小麥抗葉銹病新種質(zhì)的創(chuàng)制與鑒定

趙佳佳，劉鑫，王超，楊武德

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095）

小麥（Triticum aeistvumL.）是我國的主要糧食作物之一，其產(chǎn)量和品質(zhì)直接關(guān)系到國家的糧食安全。現(xiàn)代育種和農(nóng)藝技術(shù)的進(jìn)步使得我國小麥產(chǎn)量從2000年的9 990萬t增加到2021年的13 695萬t[1]。然而，病害是影響谷物產(chǎn)量的重要因素，小麥主要有三大銹病，葉銹病、條銹病和稈銹病[2]，其中，條銹病和稈銹病具有較大的破壞性，而葉銹病較持久、廣泛[3]。小麥葉銹病是由葉銹菌引起的真菌性氣傳病害，主要通過侵染小麥葉片影響光合作用，進(jìn)而降低籽粒灌漿速率，影響千粒質(zhì)量和產(chǎn)量[4-6]。在2000—2004年美國因葉銹病導(dǎo)致約3.5億美元的損失，在我國每年由葉銹病導(dǎo)致糧食減產(chǎn)約300萬t[7]。隨著抗葉銹病品種的大量利用，近幾十年的損傷已經(jīng)大大減少。但新的病理小種不斷出現(xiàn)，全生育期具有強(qiáng)抗性品種較少[8]。因此，尋找新的抗病基因資源、培育持久抗病品種是提高小麥抗病性的基礎(chǔ)[9-10]。目前僅有Lr12、Lr13、Lr67、Lr68、Lr75、Lr77、Lr22a、Lr22b、Lr23、Lr34、Lr35、Lr46、Lr48、Lr49和Lr78等 具 有 成 株 期 抗性[11-12]，其中，Lr22a來源于偏凸山羊草（Aegilops tauschii）[13-14]，Lr25和Lr26來源于黑麥[15]，Lr35來源于擬斯卑爾脫山羊草（Triticum speltoides）[16]。隨著病原菌與抗病基因的相互選擇與進(jìn)化，一些抗葉銹病基因在育種中被淘汰[17]。目前在我國小麥種植區(qū)僅有Lr9、Lr19、Lr38和Lr53等保持較高抗性[18]。此外，由于受自然和人工選擇影響，現(xiàn)代育成小麥的遺傳多樣性降低，基因庫狹窄，不利于新的抗病品種培育，尋找和發(fā)掘新的抗葉銹病基因備受重視。

小麥近緣物種具有抗白粉病、赤霉病、銹病等多種病害和耐寒、耐鹽等耐逆基因，是小麥遺傳改良的重要資源。如大賴草不僅具有較強(qiáng)環(huán)境適應(yīng)性，還具有穗大、籽粒大等優(yōu)良特性[19]；百薩偃麥草含有高分子量麥谷蛋白亞基[20]、光周期[21]等重要基因；冰草具有抗白粉病、葉銹病、條銹病以及多穗、多小花、多分蘗等特性[22]。通過遠(yuǎn)緣雜交，將野生近緣種中的抗病基因?qū)氲叫←溨校翘嵘←溈共⌒缘闹匾侄蝃23-25]。目前，基于小麥-近緣植物構(gòu)建的雙二倍體、代換系、易位系以及滲入系等異染色體系，為改良小麥綜合農(nóng)藝性狀提供了重要材料。如由小麥-長穗偃麥草創(chuàng)制的含有抗條銹病基因的小偃系列部分雙二倍體[26]，含有抗赤霉病基因Fhb7的小麥-偃麥草滲入系[27]，以及小麥-冰草衍生的品系[28]和小麥-中間偃麥草雙體異附加系[29]等；其中，小麥-黑麥易位系T1BL·1RS[30]和小麥-簇毛麥易位系T6VS·6AL[31]是利用小麥近緣物種優(yōu)良基因的成功范例。

