Roux-en-Y胃旁路術(shù)前后肥胖癥患者肌肉組織的差異表達(dá)基因和藥物靶點分析

林 藝, 鄭建偉, 俞 巍, 馮國勛, 閆文貌, 白日星

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院, 1. 普通外科, 2. 腫瘤綜合治療中心, 北京, 100070)

肥胖癥是一種代謝疾病，可導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的健康問題，其已逐漸成為全球范圍內(nèi)公共衛(wèi)生領(lǐng)域的研究焦點[1-2]。減重代謝外科手術(shù)在歐美國家已被廣泛應(yīng)用于肥胖及相關(guān)并發(fā)癥的治療中，但其在中國的應(yīng)用仍處于發(fā)展階段[3]。目前，全腹腔鏡胃旁路術(shù)(TLGBP)被認(rèn)為是治療伴2型糖尿病的肥胖患者的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)式[4-5]。相關(guān)研究[6-7]顯示, Roux-en-Y胃旁路術(shù)(RYGB)不僅可減輕患者體質(zhì)量，而且可改善其代謝紊亂。另有研究[8]顯示，人體的主要代謝場所之一是骨骼肌，其代謝受損與肥胖癥誘發(fā)的胰島素抵抗等代謝異常關(guān)系密切。本研究探討RYGB對肥胖癥患者肌肉組織基因表達(dá)的影響，分析差異表達(dá)基因及其生物學(xué)功能，并進(jìn)行藥物靶點預(yù)測，以期探尋肥胖癥的潛在治療藥物。

1 資料與方法

1.1 RYGB相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)來源

基因芯片數(shù)據(jù)來源于GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), 檢索策略為: Roux-en-Y[All Fields] AND “Homo sapiens”[porgn]。納入RYGB術(shù)前和術(shù)后肌肉組織樣本[樣本總量>10例，術(shù)前和術(shù)后均有體質(zhì)量指數(shù)(BMI)信息]的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)集，并排除樣本接受體外培養(yǎng)等處理的數(shù)據(jù)集。經(jīng)篩選, GSE161643數(shù)據(jù)集符合研究標(biāo)準(zhǔn)，其包含RYGB術(shù)前和術(shù)后患者肌肉組織樣本、表達(dá)數(shù)據(jù)和實驗平臺等信息。通過R軟件和GEO query、limma等數(shù)據(jù)包篩選差異表達(dá)基因，以P<0.05且logFC>1或logFC<-1作為篩選條件。

1.2 基因集富集分析

以“msigdb.v7.4.entrez.gmt”為預(yù)設(shè)基因集，對納入數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，計算標(biāo)準(zhǔn)化富集評分(NES)后降序排列，根據(jù)基因本體論(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析結(jié)果取校正P<0.05且q<0.05的基因集。

1.3 免疫細(xì)胞浸潤分析

利用CIBERSORT算法進(jìn)行免疫細(xì)胞浸潤分析，通過計算獲得標(biāo)準(zhǔn)化基因表達(dá)數(shù)據(jù)，分析免疫細(xì)胞的比例。評估并比較每個樣本的免疫成分評分和基質(zhì)成分評分，評分越高表示對應(yīng)組分在微環(huán)境中的比例越高。

1.4 靶點-化合物相互作用分析

利用STITCH數(shù)據(jù)庫(http://stitch.embl.de/)構(gòu)建靶點-化合物相互作用網(wǎng)絡(luò)，尋找靶點和化合物之間的相互作用關(guān)系，然后下載相互作用的信息文件，并通過Cytoscape軟件(版本號3.8.1)打開，利用“Network Analyzer”插件分析藥物作用的關(guān)鍵靶點，篩選degree大于3且排名前10位的蛋白作為關(guān)鍵靶點。

1.5 關(guān)聯(lián)性圖譜(CMap)分析

CMap(https://clue.io/query)是活性化合物或藥物相關(guān)基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫，能夠利用生物信息學(xué)工具分析和挖掘藥物、基因和疾病之間的聯(lián)系。通過touchstone(https://clue.io/touchstone)將差異表達(dá)基因與化合物的參考表達(dá)譜進(jìn)行比較，得到與肥胖相關(guān)的小分子化合物或藥物，然后通過Venn圖篩選出共同作用于肥胖的候選藥物。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用limma數(shù)據(jù)包中的Student′st檢驗方法篩選RYGB術(shù)前和術(shù)后肌肉組織的差異表達(dá)基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)為|logFC|>1且P<0.05。免疫差異采用Student′st檢驗比較。所有數(shù)據(jù)使用R軟件(版本4.0.2)進(jìn)行統(tǒng)計分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。GO通路和KEGG分析選擇差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

