賈怡文，陳小威，孫尚德，畢艷蘭，崔勝成

(1.河南工業(yè)大學 糧油食品學院，鄭州 450001； 2.新疆泰昆集團股份有限公司，新疆 昌吉 831100)

我國飼料資源尤其蛋白飼料資源短缺，棉籽作為大豆以外的第二大優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源，對其開發(fā)利用具有重要意義。然而，棉籽及其餅(粕)在飼料上的利用率卻不到30%，最主要的原因在于棉籽餅(粕)中存在棉酚、環(huán)丙烯脂肪酸(Cyclopropene fatty acids，CPFAs)抗營養(yǎng)因子，致使棉籽餅(粕)在飼料行業(yè)中利用受限[1-3]。環(huán)丙烯脂肪酸是棉酚之外影響棉籽及其餅(粕)利用的第二大抗營養(yǎng)因子，影響雞、魚及一些單胃動物的代謝[4-6]。棉籽中含有蘋婆酸和錦葵酸兩種CPFAs，其中蘋婆酸毒性較大，會誘導蛋白質(zhì)變性，影響糖代謝，導致母雞產(chǎn)蛋率下降以及牛肉肉質(zhì)硬化等[7-9]。

棉籽及其餅(粕)中 CPFAs測定分析對其在飼料中的應用和脫除研究具有重要意義。相較于傳統(tǒng)Halphen實驗的定性分析，利用色譜技術進行量化分析CPFAs可指導飼料配方中的添加量。通過苯甲酰衍生化處理后利用雙柱反相高效液相色譜對棉籽油中的CPFAs進行分離，再結(jié)合外標法可實現(xiàn)定量分析，但存在步驟煩瑣、成本高等缺陷[10]。王美霞等[11]通過全自動索氏浸提裝置提取棉籽油，采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術將棉籽油中脂肪酸成功分離，并證實肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、錦葵酸、亞油酸、蘋婆酸、二氫蘋婆酸和花生酸是棉籽油的特征脂肪酸，但CPFAs與普通脂肪酸的分離效果不佳。目前脂肪酸含量測定的國標方法有GB/T 21514—2008《飼料中脂肪酸含量的測定》和GB 5009.168—2016《食品安全國標標準 食品中脂肪酸的測定》，二者均采用氣相色譜法，但棉籽油脂肪酸的多樣性和CPFAs分子中環(huán)丙烯結(jié)構的敏感性使其與普通直鏈脂肪酸的分析檢測在脂肪酸衍生化、色譜柱選擇和色譜分離條件等方面存在顯著差異[12-14]，從而造成國標方法均難以實現(xiàn)CPFAs的有效分離[15]。這影響了棉籽及其餅(粕)中CPFAs的量化分析，進而限制了為飼料配方中的應用提供直接信息。

基于此，本研究利用氣相色譜法量化分析棉籽及其餅(粕)中CPFAs的含量，考察了不同脂肪酸衍生化方法、氣相色譜條件，建立具有較好分離度的色譜操作條件，并進一步建立CPFAs的外標定量測定方法，實現(xiàn)對棉籽及其餅(粕)中CPFAs的準確量化分析，為棉籽及其餅(粕)在飼料中的應用提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

棉籽、棉籽餅和棉籽粕，新疆泰昆集團股份有限公司提供。蘋婆酸甲酯 (C20H36O2，純度≥98%)、錦葵酸甲酯(C19H34O2，純度≥95%)標準品，美國Matreya脂質(zhì)與生物化學科技有限公司；37種脂肪酸甲酯標準品,美國Sigma公司。

Agilent 7890B氣相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；RV 10 control auto V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國IKA科技有限公司；賽多利斯SQP電子天平；FS-100小型粉碎機，鶴壁市英泰電子電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 棉籽及其餅(粕)中油脂的提取

通過油脂提取方法的篩選，確定采用GB/T 6433—2006中的方法對棉籽及其餅(粕)中油脂進行提取。

1.2.2 棉籽油脂肪酸衍生化

(1)堿式甲酯化：準確稱取棉籽油0.1 g，用正己烷定容于10 mL容量瓶內(nèi)；用移液管準確移取3 mL樣液于小瓶中，加入2 mL氫氧化鈉-甲醇溶液，劇烈混勻7 min，靜置待分層后，將上清液移至試管中，加入約1 g無水硫酸鈉，取上清液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，所得濾液即為試樣的待測液。

(2)簡易堿式甲酯化：準確稱取0.1 g棉籽油置于10 mL容量瓶內(nèi)，用色譜級正己烷定容；用移液管準確移取3 mL樣液于小瓶中，加入2 mL甲醇鈉，劇烈混勻7 min，放置約1 min，混合溶液出現(xiàn)分層，將上清液移至試管中，加入約1 g無水硫酸鈉，取上清液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，所得濾液為試樣的待測液。