黑麥屬是小麥野生近緣植物之一，含有豐富的優(yōu)良基因，如高產(chǎn)、廣適和抗白粉病、葉銹病、條銹病等，是改良小麥抗性、提高產(chǎn)量、增強(qiáng)適應(yīng)性的重要基因資源[23-24]。目前從小麥近緣屬植物轉(zhuǎn)入普通小麥中的抗病基因以黑麥最多，如1R、2R、3R、6R染色體上分布的一些抗病基因，特別是小麥-黑麥易位系T1BL·1RS是利用黑麥進(jìn)行小麥遺傳改良最成功的范例[32]，有效地將1RS染色體上攜帶的Pm8、Lr26、Sr31和Yr9等抗病以及豐產(chǎn)性基因轉(zhuǎn)移到普通小麥中，在國內(nèi)外受到廣泛利用[33]。黑麥作為異交植物，具有較高的遺傳多樣性，應(yīng)用潛力較高，但由于雜交結(jié)實(shí)率低、育種過程繁瑣，常規(guī)應(yīng)用于小麥育種較為困難。小黑麥?zhǔn)怯尚←満秃邴湆匐s交得到的一種新物種，結(jié)合了小麥和黑麥的優(yōu)良性狀，且與普通小麥更易雜交，為利用黑麥的抗病基因改良小麥搭建起一座“橋梁”。

為尋找新的抗葉銹病資源，并為培育持久抗病品種提供優(yōu)異的中間型育種材料，本研究前期通過八倍體小黑麥和普通小麥雜交獲得異源染色體系H445，對(duì)其進(jìn)行成株期葉銹病抗性鑒定、農(nóng)藝性狀評(píng)估以及細(xì)胞學(xué)鑒定，旨在為這些材料的深入研究和利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取八倍體小黑麥H800、普通小麥L311、異源染色體系H445和感病對(duì)照銘賢169為材料。采用5個(gè)高毒性的葉銹菌混合生理小種PHJS、THJS、THSF、FHJS和THRT進(jìn)行抗病檢測(cè)，上述材料均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥細(xì)胞工程與分子育種實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 H445抗葉銹病鑒定

將H445、2個(gè)親本和感病對(duì)照銘賢169于2020年10月和2021年10月播種于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，每個(gè)材料播種4行，行長1.5 m，行距0.3 m，每5行種植1行感病對(duì)照銘賢169，并在種植材料兩側(cè)垂直播種銘賢169作為誘發(fā)行。參照LI等[34]的田間接種法，利用混合生理小種對(duì)誘發(fā)行進(jìn)行接種。成株期抗病性鑒定具體操作按照GB/T 19557.2—2004進(jìn)行，0～2級(jí)為抗病，3～4級(jí)為感?。ū?）。

表1 成株期小麥葉銹病標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Criteria for leaf rust of wheat at adult stage

1.3 細(xì)胞學(xué)鑒定

根尖取樣：將待鑒定的種子置于墊有2層濕潤濾紙的玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)，放至24℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至根長為1.5～2.0 cm，將0.1 mmol/L甲基胺草磷溶液（Amiprophos-methyl，APM）倒入培養(yǎng)皿浸沒種子，放于24℃恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h后倒掉APM；用清水沖洗種子2～3次后，剪取根尖后放于0.5 mL離心管（蓋子上有孔），向管中噴少許水。將離心管置于笑氣（一氧化二氮）罐中（0.8～1.2 MPa）處理1.5 h（室溫）。取出，加入90%的預(yù)冷冰醋酸，于4℃冰箱中固定7～8 min，吸干將根尖轉(zhuǎn)移至含有70%乙醇的離心管中，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

染色體制片：取出根尖置于45%醋酸中解離5 min，切掉根冠，輕輕將根尖分生區(qū)組織置于載玻片上，滴適量45%的醋酸溶液，蓋上蓋玻片，輕敲使細(xì)胞分散，用酒精燈外焰烘烤載玻片，待霧氣散開后壓片；在相差顯微鏡下觀察，將細(xì)胞分裂相好的載玻片快速放于-70℃冰箱中保存6 h以上；揭去蓋玻片，放于100%無水乙醇中脫水6 h以上，氣干備用。

標(biāo)記探針：本研究所用探針為黑麥基因組探針和寡核苷酸探針。以黑麥基因組為探針，用Fluorescein-12-dUTP通過切口平移法標(biāo)記DNA，15℃下標(biāo)記2 h，-20℃避光保存?zhèn)溆谩９押塑账崽结樌锰结樚譕NMP#7：包括TAMRA（紅色）修飾 的pAs1-1、pAs1-3、pAs1-4、pAs1-6、AFA-3、AFA-4、pSc119.2-1、Grass-5S-1、Grass-5S-2和FAM（綠 色）修 飾 的（GAA）10、BSCL135-1和BSCL135-2共12個(gè)探針，探針序列如表2所示。

