57份小麥微核心種質(zhì)苗期耐鹽鑒定及分子標(biāo)記評價

宋楠，陳家婷，郭慧娟，常利芳，張樹偉，陳芳，李欣，張曉軍，暢志堅，喬麟軼

（1.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太原 030031）

小麥（Triticum aestivumL.）是世界上種植面積最大的糧食作物之一，為人類生存提供基本食物保障[1]。目前，育種家采用品種改良方法可使小麥單產(chǎn)每年提高約0.9%，但隨著全球人口增長以及對糧食需求的增加，小麥單產(chǎn)增長速率需要達(dá)到2%以上[2-3]，才能滿足人類社會發(fā)展需求，因此，進(jìn)一步發(fā)掘小麥增產(chǎn)潛力迫在眉睫。土壤鹽漬化是影響小麥生長發(fā)育和產(chǎn)量形成的主要非生物脅迫之一。當(dāng)前，全球土壤面積有10%發(fā)生鹽漬化，其中，我國土壤鹽漬化面積達(dá)3.6×107hm2[4]，嚴(yán)重制約小麥增產(chǎn)，因此，廣泛發(fā)掘耐鹽種質(zhì)用于小麥品種抗逆性改良是利用鹽堿地擴(kuò)大小麥種植面積和提高鹽堿地小麥單產(chǎn)的最經(jīng)濟(jì)有效途徑之一。近年來，國內(nèi)外小麥耐鹽種質(zhì)篩選與品種改良逐漸被科學(xué)界重視。KHAN等[5]對24份小麥種質(zhì)進(jìn)行鹽脅迫處理，篩選出了7份苗期具有較強(qiáng)耐鹽性的種質(zhì)V-8001、LU26s、Bhittai、C-228、KTDH、KTDH-22和DS-17；HUSSAIN等[6]利用苗期鹽脅迫試驗(yàn)鑒定了40份小麥品種，選出3份耐鹽材料S-24、LU-26S和Pasban-90；OYIGA等[7]從150份小麥品種中鑒定出3份 耐 鹽 材 料Altay2000、14IWWYTIR-19和UZ-11CWA-8；張巧鳳等[8]評價了293份小麥種質(zhì)的苗期耐鹽性，篩選出5份耐鹽新種質(zhì)Marmin-Minhardi×H44-Minturki、圓白殼小麥、花樹蒲、和尚麥和頂籽；劉旭等[9]從400份小麥種質(zhì)中篩選出3份耐鹽材料：紅螞蚱、希望、科遺26。上述種質(zhì)的篩選為小麥品種的耐鹽性改良提供了重要資源，但仍有大量高耐鹽性種質(zhì)仍未得到鑒定和利用。

為了高效發(fā)掘小麥耐鹽種質(zhì)，本研究在YU等[10]利用芽期耐鹽指數(shù)評價核心種質(zhì)的基礎(chǔ)上，以郝晨陽等[11]利用分子標(biāo)記篩選的小麥微核心種質(zhì)為材料，開展苗期鹽脅迫鑒定，并利用鹽害指數(shù)（Salt injury index，SI）篩選耐鹽種質(zhì)，同時利用分子標(biāo)記分析其可能攜帶的耐鹽位點(diǎn)，以期為小麥抗鹽育種提供一定的理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

57份小麥微核心種質(zhì)[12]包括42份農(nóng)家種、12份育成品種和3份引進(jìn)品種，由作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。另設(shè)置小麥品種旱選10號作為耐鹽對照、中國春作為鹽敏感對照。

1.2 鹽脅迫處理

每份種質(zhì)選取20粒飽滿種子，經(jīng)1%雙氧水消毒后用去離子水沖洗，將其置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，籽粒腹溝朝下，加水萌發(fā)。當(dāng)胚根生長至2～3 cm時，從中選取8粒生長勢一致的種子轉(zhuǎn)移至盛有1/2霍格蘭氏營養(yǎng)液的培養(yǎng)皿，置于恒溫培養(yǎng)箱，設(shè)置參數(shù)：16 h光照/22℃，8 h黑暗/16℃；7 d后，待幼苗長至兩葉一心，用含NaCl的1/2霍格蘭氏營養(yǎng)液進(jìn)行鹽脅迫處理，14 d后進(jìn)行表型鑒定，3次生物學(xué)重復(fù)。

利用200、250、300、350、400 mmol/L等5個鹽濃度分別測試對照品種旱選10號和中國春的苗期耐鹽性，將二者鹽害指數(shù)差異最大時對應(yīng)的鹽濃度作為鑒定微核心種質(zhì)的鹽脅迫濃度。