2 結(jié) 果

2.1 RYGB手術(shù)對肥胖癥患者肌肉組織基因表達(dá)的影響

篩選GEO數(shù)據(jù)庫中RYGB術(shù)前和RYGB術(shù)后配對的肌肉組織樣本，對GSE161643數(shù)據(jù)集的表達(dá)譜數(shù)據(jù)(共納入病例22例，包括RYGB術(shù)前病例、RYGB術(shù)后病例各11例)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。全部基因和差異基因的分布情況通過繪制火山圖(圖1)進(jìn)行展示，差異表達(dá)基因在樣本中的表達(dá)通過繪制熱圖(圖2)進(jìn)行呈現(xiàn)。分析結(jié)果顯示, RYGB術(shù)后肌肉組織的基因表達(dá)譜與RYGB術(shù)前存在顯著差異，共篩選出差異表達(dá)基因74個，其中表達(dá)上調(diào)基因30個、表達(dá)下調(diào)基因44個。

2.2 RYGB術(shù)后肥胖癥患者肌肉組織基因的基因集富集分析

芯片數(shù)據(jù)集的基因集富集分析結(jié)果提示, GSE161643數(shù)據(jù)集富集于8個GO功能，分別為GO∶0006397、GO∶0008380、GO∶0000377、GO∶0000398、GO∶0000375、GO∶0050684、GO∶0005681、GO∶0043484, 主要圍繞mRNA加工、RNA剪接、mRNA加工的調(diào)控、RNA剪接的調(diào)控等過程。GO功能富集的前5個生物過程的可視化結(jié)果見圖3, 分別為: ① mRNA加工; ② mRNA剪接，通過剪接體; ③ RNA剪接; ④ RNA剪接，通過酯交換反應(yīng); ⑤ RNA剪接，通過酯或醇交換反應(yīng)將腺苷形成核苷化合物。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示, GSE161643數(shù)據(jù)集富集于hsa05168(單純皰疹病毒1型感染)，富集評分442 ,q=0.025 9。

2.3 RYGB術(shù)前和術(shù)后肌肉組織基因的免疫細(xì)胞浸潤分析

應(yīng)用ESTIMATE分別計算RYGB術(shù)前和RYGB術(shù)后的肌肉組織樣本中基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的比例，并生成基質(zhì)成分評分和免疫成分評分。分析結(jié)果顯示, RYGB術(shù)后肌肉組織的基質(zhì)成分評分、免疫成分評分與RYGB術(shù)前比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 見圖4。

2.4 STITCH靶點-化合物網(wǎng)絡(luò)

利用STITCH數(shù)據(jù)庫分析與基因靶點相互作用的化學(xué)成分，將上述基于GSE161643數(shù)據(jù)集篩選出來的差異表達(dá)基因?qū)隨TITCH數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)共有25個蛋白靶點，但

沒有找到與網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)的化合物，見圖5。利用Cytscape 軟件對構(gòu)建的相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，共篩選出關(guān)鍵靶點10個，分別為UBC、CDK1、ERBB2、CDK2、CHEK2、CDC25A、ERBB3、SHC1、CHEK1和BTRC。

2.5 CMAP藥物靶點篩選

利用CMap數(shù)據(jù)庫篩選出關(guān)鍵靶點基因，尋找治療肥胖癥的潛在候選小分子化合物。選擇排名前3位的關(guān)鍵靶點基因，即UBC、CDK1、ERBB2, 輸入CMap的touchstone(https://clue.io/touchstone), 比對關(guān)鍵靶點基因譜與CMap中的參照基因表達(dá)譜，得到相關(guān)的小分子化合物。應(yīng)用Venn圖篩選出共同作用于UBC、CDK1、ERBB2的9個小分子化合物，分別為氯吡格雷、BNTX、香豆素、左氧氟沙星、SID-26681509、依折麥布、異丁香酚、渥曼青霉素和PSB-06126，這些化合物可能成為候選治療藥物，見圖6、表1。

表1 共同作用于UBC、CDK1、ERBB2的小分子化合物

3 討 論

肥胖癥是一種慢性病，其所引起的糖尿病、心血管疾病、高血壓病等伴隨疾病已成為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[9-10]。相較于節(jié)食、運動和藥物治療等保守治療方法，外科減重手術(shù)能更有效且持久地降低肥胖患者的體質(zhì)量，改善糖代謝，減少肥胖相關(guān)并發(fā)癥[11]。WITTGROVE A C等[12]于1994 年報道了全腹腔鏡下RYGB術(shù)式，目前該術(shù)式已經(jīng)成為減重代謝外科中最被認(rèn)可的術(shù)式之一，但其改善代謝的機制尚未闡明。本研究對RYGB手術(shù)前后肌肉組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行深入挖掘，共篩選出差異表達(dá)基因74個，其中上調(diào)基因30個、下調(diào)基因44個，這些差異表達(dá)基因富集于8個GO功能，包括mRNA加工、RNA剪接、mRNA加工的調(diào)控、RNA剪接的調(diào)控等過程; KEGG通路富集分析顯示, GSE161643數(shù)據(jù)集富集于hsa05168(單純皰疹病毒1型感染); 構(gòu)建靶點-化合物相互作用網(wǎng)絡(luò)，分析后共篩選出10個關(guān)鍵靶點; 進(jìn)一步篩選針對關(guān)鍵基因的小分子化合物，共得到9個小分子化合物，可作為治療肥胖癥的候選藥物。