(3)三氟化硼甲酯化：準確稱取0.1 g棉籽油置于10 mL容量瓶內(nèi)，用色譜級正己烷定容；用移液管準確移取3 mL樣液于25 mL燒瓶中，加入沸石，用移液管移取7 mL甲醇溶液于燒瓶中。連接回流裝置，回流過程中不斷攪動燒瓶，煮沸并計時7 min，至溶液變透明。從冷凝管上端用移液管加入7 mL三氟化硼-甲醇溶液，繼續(xù)回流1 min，再加入2.4 mL正己烷回流1 min，最后撤掉熱源，取出燒瓶，加入氯化鈉飽和溶液至燒瓶的頸部，靜置分層30 min，將上清液移至試管內(nèi)，加入約1 g無水硫酸鈉，取上清液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，所得濾液為試樣的待測液。

(4)硫酸催化甲酯化：準確稱取0.1 g棉籽油置于10 mL容量瓶內(nèi)，用色譜級正己烷定容；用移液管準確移取3 mL樣液于20 mL具塞試管中，加入2 mL 1%硫酸-甲醇溶液混勻，置于70℃水浴加熱60 min，冷卻后加入飽和氯化鈉溶液至溶液分層，將上清液放至試管內(nèi)，加入約1 g無水硫酸氫鈉，取上清液經(jīng) 0.45 μm濾膜過濾，所得濾液為試樣的待測液。

1.2.3 環(huán)丙烯脂肪酸含量的測定

1.2.3.1 標準曲線建立

準確稱取蘋婆酸甲酯25 mg和錦葵酸甲酯5 mg于10 mL容量瓶中，用色譜級正己烷溶解并定容，搖勻，得到質(zhì)量濃度分別為2.5 mg/mL和0.5 mg/mL標準儲備溶液，于-18℃下保存?zhèn)溆?。臨用前分別取標準儲備溶液稀釋成系列標準溶液進行氣相色譜(GC)分析，建立標準曲線。

1.2.3.2 GC分析條件

配有氫火焰離子化檢測器的氣相色譜儀，進樣口與檢測器溫度均為280℃，載氣為高純氮氣(99.999%)，分流比為1∶20；初始柱溫為100℃, 以一定的速率升至220℃；進樣量為1 μL。

1.2.3.3 定量分析

相對含量測定：采用峰面積歸一化法，根據(jù)錦葵酸或蘋婆酸甲酯相應峰面積對所有脂肪酸甲酯峰面積總和的占比來計算錦葵酸和蘋婆酸的含量。

絕對含量測定：采用外標法，通過錦葵酸或蘋婆酸甲酯標準品的標準曲線方程，分別將其峰面積代入方程，并根據(jù)甲酯與相應脂肪酸的換算系數(shù)計算脂肪酸絕對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣相色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

鑒于色譜柱對脂肪酸分離效果的影響，固定升溫速率(2.0 ℃/min)和氮氣流速(0.6 mL/min)下，考察了常見的3種色譜柱SGE BPX-70色譜柱(30.0 m×250 μm×0.25 μm)、HP-88色譜柱(0.25 mm×0.25 μm×100 m)、DB-1ht毛細管柱(28.0 m×250 μm× 0.1 μm)對棉籽油脂肪酸(衍生化方法采用1.2.2中簡易堿式甲酯化)的分離效果，如圖1所示。

圖1 不同色譜柱對棉籽油脂肪酸的分離效果

由圖1a可以看出，以中等極性填料的SGE BPX-70色譜柱分離時，脂肪酸沒有得到很好的分離。HP-88色譜柱是填料為氰丙基芳基聚硅氧烷的毛細管柱，具有強極性。由圖1b可知，雖然HP-88色譜柱柱長有100 m，但是棉籽油脂肪酸在60 min內(nèi)仍未得到有效分離，12 min時出現(xiàn)溶劑峰，57 min時出現(xiàn)棕櫚酸峰，不利于脂肪酸的檢測。DB-1ht毛細管柱為非極性高溫柱，耐受溫度達400℃。從圖1c可知，DB-1ht 毛細管柱對棉籽油脂肪酸具有良好的分離效果。

綜上，選取DB-1ht非極性毛細管柱作為環(huán)丙烯脂肪酸的分離柱。

在采用標準品確認錦葵酸(MLV)和蘋婆酸(STC)出峰位置的基礎上，利用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術對環(huán)丙烯脂肪酸進行進一步實證。GC-MS條件：DB-SMS毛細管色譜柱(60 m×0.32 mm×1 μm)，離子源溫度230℃，EI源離子化方式，四極桿溫度150℃，全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍 (m/z)40～500，溶劑延遲時間3 min。結(jié)果見圖2。

