基于GEO數(shù)據(jù)庫對兒童急性淋巴細胞白血病差異基因的篩選和生物信息學分析

虞莉莎，張盈盈

（浙江大學醫(yī)學院附屬金華醫(yī)院 金華市中心醫(yī)院檢驗科，浙江 金華 321000）

急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）是一種源于骨髓和淋巴細胞前體細胞的惡性克隆性疾病，是兒童最常見的惡性腫瘤之一。ALL的發(fā)病機制目前仍不完全清楚，遺傳缺陷是ALL發(fā)病的重要原因，包括與細胞周期的進程調(diào)控相關(guān)的基因突變、染色體易位和數(shù)目改變等[1]。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，雖然ALL患兒的5年生存率已達90%[2]，但是仍然存在容易復發(fā)和嚴重的藥物毒性反應等問題[3-5]。因此，尋找新的生物標志物對ALL的早期診斷，改善ALL患兒治療效果至關(guān)重要。

生物信息學是使用生物算法和計算機軟件對生物信息進行儲存、檢索和分析的一門新興學科，其研究重點主要為基因組學和蛋白質(zhì)組學2個方面?；蛐酒怯纱罅緿NA或寡核苷酸探針密集排列所形成的探針陣列，基本原理是通過雜交來捕捉信息。在腫瘤研究領(lǐng)域，通過生物信息學方法和基因芯片技術(shù)系統(tǒng)分析腫瘤相關(guān)基因及其調(diào)控機制是當前功能基因組學的一個重要研究方法[6]。越來越多的學者通過這一方法來分析各種腫瘤的差異表達基因，并研究這些基因在分子功能、細胞組成以及生物過程中所發(fā)揮的作用[7-8]。然而，單一芯片分析的假陽性率較高，因此，本研究從美國國立生物技術(shù)信息中心平臺基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（the Gene Expression Omnibus，GEO）下載多個芯片微陣列數(shù)據(jù)集，從而獲取更可靠的健康兒童與ALL患兒之間的差異表達基因，進一步尋找可用于ALL早期診斷的生物標志物。

1 材料和方法

1.1 研究對象

通過GEO數(shù)據(jù)庫檢索含有新診斷ALL患兒和健康兒童樣本的基因芯片，包括GSE67684、GSE71935、GSE116486、GSE26713、GSE41831、GSE8650和GSE9006（表1）。利用R語言Affy數(shù)據(jù)包對數(shù)據(jù)進行表達值背景矯正和表達譜數(shù)據(jù)歸一化預處理，包括原始數(shù)據(jù)格式的轉(zhuǎn)換，缺失值補充，用分位數(shù)法進行數(shù)據(jù)標準化。

表1 新診斷ALL患兒和健康兒童基因芯片基本信息

1.2 差異表達基因篩選

采用R語言Limma數(shù)據(jù)包篩選新診斷ALL患兒和健康兒童差異表達基因，篩選標準為P＜0.05且|log2FC|≥2，并將探針名稱按照制造商提供的批注文件與基因名稱進行匹配，如果1個探針組對應多個基因，選擇保留第1個，刪除其他的冗余信息；如果多個探針對應1個基因，計算每個探針在各樣本中的平均值，取平均值最大的探針。繪制差異表達基因火山圖。利用網(wǎng)上工具VENNY2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）篩選出共同差異表達基因，并用韋恩圖進行展示。

1.3 基因功能富集和注釋

基于篩選出的共同差異表達基因，通過DAVID在線軟件（https：//david.ncifcrf.gov），依據(jù)基因本體（Gene Ontology，GO）數(shù)據(jù)庫對共同差異表達基因進行生物學功能注釋；依據(jù)京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路數(shù)據(jù)庫進行共同差異表達基因信號通路的富集。

1.4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡構(gòu)建

利用STRING 11（https：//string-db.org/）構(gòu)建共同差異表達基因編碼蛋白的互作網(wǎng)絡，并用Cytoscape軟件進行可視化分析，并用Cytoscape軟件中的CytoHubba插件篩選出其中的關(guān)鍵基因（hub gene）。