骨骼肌是人體的主要代謝場所之一，其代謝受損與肥胖癥誘發(fā)的胰島素抵抗等代謝異常關(guān)系密切，而骨骼肌胰島素抵抗被認(rèn)為是肥胖和2型糖尿病的一個重要特征[8]。減重手術(shù)后骨骼肌中某些基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)會發(fā)生變化, GASTALDI G等[13]發(fā)現(xiàn), RYGB術(shù)后肌肉組織的PGC1A表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而刺激MFN2表達(dá)，且多因素分析顯示MFN2表達(dá)與胰島素敏感性改善相關(guān)。LEICHMAN J G等[14]研究了RYGB術(shù)和胃綁帶術(shù)后肌肉代謝和心臟的變化，發(fā)現(xiàn)SCD、PDK4表達(dá)水平在術(shù)后早期下降，第3、9個月時SCD、PDK4轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，而PPARα及其調(diào)控的基因(MACD、CPT1、UCP3)在手術(shù)后期表達(dá)下降，同時血漿游離脂肪酸濃度下降，手術(shù)后第9個月時胰島素敏感性恢復(fù)，血漿瘦素降低，心臟超聲顯示左心室舒張障礙恢復(fù)正常。ALBERS P H等[15]發(fā)現(xiàn)，在RYGB術(shù)后12個月，骨骼肌中GLUT4蛋白表達(dá)增加，胰島素信號分子(如胰島素受體Akt和TBC1D4)磷酸化增強，糖原合酶活性改善。TAMBOLI R A等[16]發(fā)現(xiàn)，減重手術(shù)后 6、12 個月骨骼肌炎癥相關(guān)基因(ANKRD1、CDR1、CH25H、CXCL2、CX3CR1、IL8、LBP、NFIL3、SELE、SOCS3、TNFAIP3和ZFP36)表達(dá)降低，且IL6、CCL2的表達(dá)在術(shù)后所有時點均下降。相關(guān)研究[17]發(fā)現(xiàn)，肥胖和RYGB對骨骼肌蛋白質(zhì)組有動態(tài)影響, 260種蛋白質(zhì)在肥胖者中表達(dá)顯著減少，135種蛋白質(zhì)表達(dá)顯著增加, RYGB術(shù)后, 49種蛋白質(zhì)恢復(fù)至正常水平。KEGG通路分析顯示，富集于核糖體途徑以及胰島素信號蛋白(包括MAP激酶和GLUT定位的蛋白質(zhì))的豐度增加和正?；?。本研究結(jié)果顯示，表達(dá)上調(diào)基因30個、表達(dá)下調(diào)基因44個，與其他文獻(xiàn)報道的基因并不完全一致，提示存在個體和人種差異。此外，富集分析結(jié)果提示，生物學(xué)功能主要圍繞mRNA加工、RNA剪接、mRNA加工的調(diào)控、RNA剪接的調(diào)控等過程，而KEGG富集于單純皰疹病毒1型感染。

本研究結(jié)果提示,CDK1、UBC和ERBB2是肥胖代謝過程中的關(guān)鍵靶點基因。相關(guān)研究[18]稱CDK1-SIRT3-CPT2級聯(lián)能夠調(diào)節(jié)人體內(nèi)有害脂肪棕櫚酸的代謝，該過程通過增強線粒體代謝穩(wěn)態(tài)實現(xiàn)，由CDK1介導(dǎo)SIRT3磷酸化，而SIRT3磷酸化使CPT2脫乙?；投刍?，以增強脂肪酸氧化。SHANG W T等[19]報道，UBC基因參與脂肪生成相關(guān)PPAR信號通路。在結(jié)構(gòu)上，ERBB2、ERBB3是與ERBB1或ERBB4 相關(guān)的共同受體，相關(guān)研究[20]報道神經(jīng)調(diào)節(jié)因子-1(NRG-1)與ERBB3或ERBB4結(jié)合，介導(dǎo)ERBB2受體的活化，進(jìn)一步激活部分ERKl/2和/或P13K/Akt通路。