圖2 棉籽油中錦葵酸、蘋婆酸和二氫蘋婆酸的GC-MS離子峰譜圖

從圖2可知，錦葵酸(圖2a)和蘋婆酸(圖2b)及另一種環(huán)丙烷脂肪酸，即二氫蘋婆酸(圖2c)[16]被證實存在于棉籽中。

2.1.2 程序升溫速率對分離效率的影響

采用DB-1ht非極性毛細管柱作為分離柱，在0.6 mL/min氮氣流速下考察了程序升溫速率對棉籽油脂肪酸分離的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 程序升溫速率對棉籽油脂肪酸中錦葵酸(MLV)和蘋婆酸(STC)分離效果的影響

從圖3a可知，在3.0℃/min升溫速率下45 min內(nèi)完整分離出全部脂肪酸，錦葵酸和蘋婆酸分別出現(xiàn)在31.0 min和33.8 min，但油酸和亞油酸沒能被很好地分離。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是升溫速率太快，不利于脂肪酸的分離。從圖3b可知，在 2.0 ℃/min升溫速率下，在60 min內(nèi)脂肪酸可以被很好地分離，錦葵酸和蘋婆酸分別出現(xiàn)在41.6 min和45.8 min。蘋婆酸和錦葵酸的出峰時間相差大，同時其他脂肪酸也得到良好的分離，有利于進行定量分析。從圖3c可知，1.5 ℃/min升溫速率下，在60 min內(nèi)并未呈現(xiàn)出完整的分離峰，錦葵酸峰出現(xiàn)在51.2 min，而60 min內(nèi)并未出現(xiàn)蘋婆酸的峰。綜上所述，選擇最佳升溫速度為2.0 ℃/min。

2.1.3 氮氣流速對分離效率的影響

采用DB-1ht非極性毛細管柱作為分離柱，在恒定升溫速度2.0℃/min下考察了氮氣流速對棉籽油脂肪酸的分離效果，結(jié)果如圖4所示。

圖4 氮氣流速對棉籽油脂肪酸中錦葵酸(MLV)和蘋婆酸(STC)分離效果的影響

從圖4可知：當?shù)獨饬魉贋?.0 mL/min時，錦葵酸和蘋婆酸的出峰時間分別為37.4 min和41.6 min；當?shù)獨饬魉贋?.6 mL/min時，錦葵酸和蘋婆酸色譜峰分別出現(xiàn)在41.6 min和45.8 min；而在氮氣流速為0.4 mL/min時，在45.5 min和49.7 min分別出現(xiàn)錦葵酸和蘋婆酸?？梢姡S著氮氣流速的降低，脂肪酸分離圖中錦葵酸和蘋婆酸色譜峰的出現(xiàn)時間向右移動。為了實現(xiàn)在適當時間內(nèi)得到較好的脂肪酸分離效果，氮氣流速選擇0.6 mL/min。

2.2 衍生化方法對環(huán)丙烯脂肪酸分析的影響

為了準確測定環(huán)丙烯脂肪酸的含量，在優(yōu)化的色譜條件基礎上對4種衍生化方法(堿式甲酯化、簡易堿式甲酯化、三氟化硼甲酯化、硫酸催化甲酯化)進行了系統(tǒng)比較。相同質(zhì)量的棉籽油經(jīng)過不同衍生化后所得的GC圖譜如圖5所示。

圖5 4種不同甲酯化條件下的棉籽油脂肪酸GC圖譜

從圖5可知，在堿式甲酯化、簡易堿式甲酯化和三氟化硼甲酯化后的GC圖譜中均觀察到錦葵酸和蘋婆酸。然而，硫酸催化甲酯化后的GC圖譜中沒有觀察到錦葵酸和蘋婆酸的峰，且其他脂肪酸的峰值也較低。

不同衍生化方法對錦葵酸和蘋婆酸的出峰面積和相對含量的影響如表1所示。從表1可知：堿式甲酯化所得的錦葵酸峰面積為76.69，脂肪酸相對含量為0.75%，蘋婆酸峰面積為40.51，相對含量為0.39%；簡易堿式甲酯化后的錦葵酸峰面積為43.75，相對含量為0.72%，蘋婆酸峰面積為21.87，相對含量為0.36%；三氟化硼甲酯化所得的錦葵酸峰面積為34.07，相對含量為0.68%，蘋婆酸峰面積為17.08，相對含量為 0.34%。4種處理方法得到的錦葵酸和蘋婆酸峰面積大小均為堿式甲酯化>簡易堿式甲酯化>三氟化硼甲酯化>硫酸催化甲酯化，可知堿式甲酯化的衍生化效果最好，這與文獻[10，17-18]報道一致。因此，選擇堿式甲酯化方法進行衍生化。

