高的。一般認(rèn)為結(jié)合能小于?4.25 kJ/mol提示配體與受體有一定的結(jié)合活性，小于?5.0 kJ/mol有較好的結(jié)合活性，小于?7.0 kJ/mol有強(qiáng)烈的結(jié)合活性[10]。本實(shí)驗(yàn)對接得分均≤?4.25 kJ/mol，其中對接得分≤?9.0 kJ/mol的成分占37.5%，對接得分在?9.0～?7.0 kJ/mol的成分也占37.5%。木犀草素和PTGS2、EGFR對接得分最高，可視化結(jié)果見圖10。

圖7 瓜蔞薤白湯防治冠心病核心靶點(diǎn)的GO富集分析

圓形節(jié)點(diǎn)為活性成分 矩形為靶點(diǎn) 菱形為通路

4 討論

瓜蔞薤白湯具有振奮胸陽，行氣散結(jié)的功效，是治療冠心病的經(jīng)典方劑，臨床應(yīng)用廣泛且療效顯著。本研究采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對瓜蔞薤白湯體內(nèi)外成分進(jìn)行全面鑒定，并基于多成分、多靶點(diǎn)的研究思路，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，分析瓜蔞薤白湯治療冠心病的關(guān)鍵靶點(diǎn)，闡述其作用機(jī)制，為瓜蔞薤白湯的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

圖9 靶蛋白-活性成分分子對接得分熱圖

本實(shí)驗(yàn)體外共識別出包括黃酮類、氨基酸類、有機(jī)酸類等68個化學(xué)成分，隨后在大鼠給藥血清樣本中捕捉到了23個入血成分。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果表明瓜蔞薤白湯可以通過多通路多靶點(diǎn)發(fā)揮療效，“活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖提示，前列腺素E1（Other8）、芹菜素（F5）、木犀草素（F4）、酒渣堿（AN13）、亞油酸（O14）可能是瓜蔞薤白湯治療冠心病的關(guān)鍵成分。前列腺素E1（Other8）屬于血管活性藥物，可以抑制血小板活化，改善紅細(xì)胞變形能力[11]；同時(shí)可以抑制血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流，使血管平滑肌舒張[12]；此外臨床研究表明前列腺素E1能抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成[13]。黃酮類成分在瓜蔞薤白半夏湯治療冠心病中起到了較為重要的作用，芹菜素、木犀草素是2種天然的類黃酮化合物。有研究發(fā)現(xiàn)[14]，芹菜素通過抑制NF-κB信號通路，顯著降低NF-κB、COX-2、TNF-α的水平，提高IL-10的水平，發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的效果。木犀草素具有抗動脈粥樣硬化[15]、維持Ca2+的平衡[16]、心肌細(xì)胞保護(hù)[17]等作用。由此可知PTGS2、TNF、MMP9、EGFR、CASP3、AR、ACE、ESR2、MMP2、F2可能為瓜蔞薤白湯治療冠心病的主要靶點(diǎn)。PTGS2也被稱為環(huán)氧化酶2（cyclooxygenase-2，COX-2），可以引起前列腺素（prostaglandin E1，PGE1）、PEG2和PGI2等含量升高，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)COX-2抑制藥可減輕炎癥，舒張血管平滑肌[18]。TNF能誘導(dǎo)白細(xì)胞介素- 6（interleukin 6，IL-6）的產(chǎn)生，導(dǎo)致血管內(nèi)粥樣硬化斑塊的形成[19]。有研究發(fā)現(xiàn)[20-21]，冠心病患者的平滑肌細(xì)胞中MMP2和MMP9的表達(dá)顯著增加，提示MMP2/MMP9在冠心病的發(fā)病過程中起著重要的作用。

圖10 靶蛋白-活性成分分子對模式圖

綜上所述，瓜蔞薤白湯中芹菜素、木樨草素、酒渣堿、亞油酸等核心功效成分作用于PTGS2、TNF、MMP9等靶點(diǎn)，通過脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、癌癥的途徑、腫瘤壞死因子信號通路、NF?κB信號通路、MAPK等信號通路發(fā)揮治療冠心病的功效。該研究體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，可為臨床上的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Explore potential pharmacodynamic substances basis and mechanism of Gualouxiebai Decoction in treatment of coronary heart disease based on UHPLC-Q-Orbitrap HRMS and bioinformatics

SUN Zhi1, 2, ZHANG Yuan-yuan1, 2, ZHOU Sheng-nan1, 2, LIU Li-wei1, 2, BAO Xiao-yue1, 2, CHENG Wen-bo3, LI Xiao-qiang3, WANG Jing1, 2, ZUO Li-hua1, 2

1. Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China 2. Henan Engineering Research Center of Clinical Mass Spectrometry for Precision Medicine, Zhengzhou 450052, China 3. Suzhou Institute of Biomedical Engineering Technology, Chinese Academy of Sciences, Suzhou 215163, China

To systematically analyze and identify chemical constituents of Gualouxiebai Decoction, and predict the pharmacological basis and mechanism of its prevention and treatment of coronary heart disease.Gualouxiebai Decoction and drug-containing serum were analyzed by UHPLC-Q-Orbitrap HRMS, and the identification ofandcomponents were carried out with retention time, precise molecular weight, fragment ions and neutral loss. Bioinformatics methods were used to enrich the GO and KEGG pathways of potential targets. The network diagram of "active component-key target-pathway" of Gualouxiebai Decoction was constructed with Cytoscape 3.7.2 to predict potential active ingredients and pathways. AutoDock Tools 1.5.6 was used to verify the molecular docking between active ingredients and core targets.A total of 68 chemical components were identified, and 23 components were detected in serum samples of rats after gaved Gualouxiebai Decoction. Among them, apigin, luteolin, leae alkaloid, linoleic acid and other compounds are the key components of Gualouxiebai Decoction in the treatment of coronary heart disease, and PTGS2, TNF, MMP9, EGFR, CASP3 are the main targets. It involves the pathways of lipid and atherosclerosis, pathways in cancer, TNF signaling pathway, NF-κB signaling pathway and MAPK signaling pathway.This study preliminarily identified the potential effective components of Gualouxiebai Decoction in the prevention and treatment of coronary heart disease, and predicted the target of action, providing a reference for the further study of the pharmacodynamic substance basis and action mechanism of this prescription.

Gualouxiebai Decoction; UHPLC-Q-Orbitrap HRMS; absorbed components in the blood; bioinformatics; molecular docking;apigin; luteolin; leae alkaloid

R284.1

A

0253 - 2670(2022)18 - 5613 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.18.004

2022-05-11

河南省重點(diǎn)研發(fā)與推廣專項(xiàng)（科技攻關(guān)）（202102310187）；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目（2021YFC2401105）；河南省中青年衛(wèi)生健康科技創(chuàng)新優(yōu)秀青年人才培養(yǎng)項(xiàng)目（YXKC2020058）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82003921）

孫 志，博士，研究方向?yàn)橹兴幩幬锎x。Tel: (0371)66862570 E-mail: sunzhi2013@163.com

[責(zé)任編輯 王文倩]