藥物治療是除改變生活方式和減重手術(shù)以外的一種有潛力的重要療法，本研究分析了針對相應(yīng)靶點的潛在藥物。文獻(xiàn)檢索結(jié)果顯示，氯吡格雷能否治療肥胖癥尚無直接的研究結(jié)果，有學(xué)者研究了一種可以阻止細(xì)胞色素P4508B1作用的減肥藥，而氯吡格雷前體藥物也通過肝臟細(xì)胞色素P450酶系統(tǒng)進(jìn)行代謝[11]。肥胖癥是氯吡格雷治療效果的分層因素, BMI顯著影響CYP2C19基因與氯吡格雷-阿司匹林治療效果之間的相關(guān)性[21]?；谛∈竽Ｐ偷难芯縖22]發(fā)現(xiàn)，由于與白細(xì)胞介素-1(IL-1)受體信號相關(guān)的前藥生物活性降低，氯吡格雷的抗血小板作用可能在糖尿病患者中受損。氯吡格雷為經(jīng)典的抗血小板藥物，但相關(guān)臨床研究并未提供用藥后BMI變化數(shù)據(jù)。

脂肪生成和代謝也被認(rèn)為是肥胖癥的潛在治療靶點。載脂蛋白A-Ⅰ是高密度脂蛋白顆粒的主要蛋白，而香豆素分子結(jié)構(gòu)的類似天然化合物可能有助于增加載脂蛋白A-Ⅰ轉(zhuǎn)錄的分子成份[23]。依折米貝通過AMPK-mTORC1途徑下調(diào)脂質(zhì)生成相關(guān)基因，減少脂質(zhì)積累，還通過阻滯細(xì)胞周期在G0/G1期，抑制脂肪細(xì)胞增殖，阻止有絲分裂克隆擴增[24]。依折米貝治療可誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞中的抗炎細(xì)胞因子和脂肪酸氧化，降低血清游離脂肪酸水平，減小內(nèi)臟脂肪中脂肪細(xì)胞大小，并部分改善血糖指數(shù)[25]。脂肪組織通過上調(diào)PI3K/Akt通路分子來影響內(nèi)臟前脂肪細(xì)胞/脂肪細(xì)胞中的胰島素信號傳導(dǎo)[26]。PI3K抑制劑渥曼青霉素被細(xì)胞實驗證明可以降低p-Akt、p-FoxO1和PPARγ2的表達(dá)，從而抑制人脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞(hADSC)的脂肪生成[26]。

腸道菌群在肥胖的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。一項分析依澤米貝對新疆地區(qū)超重和肥胖伴血脂異?；颊吣c道微生物群影響的研究[27]結(jié)果顯示，梭狀芽孢桿菌和毛螺菌在依澤米貝干預(yù)2周后與總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)均呈負(fù)相關(guān)，提示其作為潛在的微生物靶點在改善肥胖患者糖脂代謝中的作用。除了受藥物影響外，腸道菌群還受幽門螺桿菌(Hp)的影響，而后者會引發(fā)代謝紊亂[28]。研究[29]顯示，根除Hp治療可改善脂代謝和腸道菌群。減重手術(shù)切除了部分胃底，可減少Hp感染所致的食欲調(diào)節(jié)激素[30], 而質(zhì)子泵抑制劑也可產(chǎn)生根治Hp的效果。左氧氟沙星聯(lián)合阿莫西林、質(zhì)子泵抑制劑的治療方案，根除Hp的效果與一線治療方案(質(zhì)子泵抑制劑、鉍、甲硝唑、四環(huán)素)類似[31]。因此，左氧氟沙星可能通過根除Hp而間接參與肥胖癥的治療。

本研究存在一些局限性: ① 本研究以GEO公共芯片數(shù)據(jù)為分析基礎(chǔ)，信號通路以及藥物預(yù)測結(jié)果還需通過臨床樣本和實驗加以驗證; ② 氯吡格雷在心腦血管領(lǐng)域已有很多臨床試驗項目，部分項目包括用藥前的BMI數(shù)據(jù)，但均未關(guān)注用藥后的BMI數(shù)據(jù)，未來應(yīng)關(guān)注氯吡格雷相關(guān)大型臨床研究項目的用藥后BMI數(shù)據(jù); ③ 本研究所用開放數(shù)據(jù)庫的病例源自西方人群，肥胖癥的一些影響因素例如遺傳、表觀遺傳、腸道菌群、生活習(xí)慣和經(jīng)濟(jì)狀況等可能與東方人群存在差異。

綜上所述，與RYGB術(shù)前相比，肥胖癥患者RYGB術(shù)后的肌肉組織基因表達(dá)存在顯著差異，這些差異可能成為治療肥胖癥的潛在藥物靶點。肥胖癥疾病過程中的一些關(guān)鍵靶點基因，可為治療藥物的研究提供參考依據(jù)，但這些基因的臨床價值還需進(jìn)一步結(jié)合臨床病例加以驗證，從而為安全有效地治療肥胖癥提供新思路。