表1 不同衍生化方法對棉籽油中錦葵酸和蘋婆酸峰面積及相對含量的影響

通過對棉籽油進行堿式甲酯化后的色譜分析并結(jié)合GC-MS分析棉籽油主要脂肪酸組成及含量，結(jié)果如表2所示。

表2 棉籽油脂肪酸組成及相對含量

由表2可知，棉籽油共檢出13種脂肪酸，以亞油酸(55.446%)、棕櫚酸(22.476%)、油酸(15.229%)和硬脂酸(2.084%)為主，還含有順式異油酸(0.824%)、肉豆蔻酸(0.691%)、棕櫚油酸(0.506%)、十七烯酸(0.074%)、十七酸(0.088%)、花生酸(0.270%)、錦葵酸(0.720%)、蘋婆酸(0.370%)和二氫蘋婆酸(0.308%)。

2.3 GC測定環(huán)丙烯脂肪酸的方法學評價

2.3.1 重復性評價

在優(yōu)化的色譜條件下，按1.2.3方法利用標準品建立錦葵酸甲酯(Y=1.646X-1.063，R2= 0.997，線性范圍1～250 μg/mL)和蘋婆酸甲酯(Y=1.333X-2.499，R2= 0.998，線性范圍5～1 250 μg/mL)的線性回歸方程。利用線性回歸方程對棉籽中的CPFAs含量進行了分析。表3為GC測定棉籽中CPFAs的重復性評價分析結(jié)果，重復過程包括棉籽油的提取、衍生化和GC分析得到兩種CPFAs的含量。從表3可知:提油率平均值為28.19%，RSD為2.63%(<5%)，重復性良好；外標法測定的錦葵酸和蘋婆酸平均含量以及RSD分別為2.73 mg/g、1.32%(< 5%)和1.07 mg/g、2.13%(<5%)。由此可知，衍生化和GC分析過程也具有良好重復性。綜上可知，所建立的GC測定CPFAs含量的方法重復性良好。

表3 GC測定棉籽中CPFAs的重復性評價分析結(jié)果

2.3.2 回收率評價

為考察GC對CPFAs的準確性，對建立方法的回收率進行了評價，結(jié)果如表4所示。從表4可知：錦葵酸的回收率在84.737%～108.037%之間，平均值為96.965%，RSD為10.865%；蘋婆酸的回收率在84.388%～113.291%之間，平均值為97.447%，RSD為13.876%。說明此方法準確可靠。

表4 CG測定棉籽油中的CPFAs回收率實驗結(jié)果

2.4 棉籽及其餅(粕)中的環(huán)丙烯脂肪酸含量

利用建立的環(huán)丙烯脂肪酸GC測定法分析了棉籽、棉籽餅和棉籽粕中錦葵酸和蘋婆酸的含量，結(jié)果如表5所示。

表5 氣相色譜測定棉籽及其餅(粕)中環(huán)丙烯脂肪酸含量

由表5可知：棉籽中錦葵酸和蘋婆酸的含量分別為2.62 mg/g和1.02 mg/g；棉籽餅和棉籽粕中的錦葵酸含量分別為0.68 mg/g和0.09 mg/g，蘋婆酸含量分別為0.27 mg/g和0.04 mg/g。

3 結(jié) 論

本文主要研究了棉籽及其餅(粕)中環(huán)丙烯脂肪酸含量的測定方法。通過探究堿式、簡易堿式、硫酸催化甲酯化和三氟化硼甲酯化等4種衍生化方法，證實堿式甲酯化具有最佳效果；通過優(yōu)化氣相色譜條件得到最優(yōu)條件為采用DB-1ht毛細管柱，氮氣流速為 0.6 mL/min,升溫程序為從100℃以2℃/min的速率上升到220℃，結(jié)合外標法定量。該方法的重復性和回收率良好。采用建立的方法測得棉籽、棉籽餅和棉籽粕中的錦葵酸含量分別為2.62、0.68 mg/g 和0.09 mg/g，蘋婆酸含量分別為1.02、0.27 mg/g 和0.04 mg/g。該方法為棉籽及其餅(粕)中環(huán)丙烯脂肪酸量化測定提供了技術依據(jù)和指導，有利于為其在飼料工業(yè)中配方添加提供直接信息以及為環(huán)丙烯脂肪酸脫除提供技術支撐。