磷脂酶Lecitase Ultra和磷脂酶C復(fù)合對冷榨菜籽油脫膠的影響

馬云睿，周 力，高 盼,2，胡傳榮,2，羅 質(zhì),2，何東平,2

(1.武漢輕工大學(xué) 食品學(xué)院，武漢430000; 2.大宗糧油精深加工教育部重點實驗室，武漢 430023)

菜籽油是我國主要食用植物油之一，每年產(chǎn)量約520 萬t，占國產(chǎn)植物油總量的 47%[1]。冷榨制油是指在低于85℃的溫度下借助機械外力將未經(jīng)過炒制的油料中的油脂擠壓出來，此方法可以有效保留油脂中的特殊風(fēng)味與營養(yǎng)物質(zhì)[2-5]。但油菜籽在經(jīng)過冷榨后獲得的菜籽原油，含有磷脂、糖、蛋白質(zhì)等膠質(zhì)混合物，且主要是磷脂[6-10]。油脂中的磷脂含量高時，加熱后會產(chǎn)生絮狀沉淀物，并使油色變深，因此須進(jìn)行脫膠處理以除去磷脂[11-12]。常用的水化脫膠和酸法脫膠一般只能去除油脂中的水化磷脂[13]，并且容易造成中性油乳化，增加油耗和皂腳量；而酶法脫膠具有操作條件溫和、能耗低、基本無污染的優(yōu)點。磷脂酶Lecitase Ultra(A1)與磷脂酶C作為目前應(yīng)用較為廣泛的兩種脫膠酶，對于其單一應(yīng)用于油脂脫膠已有較多研究，如單一使用磷脂酶Lecitase Ultra，對蘋果籽油(3 h,磷含量降至7.8 mg/kg)[14]、葵花籽油(3 h，磷含量降至3.02 mg/kg)[15]、大豆油(6.3 h，磷含量降至10.38 mg/kg)[16]等進(jìn)行脫膠，雖然大多數(shù)研究可將磷含量降至較低的水平，脫膠效果顯著，但一般需要超過3 h的酶解時間，降低了工業(yè)化生產(chǎn)的效率；也有單一使用磷脂酶C對菜籽油[17]、葵花籽油[18]等進(jìn)行脫膠的研究，在最優(yōu)條件下分別在90 min和3 h內(nèi)將磷含量降至7.85、8.2 mg/kg，脫膠效果較好，有研究者使用從地衣芽孢桿菌MTCC 7445提取的新型磷脂酶C對高品質(zhì)植物油在40℃、5 h條件下進(jìn)行脫膠，可使磷含量降至4 mg/kg以下[19]，雖然磷含量降至較為理想的水平，但仍然存在酶解時間過長的問題。有研究者使用磷脂酶C和磷脂酶A1復(fù)合用于大豆原油的脫膠，在2 h內(nèi)將磷含量降至10 mg/kg[20]。目前，針對菜籽油的復(fù)合酶法脫膠條件的優(yōu)化鮮有報道。本文采用磷脂酶Lecitase Ultra與磷脂酶C復(fù)合對冷榨菜籽油進(jìn)行脫膠處理，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化得到冷榨菜籽油脫膠的工藝條件，以期為冷榨菜籽油的高效脫膠提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

冷榨菜籽原油，實驗室自制。磷脂酶C，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院；磷脂酶Lecitase Ultra， 丹麥諾維信公司；磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)、磷脂酰乙醇胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)、磷脂酰肌醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；乙腈、甲醇均為色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；超純水、雙蒸水，實驗室自制；檸檬酸、氫氧化鈉等均為分析純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；Milli-Q Integral超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌器，鞏義市英峪予華儀器廠；XHF-D高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司；SHA-CA數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，江蘇東鵬儀器制造有限公司；TD5A臺式離心機，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C型pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SZ-93自動雙重純水蒸餾器，上海亞榮生化儀器廠；AB204-E型電子分析天平，梅特勒-托利多有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州市國華電器有限公司；101-1-S型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 磷脂酶Lecitase Ultra和磷脂酶C酶活力測定