表2 ONMP#7探針序列Tab.2 Probes sequence of ONMP#7

原位雜交：參照WU等[35]的方法進(jìn)行熒光原位雜交。以Fluorescein-12-dUTP標(biāo)記的黑麥基因組DNA和ONMP#7探針進(jìn)行原位雜交，在Olympus BX53或Olympus BX60型熒光顯微鏡下鏡檢，用SPOT CCD（SPOT Cooled Color Digital Camera）拍攝圖像。

1.4 H445農(nóng)藝性狀調(diào)查

2020—2021、2021—2022年度，在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)東陽試驗(yàn)基地種植試驗(yàn)材料。調(diào)查H445、H800和L311品種農(nóng)藝性狀，包括株高、分蘗數(shù)、穗長、小穗數(shù)、千粒質(zhì)量、粒長、粒寬等，調(diào)查10個(gè)株系，3次重復(fù)。籽粒收獲后，并進(jìn)一步測(cè)定蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、沉降值、形成時(shí)間、穩(wěn)定時(shí)間和拉伸面積等品質(zhì)指標(biāo)，3次重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥-黑麥新種質(zhì)H445的創(chuàng)制

八倍體小黑麥?zhǔn)瞧胀ㄐ←満秃邴湹漠愒措p二倍體，具有抗病蟲、耐逆、蛋白質(zhì)含量高等特點(diǎn)，將人工合成的八倍體小黑麥與普通小麥進(jìn)行回交，可加強(qiáng)小麥特性，能有效創(chuàng)制新種質(zhì)。八倍體小黑麥H800植株高156 cm，分蘗力強(qiáng)，具有抗白粉病、條銹病和葉銹病等特性。以八倍體小黑麥H800和普通小麥L311進(jìn)行雜交，獲得一個(gè)雜種F1，再與L311回交獲得BC1F1植株。BC1F1植株連續(xù)自交3代，分別在F4和F5通過形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)鑒定分離篩選具有雙親特性、抗葉銹病和綜合性狀好的植株，在此基礎(chǔ)上，經(jīng)細(xì)胞學(xué)鑒定，選取花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期染色體構(gòu)型為21個(gè)二價(jià)體的30個(gè)單株；進(jìn)一步自交，于F7和F8選育性狀穩(wěn)定、抗葉銹病的純系植株，命名為H445。

2.2 小麥-黑麥新種質(zhì)H445細(xì)胞學(xué)鑒定

染色體組成影響植株性狀[35]，進(jìn)一步對(duì)2個(gè)親本和H455的染色體組成進(jìn)行鑒定，八倍體小黑麥的染色體組成為56條，普通小麥L311染色體組成為42條，經(jīng)細(xì)胞學(xué)鑒定，H445染色體組成為42條染色體，是小麥-黑麥異源六倍體（圖1-a）。以黑麥基因組DNA為探針、中國春基因組DNA作封阻進(jìn)行原位雜交（GISH），結(jié)果顯示，12條染色體呈綠色信號(hào)，其余30條染色體未有信號(hào)（圖1-b），表明H445攜帶12條黑麥染色體和30條小麥染色體，為小麥-黑麥異源部分雙二倍體。進(jìn)一步利用ONMP#7進(jìn)行FISH鑒定，檢測(cè)到小麥B基因組的全部14條染色體（1B～7B），A基因組僅含有12條，未檢測(cè)到染色體6A，而D基因組僅鑒定到2D和6D染色體，其余12條染色體分別為黑麥的1R、3R、4R、5R、6R和7R（圖1-c～f）。。