2 結(jié)果

2.1 差異表達基因篩選結(jié)果

通過GPL570平臺共篩選出741個差異表達基因，包括303個上調(diào)基因和438個下調(diào)基因（圖1）；通過GPL96平臺篩選出352個差異表達基因，包括146個上調(diào)基因和206個下調(diào)基因（圖2）。2個平臺有交集的差異表達基因共245個（28.9%），包括88個上調(diào)基因和157個下調(diào)基因。

圖1 GPL570平臺ALL患兒與健康兒童差異表達基因火山圖

圖2 GPL96平臺ALL患兒與健康兒童差異表達基因火山圖

2.2 差異表達基因功能富集及通路分析

對篩選出的245個共同差異表達基因進行GO和KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示，245個基因主要集中在免疫反應（生物學過程，圖3），參與蛋白質(zhì)結(jié)合（分子功能，圖4），整合于細胞外空間（細胞組成，圖5），富集在造血細胞譜系和細胞周期等信號通路（KEGG通路分析，圖6）。

圖3 ALL患兒與健康兒童差異表達基因GO富集（生物學過程）

圖4 ALL患兒與健康兒童差異表達基因GO富集（分子功能）

圖5 ALL患兒與健康兒童差異表達基因GO富集（細胞組成）

圖6 ALL患兒與健康兒童差異表達基因KEGG通路分析結(jié)果

2.3 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡的構(gòu)建和關(guān)鍵基因的篩選

去除游離的蛋白后，共得到由2 0 0個節(jié)點（靶點蛋白）和1 514條邊（蛋白質(zhì)互作）構(gòu)成的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡（圖7），再進一步篩選出蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡中的10個關(guān)鍵基因（hub genes），皆為上調(diào)基因，分別為CDK1、TOP2A、TYMS、MCM2、MCM4、TTK、CCNB2、BUB1B、KIF4A和MAD2L1（圖8）。

圖7 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡關(guān)鍵基因簇分析

圖8 關(guān)鍵基因

3 討論

本研究從GEO數(shù)據(jù)庫中選取新診斷ALL患兒的基因表達芯片，通過生物信息學分析篩選ALL患兒與健康兒童差異表達基因，進一步對這些差異表達基因進行功能注釋和KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示，差異表達基因主要集中在免疫反應（生物學過程），整合在細胞外空間（細胞組成），參與蛋白質(zhì)結(jié)合（分子功能），富集在造血細胞譜系、細胞周期等信號通路（KEGG通路分析）。免疫系統(tǒng)是機體監(jiān)視和抵御內(nèi)在和外來抗原入侵的防御系統(tǒng)，任何原因?qū)е碌拿庖叻磻軗p均可使機體對抗原的監(jiān)控不力，從而出現(xiàn)一系列病理性變化，甚至發(fā)生惡性增殖。血液系統(tǒng)腫瘤患者均存在嚴重的免疫功能紊亂。細胞周期調(diào)控機制被破壞導致的細胞生長失控、分化受阻和凋亡異常存在于幾乎所有腫瘤細胞。有研究發(fā)現(xiàn)，ALL發(fā)病機制與細胞周期進程調(diào)控相關(guān)的基因突變、染色體易位及數(shù)目改變等有關(guān)[1]。這些結(jié)果與ALL息息相關(guān)，提示本研究所篩選的差異表達基因參與了兒童ALL發(fā)生、發(fā)展的過程。