參照文獻(xiàn)[17]，采用NPPC法測定酶活力。

1.2.2 菜籽油的酶法脫膠

參考文獻(xiàn)[21]的方法，對冷榨菜籽原油進(jìn)行酶法脫膠，具體工藝流程：稱取100 g冷榨菜籽原油→水浴加熱至40℃→加50%檸檬酸溶液酸化→加NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至4.8→以500 r/min攪拌→滯留反應(yīng)3 min→加入磷脂酶Lecitase Ultra→加入蒸餾水→以10 000 r/min高速均質(zhì)→酶解反應(yīng)一定時間→水浴加熱至55℃→加NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至5.3→加入磷脂酶C→以10 000 r/min高速均質(zhì)→酶解反應(yīng)一定時間→于85℃水浴滅酶10 min→以4 000 r/min離心分離→取上層即為脫膠菜籽油。

1.2.3 磷脂含量測定

菜籽油中磷脂主要有磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰肌醇(PI)[22]，因此通過測定PC、PE、PI含量對菜籽油磷脂含量進(jìn)行定量分析。參考GB 5009.272—2016，采用反相高效液相色譜法測定菜籽油中PC、PE和PI含量。測定條件：Extend-C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；柱溫25℃；流動相為乙腈-甲醇(體積比6∶4)，流速1.0 mL/min；紫外檢測波長205 nm。

1.2.4 基本指標(biāo)的測定

酸值測定，參照GB 5009.229—2016；過氧化值測定，參照GB 5009.227—2016；水分及揮發(fā)物含量測定，參照GB 5009.236—2016；碘值測定，參照GB/T 5532—2008；皂化值測定，參照GB/T 5534—2008。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2019對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析，使用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，使用Design 8.0.6軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料指標(biāo)

經(jīng)測定,冷榨菜籽原油磷脂含量為693 mg/kg，磷脂酶C的酶活力為9 000 U/g，磷脂酶Lecitase Ultra的酶活力為10 000 U/g。

2.2 菜籽油酶法脫膠單因素試驗

2.2.1 反應(yīng)時間的確定

2.2.1.1 磷脂酶Lecitase Ultra反應(yīng)時間

在檸檬酸溶液添加量1.2 mL/kg、磷脂酶Lecitase Ultra添加量30 mg/kg、加水量30 mL/kg、不加磷脂酶C條件下，研究磷脂酶Lecitase Ultra反應(yīng)時間對冷榨菜籽油脫膠效果的影響，結(jié)果見圖1。

注：磷脂含量為PC、PE、PI三者總和。下同圖1 磷脂酶Lecitase Ultra反應(yīng)時間對冷榨菜籽油脫膠效果的影響

由圖1可知，隨著磷脂酶Lecitase Ultra反應(yīng)時間從30 min延長到90 min，磷脂含量由93.11 mg/kg降至27.47 mg/kg，可見在前90 min磷脂酶Lecitase Ultra的酶解反應(yīng)迅速，隨著磷脂酶Lecitase Ultra反應(yīng)時間的繼續(xù)延長，磷脂含量趨于穩(wěn)定。在工業(yè)生產(chǎn)中，脫膠時間對生產(chǎn)效率影響較大，故磷脂酶Lecitase Ultra脫膠時間初步定為90 min。

2.2.1.2 磷脂酶C反應(yīng)時間

在磷脂酶Lecitase Ultra反應(yīng)時間90 min，磷脂酶C添加量60 mg/kg，改變磷脂酶C的反應(yīng)時間，其他參數(shù)同2.2.1.1的條件下，研究磷脂酶C反應(yīng)時間對冷榨菜籽油脫膠效果的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 磷脂酶C反應(yīng)時間對冷榨菜籽油脫膠效果的影響

由圖2可知，將經(jīng)過磷脂酶Lecitase Ultra脫膠后的菜籽油用磷脂酶C進(jìn)行二次脫膠，磷脂含量進(jìn)一步降低，當(dāng)磷脂酶C反應(yīng)時間超過60 min后，磷脂含量趨于穩(wěn)定，故磷脂酶C反應(yīng)時間可以初步定為60 min。