圖1 H445的染色體組成Fig.1 Chromosomal composition of H445

2.3 新種質(zhì)H445的抗病性鑒定

親本八倍體小黑麥H800對(duì)葉銹菌表現(xiàn)為近免疫或高抗，普通小麥L311對(duì)混合菌表現(xiàn)為高感。異源染色體系H445植株健壯，有效分蘗較多，結(jié)實(shí)性良好。經(jīng)多年田間自然發(fā)病和接種鑒定，發(fā)現(xiàn)H445的穗、葉均未受到葉銹菌的侵染，表現(xiàn)為免疫；而親本L311的穗部和葉片均呈現(xiàn)點(diǎn)狀斑點(diǎn)，特別是旗葉和穗部斑點(diǎn)較多，感病性最強(qiáng)，植株整體表現(xiàn)出早衰癥狀（圖2）?？梢?，小麥-黑麥新種質(zhì)H445在成株期具有較強(qiáng)的葉銹病抗性，推測(cè)其抗葉銹病基因可能來自于八倍體小黑麥H800的黑麥染色體。

圖2 H445成株期抗病性鑒定Fig.2 Identification of disease resistance of H445 at adult stage

2.4 H445農(nóng)藝性狀分析

對(duì)普通小麥-黑麥新種質(zhì)H445及其親本H800和L311的農(nóng)藝性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（表3）發(fā)現(xiàn)，不同年份下親本H800和L311的主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)一致，在株高、分蘗數(shù)、小穗數(shù)、穗長、粒長、粒寬等性狀間存在顯著差異，均表現(xiàn)為小黑麥H800顯著高于普通小麥L311。異染色體系H445株型較緊湊，植株形態(tài)介于雙親之間，與2個(gè)親本比較可知，受八倍體小黑麥H800的影響，H445株高（106.34 cm）較普通小麥L311株高顯著增加9.45%。H800的穗長較長，為12.37 cm，具有34.18個(gè)小穗數(shù)，顯著高于普通小麥L311；而H445與L311表現(xiàn)較一致，穗長為7.86～8.99 cm，小穗數(shù)為20.21～24.56穗，均表現(xiàn)為顯著小于H800。此外，提高穗數(shù)是產(chǎn)量提升的決定性因素，經(jīng)鑒定H445和H800植株的有效分蘗數(shù)較多，平均為12.88個(gè)，與親本L311差異顯著，顯著增加45.20%。表明小麥-黑麥新種質(zhì)H445具有分蘗多的特點(diǎn)。千粒質(zhì)量作為構(gòu)成產(chǎn)量的主要因素之一，2021年2個(gè)親本的千粒質(zhì)量分別為38.14、43.22 g，而H445的千粒質(zhì)量為52.32 g，與2個(gè)親本比較，H445在籽粒質(zhì)量、粒長和粒寬等指標(biāo)上均有一定程度的提高，其中，千粒質(zhì)量的提高達(dá)到顯著水平，較普通小麥L311顯著增加24.98%；粒長和粒寬分別為8.12、3.21 mm，與H800差 異 不 顯 著，較L311顯 著 增 加，2021年 與2022年兩年度表現(xiàn)一致（表2）。表明黑麥染色體對(duì)小麥的籽粒質(zhì)量和粒徑等性狀值具有顯著促進(jìn)作用。

表3 H445的農(nóng)藝性狀比較Tab.3 Comparison of agronomic traits of H445

2.5 H445品質(zhì)測(cè)定

八倍體小黑麥除有較強(qiáng)的抗逆性外，籽粒的蛋白質(zhì)含量平均為16%，而小麥僅含13%；賴氨酸含量平均為全蛋白質(zhì)的3%～4%，也高于小麥。為了檢測(cè)小麥-黑麥新種質(zhì)H445的品質(zhì)表現(xiàn)，采用IM9100型近紅外谷物分析儀對(duì)2個(gè)親本和H445籽粒的蛋白質(zhì)含量、沉降值、濕面筋含量以及面團(tuán)形成時(shí)間、穩(wěn)定時(shí)間和拉伸面積等6個(gè)品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。從表4可以看出，新種質(zhì)H445的蛋白質(zhì)含量為14.96%，L311為14.00%，二者差異顯著；而沉降值、濕面筋含量以及面團(tuán)形成時(shí)間、穩(wěn)定時(shí)間和拉伸面積與普通小麥L311間差異均不顯著。H445與八倍體小黑麥H800相比，品質(zhì)性狀間差異不顯著。表明導(dǎo)入到小麥中的黑麥染色體攜帶有提高蛋白質(zhì)含量的基因。