本研究通過STRING11對ALL患兒與健康兒童差異表達基因進行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡分析，發(fā)現(xiàn)位于中心的關(guān)鍵基因分別為CDK1、TOP2A、TYMS、MCM2、MCM4、TTK、CCNB2、BUBIB、KIF4A和MAD2L1，其中CDK1、MCM2、MCM4、TTK、CCNB2、BUBIB和MAD2L1，皆富集在細胞周期通路上。CDK1是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族中的一員，負責控制細胞周期從G1期到S期和從G2期到M期的過渡[9]，在多種惡性腫瘤中均可發(fā)現(xiàn)CDK1的失調(diào)[10]。蔣光潔等[11]發(fā)現(xiàn)，在T-ALL中CDK1表達上調(diào)。MCM2和MCM4是MCM蛋白家族成員，在DNA復制起始階段表現(xiàn)出解旋酶活性，并參與細胞周期的控制[12]。高表達的MCM2可作為診斷乳腺癌、結(jié)直腸癌、肛門腫瘤等疾病的前瞻性生物標志物。有研究發(fā)現(xiàn)，MCM2的高表達可致ALL復發(fā)[13]。MCM4的異常表達是多種惡性腫瘤的預后指標[14-16]。BUB1B是紡錘體組裝檢查點（spindle assembly checkpoint，SAC）蛋白家族的成員，在有絲分裂期間確保染色體適當分離[17]，BUB1B的異常表達通常會導致非整倍體和染色體不穩(wěn)定，導致癌癥發(fā)病率的增加。有研究發(fā)現(xiàn)，BUB1B的過表達與膀胱癌、肝細胞癌以及其他一些癌癥的進展和復發(fā)有關(guān)[18-20]。TTK是絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸雙特異性蛋白激酶，對有絲分裂檢查點和染色體附著的調(diào)控至關(guān)重要，因此TTK水平的升高可導致中心體增大和染色體不穩(wěn)定，從而引起腫瘤的發(fā)生[21-23]。高水平的TTK對未分化甲狀腺癌、三陰乳腺癌和肺癌具有診斷價值[24-26]。CCNB2是細胞周期蛋白家族的一員，可與CCNB1和CDK1形成復合物，調(diào)控哺乳動物細胞周期的G2/M期，在有絲分裂的啟動中發(fā)揮重要作用[27]。有研究結(jié)果顯示，CCNB2在肺癌、結(jié)直腸腺癌和卵巢癌等多種人類癌癥中過表達[28-30]。MAD2L1是一個紡錘體檢查點的組成部分，主要確保細胞分裂中期染色體的正確分離，其調(diào)控異?？蓪е氯旧w不穩(wěn)定和非整倍體形成，乳腺癌、肺癌、肝癌等多種癌癥中MAD2L1過表達[31-33]。

本研究篩選出的10個關(guān)鍵基因中，有3個沒有富集在某一通路上，但既往研究結(jié)果顯示其在多種腫瘤中異常表達。TOP2A是TOP2家族中的一員，在有絲分裂過程中對DNA復制、染色體凝聚等發(fā)揮重要作用，并在轉(zhuǎn)錄起始時發(fā)揮重要作用，其表達與多種癌癥有關(guān)[34]。TYMS基因編碼參與DNA復制和修復的胸苷酸合成酶[35]。高水平的TYMS已在乳腺癌、非小細胞肺癌和前列腺癌等多種癌癥中被報道[36-38]。KIF4A是驅(qū)動蛋白超家族中的一員，參與有絲分裂過程中紡錘體的形成和變化、染色體的濃度和排列以及胞質(zhì)的分裂[39]。有研究發(fā)現(xiàn)，KIF4A參與了DNA損傷修復，其異常表達可能影響同源重組酶RadS1及其調(diào)控因子BRCA2的表達，導致受損DNA修復失敗[40-41]。DNA損傷可導致細胞異常增殖和分化，最終促進腫瘤的形成；KIF4A在肝癌、肺癌等許多癌癥中過表達[42-43]。

本研究篩選出的10 個關(guān)鍵基因雖然在其他疾病中有相關(guān)研究，但在ALL發(fā)生、發(fā)展中所發(fā)揮的作用，尚未見報道，本研究的成果一定程度上能為兒童ALL發(fā)生、發(fā)展研究提供新的思路。

綜上所述，本研究采用生物信息學方法分析已有的ALL基因芯片數(shù)據(jù)，篩選出潛在的ALL中表達顯著的基因，通過建立蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡，篩選出10個關(guān)鍵基因，可能成為ALL輔助診斷的新的標志物。但本研究僅涉及生物信息學分析，篩選出的關(guān)鍵基因與ALL的相關(guān)性及相關(guān)發(fā)病機制仍需在臨床樣本中進行驗證。