2.2.2 加水量的確定

在磷脂酶C反應(yīng)時間60 min，改變加水量，其他參數(shù)同2.2.1.2的條件下，研究加水量對冷榨菜籽油脫膠效果的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 加水量對冷榨菜籽油脫膠效果的影響

由圖3可見：隨著加水量由10 mL/kg增加到30 mL/kg，磷脂含量由78.41 mg/kg降至3.50 mg/kg，這是因為油中膠體分散相的質(zhì)點粒度隨加水量的增多而增大[21]，有利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行；之后，隨著加水量的繼續(xù)增加，磷脂含量反而升高，這可能是因為加水量過多導(dǎo)致菜籽油乳化，不利于磷脂的脫除[6]。因此，加水量初步定為30 mL/kg。

2.2.3 檸檬酸溶液添加量的研究

在磷脂酶C反應(yīng)時間60 min，改變檸檬酸溶液添加量，其他參數(shù)同2.2.1.2的條件下，研究檸檬酸溶液添加量對冷榨菜籽油脫膠效果的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 檸檬酸溶液添加量對冷榨菜籽油脫膠效果的影響

由圖4可見：檸檬酸溶液添加量對磷脂含量的影響曲線與加水量的相似，檸檬酸溶液添加量由0.8 mL/kg增加到1.2 mL/kg時，磷脂含量由78.38 mg/kg降至4.59 mg/kg，這是因為檸檬酸溶液的添加可以一定程度上與菜籽油中的金屬離子螯合，使非水化磷脂轉(zhuǎn)化為水化磷脂[23-24]；之后，隨著檸檬酸溶液添加量的繼續(xù)增加，磷脂含量升高，這可能是因為檸檬酸的添加量過多改變了酶解環(huán)境的pH，超過了磷脂酶的最適pH，從而導(dǎo)致磷脂含量上升。因此，檸檬酸溶液添加量宜取1.2 mL/kg。

2.2.4 加酶量的確定

2.2.4.1 磷脂酶Lecitase Ultra添加量

在磷脂酶Lecitase Ultra反應(yīng)時間90 min，改變磷脂酶Lecitase Ultra添加量，其他參數(shù)同2.2.1.1的條件下，研究磷脂酶Lecitase Ultra添加量對冷榨菜籽油脫膠效果的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 磷脂酶Lecitase Ultra添加量對冷榨菜籽油脫膠效果的影響

由圖5可見，隨著磷脂酶Lecitase Ultra添加量的增加，磷脂含量逐漸降低，在添加量達(dá)到30 mg/kg時，下降趨勢趨于平緩，這主要是因為隨著磷脂酶Lecitase Ultra添加量的增多，酶解反應(yīng)逐漸完全。從經(jīng)濟(jì)方面考慮，磷脂酶Lecitase Ultra添加量取30 mg/kg。

2.2.4.2 磷脂酶C添加量

在磷脂酶Lecitase Ultra反應(yīng)時間90 min，磷脂酶C反應(yīng)時間60 min，改變磷脂酶C添加量，其他參數(shù)同2.2.1.1的條件下，研究磷脂酶C添加量對冷榨菜籽油脫膠效果的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 磷脂酶C添加量對冷榨菜籽油脫膠效果的影響

由圖6可見，隨著磷脂酶C添加量的增加，磷脂含量逐漸降低，在添加量達(dá)到60 mg/kg后，下降趨勢趨于平緩。從經(jīng)濟(jì)方面考慮，磷脂酶C添加量取60 mg/kg。

2.3 菜籽油酶法脫膠響應(yīng)面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上， 固定磷脂酶Lecitase Ultra反應(yīng)時間為90 min，磷脂酶C反應(yīng)時間為60 min，以磷脂酶Lecitase Ultra添加量(A)、磷脂酶C添加量(B)、加水量(C)、檸檬酸溶液添加量(D)為因素，以磷脂含量(Y)為響應(yīng)值，利用Design Expert軟件中Box-Behnken試驗設(shè)計原理，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析方法，對菜籽油酶法脫膠工藝進(jìn)行優(yōu)化，Box-Behnken試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表1，方差分析見表2。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計方案及結(jié)果