表4 H445的品質(zhì)性狀Tab.4 Quality traits of H445

3 結(jié)論與討論

小黑麥?zhǔn)峭ㄟ^遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)，將黑麥和普通小麥雜交合成的屬間雜種，是一種中間材料，不僅具有黑麥的抗病、耐逆等特征，也具有普通小麥的農(nóng)藝表型，是改良小麥的重要橋梁。八倍體和六倍體小黑麥在向普通小麥轉(zhuǎn)移黑麥基因過程中，利用最廣、發(fā)揮作用最大。其中，八倍體小黑麥與普通小麥雜交，后代性狀分離小，遺傳穩(wěn)定性好，為選育優(yōu)良性狀的小麥-黑麥品系提供了材料。本研究以八倍體小黑麥和普通小麥雜交創(chuàng)制了小麥-黑麥新種質(zhì)H445，經(jīng)鑒定為異源部分雙二倍體。異源雙二倍體具有小麥野生近緣屬抗病、耐逆以及普通小麥優(yōu)良品質(zhì)和農(nóng)藝性狀等特點(diǎn)，是進(jìn)一步向栽培小麥中轉(zhuǎn)移優(yōu)良外源基因的橋梁，同時(shí)也是繼續(xù)創(chuàng)制異附加系、異代換系、易位系、滲入系的基礎(chǔ)材料，在小麥遺傳改良中具有重要的利用價(jià)值。前人曾利用小麥與長穗偃麥草雜交獲得了一批小偃系列部分雙二倍體，如小偃693和小偃68[36-37]，小麥-中間偃麥草雙二倍體[38-44]，以及煙農(nóng)15背景下的八倍體小偃麥TE183、TE185和TE347[45-48]已被廣泛用于小麥遺傳改良。本研究中創(chuàng)制的小麥-黑麥異源六倍體H445含有12條黑麥染色體和30條小麥染色體，可作為后續(xù)創(chuàng)制異染色體系和培育優(yōu)異種質(zhì)的橋梁材料。

優(yōu)異種質(zhì)資源是小麥育種的基礎(chǔ)，針對(duì)目標(biāo)性狀合理選用種質(zhì)親本，可高效培育新種質(zhì)。作為小麥遠(yuǎn)緣雜交的產(chǎn)物——小黑麥具有很多優(yōu)良基因和強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)，表現(xiàn)出與普通小麥一致的農(nóng)藝性狀。本研究中創(chuàng)制的小麥-黑麥新種質(zhì)H445對(duì)葉銹病表現(xiàn)出較強(qiáng)抗性，維持了葉片的正常光合，保證了籽粒的正常灌漿，與感病小麥L311相比，千粒質(zhì)量顯著增加；此外H445還具有較高的分蘗數(shù)。可能是黑麥染色體上攜帶有優(yōu)異基因的作用，異源染色體系H445可運(yùn)用于小麥產(chǎn)量性狀的改良中。小麥籽粒蛋白質(zhì)含量和沉淀值是小麥品質(zhì)育種的重要目標(biāo)性狀。本研究發(fā)現(xiàn)，小麥-黑麥新種質(zhì)H445的面團(tuán)品質(zhì)性狀與普通小麥差異不大，但蛋白質(zhì)含量增加，可能是因?yàn)楹邴?RS攜帶有黑麥堿（Secalin）合成基因，因而使面團(tuán)的穩(wěn)定性和延伸性降低，進(jìn)而影響其烘烤和蒸煮品質(zhì)，但對(duì)蛋白質(zhì)含量的影響不大。這與DHALIWAL等[49]和BULLICH等[50]利用T1BL·1RS易位染色體對(duì)小麥籽粒蛋白質(zhì)含量影響研究結(jié)果相一致。然而也有研究表明，在任何遺傳背景下，1BL/1RS易位對(duì)SDS沉降值均有不良效應(yīng)[50]。總之，要闡明具體哪條黑麥染色體攜帶有控制抗病性、產(chǎn)量表型和品質(zhì)性狀的基因，需進(jìn)一步利用該材料創(chuàng)制不同類型的易位系、代換系等異染色體系，尋找并挖掘相關(guān)性狀的基因位點(diǎn)。