1.3 表型鑒定與數(shù)據(jù)分析

采用張瀟文等[13]方法，將小麥植株耐鹽級別劃分為0～4級，并計算每份種質(zhì)的鹽害指數(shù)（SI）。

其中，N指植株數(shù)目，本研究中N=8。依據(jù)鹽害指數(shù)對小麥種質(zhì)做總體評價，分別為：高感（80.1%～100%）、敏感（60.1%～80.0%）、中耐（40.1%～60.0%）、耐鹽（20.1%～40.0%）以及高耐（0～20.0%）。

1.4 耐鹽分子標(biāo)記鑒定

采用改良CTAB法提取小麥葉片基因組DNA。根據(jù)文獻(xiàn)[14-17]合成74個耐鹽相關(guān)分子標(biāo)記，擴(kuò)增微核心種質(zhì)DNA，從中選擇24個多態(tài)性穩(wěn)定、條帶清晰的標(biāo)記用于相關(guān)性分析（表1）。

表1 24個用于種質(zhì)評價的耐鹽相關(guān)分子標(biāo)記及序列Tab.1 The sequences of 24 salt-tolerance-related molecular markers for evaluation of germplasm resources

續(xù)表1 24個用于種質(zhì)評價的耐鹽相關(guān)分子標(biāo)記及序列Tab.1（Continued）The sequences of 24 salt-tolerance-related molecular markers for evaluation of germplasm resources

PCR反應(yīng)體系為：ddH2O 2μL，PCR Mixture 5μL，引物1.5μL，DNA（50 ng/μL）1.5μL。PCR反應(yīng)程序：95℃30 s；58℃30 s，72℃30 s，36個循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，經(jīng)硝酸銀染色、顯影液顯色后拍照保存。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2020軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，以及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選苗期耐鹽濃度

小麥種質(zhì)苗期耐鹽鑒定濃度的篩選如圖1所示。

圖1 小麥種質(zhì)苗期耐鹽鑒定濃度的篩選Fig.1 Screening of concentration for salt-tolerance identification of wheat germplasm at seedling stage

利用5個鹽濃度分別測試對照品種旱選10號和中國春的苗期耐鹽性，結(jié)果表明（圖1），隨著NaCl濃度升高，旱選10號和中國春的鹽害指數(shù)不斷增加。當(dāng)NaCl濃度為250 mmol/L時，耐鹽對照旱選10號和鹽敏感對照中國春的鹽害指數(shù)差異達(dá)到最大。因此，選擇250 mmol/L作為鑒定微核心種質(zhì)的鹽脅迫濃度。

2.2 57份微核心種質(zhì)苗期耐鹽鑒定

57份微核心種質(zhì)苗期鹽害指數(shù)分布及耐鹽等級如圖2、3所示。

圖2 57份微核心種質(zhì)苗期鹽害指數(shù)分布Fig.2 Distribution of salt injury index of 57 micro-core germplasms at seedling stage

用250 mmol/L NaCl溶液對57份微核心種質(zhì)進(jìn)行苗期鹽脅迫處理，結(jié)果顯示，57份小麥微核心種質(zhì)的鹽害指數(shù)呈正態(tài)分布（圖2），表現(xiàn)為高感、敏感、中耐、耐鹽、高耐的種質(zhì)分別有5、21、24、6、1份，占比分別為8.8%、36.8%、42.1%、10.5%、1.8%（圖3），其中，評價等級為耐鹽及以上（SI＜40.00%）的有7份：帶芒紅麥、黃瓜先、半截芒、小偃6號、興義4號、Atlas 66、和尚麥。與此同時，小偃6號與耐鹽對照旱選10號鹽害指數(shù)一致，均為30.00%，且?guī)⒓t麥（14.24%）、黃瓜先（25.00%）和半截芒（28.89%）的耐鹽性明顯高于旱選10號，尤其是帶芒紅麥鹽害指數(shù)最小，評價等級為高耐（表2）。

圖3 57份微核心種質(zhì)苗期耐鹽等級及數(shù)目Fig.3 Salt tolerance grades and numbers of 57 microcore germplasms at seedling stage

表2 57份微核心種質(zhì)苗期耐鹽表型Tab.2 Salt tolerance phenotypes of 57 micro-core germplasms at seedling stage

2.3 分子標(biāo)記評價

利用74個耐鹽相關(guān)分子標(biāo)記擴(kuò)增57份微核心種質(zhì)，有24個標(biāo)記的等位變異數(shù)目＞2個，多態(tài)信息含量（Polymorphic Information Content，PIC）在0.28～0.47，多態(tài)性穩(wěn)定，因此，將其用于后續(xù)相關(guān)性研究。方差結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分子標(biāo)記Xcfd9在供試種質(zhì)中具有3種標(biāo)記型（圖4），其中，標(biāo)記型為a的種質(zhì)平均鹽害指數(shù)為49.59%，b型種質(zhì)平均鹽害指數(shù)為57.06%，c型種質(zhì)平均鹽害指數(shù)為64.76%，且每種標(biāo)記型對應(yīng)的苗期鹽害指數(shù)之間存在顯著差異（F＞F0.05，P=0.04），表明Xcfd9與供試種質(zhì)耐鹽性存在顯著相關(guān)（表3、4）。其余23個分子標(biāo)記與供試種質(zhì)耐鹽指數(shù)之間的相關(guān)性不顯著。