表2 回歸方程方差分析

由表2可知，模型極顯著(p<0.001)，失擬項不顯著(p>0.05)，說明該模型擬合程度較好，可準(zhǔn)確預(yù)測試驗結(jié)果。A、C、A2、C2、D2的影響極顯著(p<0.001)；B與B2的影響較顯著(p<0.01)；因素影響程度的大小排序為C>A>B>D，即加水量>磷脂酶Lecitase Ultra添加量>磷脂酶C添加量>檸檬酸溶液添加量。

以磷脂含量(Y)為響應(yīng)值，擬合所得各因素編碼值回歸方程為：Y=3.3-1.58A-0.9B-2.1C-0.29D+0.025AB-0.75AC+0.15AD-0.55BC-0.025BD-0.1CD+1.69A2+1.23B2+2.52C2+3.51D2。

用Design-Expert 8.0.5軟件預(yù)測最佳脫膠條件為磷脂酶Lecitase Ultra添加量32.91 mg/kg、磷脂酶C添加量64.85 mg/kg、加水量32.77 mL/kg、檸檬酸溶液添加量1.2 mL/kg，在此條件下預(yù)測脫膠油磷脂含量為2.03 mg/kg。為了方便實際操作，將最佳工藝條件修正為磷脂酶Lecitase Ultra添加量33 mg/kg、磷脂酶C添加量65 mg/kg、加水量33 mL/kg、檸檬酸溶液添加量1.2 mL/kg，在此條件下重復(fù)試驗3次，脫膠油平均磷脂含量為2.3 mg/kg，與預(yù)測值基本吻合，進(jìn)一步表明了回歸模型的有效性。

2.4 脫膠菜籽油理化指標(biāo)

采用磷脂酶Lecitase Ultra和磷脂酶C復(fù)合脫膠法，在確定的最佳工藝條件下，對冷榨菜籽原油進(jìn)行脫膠，對脫膠菜籽油和冷榨菜籽原油的基本理化指標(biāo)進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。

表3 脫膠菜籽油與菜籽原油基本理化指標(biāo)的對比

由表3可知，經(jīng)磷脂酶Lecitase Ultra和磷脂酶C復(fù)合脫膠法制備的脫膠油其過氧化值、酸值均達(dá)到GB/T 1536—2021中規(guī)定的一級壓榨菜籽油標(biāo)準(zhǔn)，皂化值及碘值對于菜籽原油也有明顯提升，磷脂含量相對于菜籽原油由693 mg/kg降至2.3 mg/kg，效果顯著，氣味、滋味與透明度也有明顯提升，可為后續(xù)精煉提供優(yōu)質(zhì)的油品。

3 結(jié) 論

為提高脫膠效率，以冷榨菜籽原油為原料，磷脂含量為指標(biāo)，在對影響菜籽油磷脂酶Lecitase Ultra和磷脂酶C復(fù)合脫膠工藝的單因素進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法對復(fù)合酶法脫膠工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，最終得到菜籽油磷脂酶Lecitase Ultra和磷脂酶C復(fù)合脫膠的最佳工藝參數(shù)為：磷脂酶Lecitase Ultra添加量33 mg/kg，磷脂酶Lecitase Ultra反應(yīng)時間90 min，磷脂酶C添加量65 mg/kg，磷脂酶C反應(yīng)時間60 min，加水量33 mL/kg，檸檬酸溶液添加量1.2 mL/kg。在最佳條件下脫膠，脫膠油中磷脂含量為2.3 mg/kg，脫膠效果良好，脫膠油的皂化值、碘值均有明顯提升，過氧化值及酸值均達(dá)到一級壓榨菜籽油的國家標(biāo)準(zhǔn)。說明優(yōu)化的工藝條件可用于冷榨菜籽油的脫膠。