表3 Xcfd9在微核心種質(zhì)中的標(biāo)記型及鹽害指數(shù)Tab.3 Genotype and salt injury index of Xcfd9 in micro-core germplasm

圖4 Xcfd9標(biāo)記在部分微核心種質(zhì)中的標(biāo)記型Fig.4 Genotypes of Xcfd9 in parts of micro-core germplasms

表4 Xcfd9的3種標(biāo)記型對應(yīng)表型值方差分析Tab.4 Variance analysis of corresponding phenotypic values of genotypes of Xcfd9

3 結(jié)論與討論

耐鹽種質(zhì)篩選是小麥抗鹽育種工作的重要前提。目前小麥耐鹽鑒定主要采用形態(tài)指標(biāo)、生理指標(biāo)和產(chǎn)量指標(biāo)3種方法，其中，形態(tài)指標(biāo)主要指小麥葉片或根系受脅迫前后的各項(xiàng)參數(shù)的測定，因其操作簡便、適合室內(nèi)鑒定，被廣泛用于小麥抗逆性評價[17-18]。葉片鹽害指數(shù)法對小麥鹽脅迫評價較為成熟，曾有研究利用該方法從小麥耐鹽品種中確定了耐鹽位點(diǎn)，并分離了耐鹽基因TaSRO1[19-20]。因此，本研究對57份小麥微核心種質(zhì)3葉期幼苗進(jìn)行鹽脅迫，隨后根據(jù)葉片反應(yīng)型來計算鹽害指數(shù)，并以旱選10號作為耐鹽對照品種[21-22]，結(jié)果顯示，供試小偃6號（小麥生產(chǎn)中公認(rèn)的耐鹽品種）與旱選10號的鹽害指數(shù)一致（SI=30.00%），表明所用的評價體系準(zhǔn)確，鑒定結(jié)果可信。與此同時，從57份微核心種質(zhì)中鑒定出7份鹽害指數(shù)低于40.00%的耐鹽種質(zhì)，占比為12.3%，表明小麥種質(zhì)的整體耐鹽性不高，與前人研究結(jié)果一致[10]，其中有4份為農(nóng)家種（帶芒紅麥、黃瓜先、半截芒、和尚麥），2份為栽培種（小偃6號、興義4號），1份為引進(jìn)種（Atlas 66）。前人研究發(fā)現(xiàn)，從美國引進(jìn)的小麥Atlas 66具有發(fā)達(dá)的根系[23]，且對高鋁土壤具有很好的耐受性[24]；小偃6號是我國小麥栽培品種的骨干親本之一，可以通過降低地上部組織中Na含量來提高植株耐鹽性[25]；半截芒和和尚麥則分別對鎘和鉛表現(xiàn)出很好的耐受性[26]，但興義4號、帶芒紅麥和黃瓜先尚無與非生物脅迫相關(guān)的研究報道，尤其是帶芒紅麥鹽害指數(shù)僅為14.24%，后續(xù)將有可能成為創(chuàng)制小麥耐鹽材料和改良品種的重要材料。

同時，本研究用24個多態(tài)性標(biāo)記對57份供試微核心種質(zhì)進(jìn)行分子評價，重點(diǎn)關(guān)注了標(biāo)記型與種質(zhì)鹽害指數(shù)之間的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Xcfd9與供試種質(zhì)的苗期耐鹽性存在顯著相關(guān)（F＞F0.05，P=0.04），標(biāo)記型為a和b的種質(zhì)整體耐鹽性為中耐，而標(biāo)記型為c的種質(zhì)整體表現(xiàn)為鹽敏感。在中耐標(biāo)記型中，a型種質(zhì)（包括帶芒紅麥和小偃6號）表現(xiàn)出最低的平均鹽害指數(shù)（49.59%）；其次為b型種質(zhì)（包括黃瓜先、半截芒、和尚麥、興義4號和Atlas 66），平均鹽害指數(shù)為57.06%，表明Xcfd9附近存在1個耐鹽位點(diǎn)，該結(jié)果與LIU等[16]的研究結(jié)果一致：Xcfd9與小麥3D染色體上的芽期耐鹽相關(guān)位點(diǎn)QGT、QAA和QWURH連鎖。

綜上所述，本研究供試微核心種質(zhì)的耐鹽表型與Xcfd9的a或b標(biāo)記型連鎖，并且篩選出的7份耐鹽種質(zhì)均攜帶這個耐鹽位點(diǎn)，在利用這些種質(zhì)改良小麥品種過程中，可將Xcfd9用于標(biāo)記輔助選擇。